Summary
Chinasi Ripetere leucina Rich 2 è una chinasi multidominio grande, le cui mutazioni sono la causa genetica più comune della malattia di Parkinson. Analisi delle attività di questa proteina chinasi ha dimostrato di essere uno strumento fondamentale per comprendere la biologia e la disfunzione di questa proteina. In questo lavoro,
Abstract
Chinasi Ripetere leucina Rich 2 (LRRK2) è un aminoacido 2527 membro della famiglia ROCO di proteine, in possesso di una struttura complessa, multidominio tra cui un dominio GTPasi (chiamato ROC, per Ras di proteine complesse) e un dominio chinasi 1. La scoperta nel 2004 di mutazioni LRRK2 che causano la malattia di Parkinson (PD) ha portato ad LRRK2 essere al centro di un enorme volume di ricerca nella sua normale funzione e come la proteina va storto nello stato di malattia 2,3. Prime indagini nella funzione di LRRK2 concentrata sulla sua attività enzimatiche 4-6. Nonostante un quadro chiaro deve ancora emergere di una consistente alterazione di questi a causa di mutazioni, i dati di un certo numero di gruppi ha evidenziato l'importanza dell'attività della chinasi di LRRK2 nella morte cellulare legata a mutazioni 7,8. Recenti pubblicazioni hanno riportato inibitori intese a promuovere l'attività chinasica di LRRK2, fornendo uno strumento chiave sperimentale 9-11. Alla luce di questi dati,È probabile che le proprietà enzimatiche di LRRK2 ci offrono una finestra importante sulla biologia di questa proteina, anche se sono potenziali bersagli farmacologici per il Parkinson è aperta al dibattito.
Un certo numero di approcci diversi sono stati usati per il saggio di attività chinasica di LRRK2. Inizialmente, le analisi sono state effettuate utilizzando epitopo proteico tag sovra-espresso in linee cellulari di mammiferi e immunoprecipitato, con il test effettuato utilizzando questa proteina immobilizzato su perline agarosio 4,5,7. Successivamente, ricombinante purificata frammenti di LRRK2 in soluzione sono stati utilizzati anche, per esempio un frammento GST tag purificato da cellule di insetto contenenti residui 970-2527 di LRRK2 12. Recentemente, Daniels et al. Riferito l'isolamento di LRRK2 a figura intera in soluzione da cellule di rene embrionale, tuttavia questa proteina non è ampiamente disponibile 13. Al contrario, la fusione GST forma troncata di LRRK2 è commercialmente dispone (da Invitrogen, si veda la tabella 1 per i dettagli), e fornisce un comodo strumento per dimostrare un test per LRRK2 attività chinasi. Più uscite per LRRK2 attività chinasi sono stati segnalati. Autofosforilazione di LRRK2 stesso, la fosforilazione della proteina basica della mielina (MBP) come substrato generico chinasi e fosforilazione di un substrato artificiale - LRRKtide chiamato, sulla base fosforilazione della treonina 558 in Moesin - sono stati tutti utilizzati, così come una serie di putativi substrati fisiologici tra cui α-sinucleina, Moesin e 4-EBP 14-17. Lo stato di queste proteine come substrato per LRRK2 rimane poco chiaro, e come tale il protocollo descritto di seguito si concentrerà sull'utilizzo di MBP come substrato generico, sottolineando l'utilità di questo sistema di dosaggio LRRK2 attività chinasi diretto contro una vasta gamma di substrati potenziale.
Protocol
Sicurezza
Il protocollo descritto di seguito utilizza ATP marcato con 32 P radioattivo nella posizione fosfato γ di seguire l'attività chinasi di LRRK2. Si basa su protocolli standard utilizzati nel nostro laboratorio, e quindi con riguardo a molte delle fasi del processo come la corsa il gel, western blotting et cetera i materiali e le condizioni precise dovrebbero essere presi come riferimento, come le apparecchiature ei protocolli utilizzate per questi processi varia da laboratorio a laboratorio. Composti contenenti isotopi che emettono radiazioni ionizzanti sono potenzialmente dannose per la salute umana e di licenza stretto e regolamenti a un controllo di livello istituzionale e nazionale il loro uso. Gli esperimenti di questo protocollo sono stati effettuati a seguito di formazione in uso aperto fonte di radiazione presso l'University College di Londra e seguendo le linee guida di buona pratica di laboratorio fornite dai servizi di sicurezza presso il collegio (linee guida available a http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf ). L'uso di radiazioni open source non dovrebbe essere tentato prima a una formazione adeguata approvazione normativa. All'organismo di regolamentazione competente per le radiazioni open source nella ricerca di laboratorio varia da paese a paese. Esempi di queste sono: nel Regno Unito, la Health and Safety Executive ( http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm ), negli Stati Uniti, la Nuclear Regulatory Commission ( http:// www.nrc.gov / materiali / miagolio / regs-guide-comm.html ), in Canada, la Canadian Nuclear Safety Commission ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ), e in Germania Das Bundesamt für Strahlenschutz ( http : / / www.bfs.de / de / BFS ). Utenti di altri paesi dovrebbero confermare le regole locali, i regolamenti e le autorità di licenza con il loro agente di sicurezza dalle radiazioni. Precauzioni di sicurezza relative a questo protocollo sono stati notati nel testo, evidenziate con il simbolo del trifoglio radioattivo ( 
).
1. Preparare le reazioni chinasi
Tutte le miscele di reazione preparata in provette con 1,5 ml con tappo a vite contenente un O-ring per prevenire la diffusione di radioattività.
- Proteine disgelo su ghiaccio - LRRK2 wild-type, D1994A, G2019S.
- compongono reazione su ghiaccio - 10nm LRRK2, 0.5μg/μl MBP, 5UL di tampone chinasi 10x, costituito da 50μl con acqua.
2. Esecuzione del test
Tutte le fasi che utilizza 32 P ATP dovrebbe prendere ppizzo nelle aree designate radiazioni.
Adeguati dispositivi di protezione individuale devono essere indossato - in base alla procedura operativa standard nel nostro laboratorio questi includono camice, guanti e occhiali protettivi doppio.
Campioni contenenti 32 P ATP dovrebbe essere al riparo da 6 millimetri utenti schermi in perspex per minimizzare l'esposizione.
Se del caso, dispositivi di monitoraggio personali devono essere utilizzati - entro UCL, qualsiasi certificato aperto utente radiazioni di origine deve avere un badge pellicola di monitorare l'esposizione alle radiazioni durante gli esperimenti.
Tutte le superfici sperimentali dovrebbero essere valutati per la contaminazione radioattiva prima e dopo l'uso con un Geiger contatore.
Tutti i materiali di consumo potenzialmente contaminati devono essere smaltiti in stretta aderenza alle linee guida istituzionali per lo smaltimento dei rifiuti radioattivi.
- Prima di iniziare test, impostare blocchi di riscaldamento a 30 ° C e 100 ° C rispettivamente
- Rimuovere 32 P ATP dal freezer -20 (da notare che le condizioni di conservazione fro 32 P ATP possono variare a seconda fornitore o al tipo di radionucleotides utilizzato).
scansione al di fuori del contenitore prima dell'uso, scongelare dietro lo schermo in perspex. - Con reazioni sul ghiaccio, aggiungere 1ml di 32 P ATP per ogni insieme con 10μM di freddo ATP.
- Mescolare bene con la pipetta. Centrifuga impulso di portare liquidi a fondo della provetta, riducendo al minimo il rischio di contaminazione.
- Rimuovere 15μl aliquota per tempo un punto zerod interrompere la reazione di aliquota con l'aggiunta di 5μl di 4x tampone campione SDS e denaturazione a 100 ° C per 10 minuti. Centrifuga impulso di portare liquidi a fondo della provetta, riducendo al minimo il rischio di contaminazione.
- Campione rimanente posto nel blocco di riscaldamento e incubato a 30 ° C per 60 minuti.
- 15μl rimosso punto a 60 minuti e tempo di reazione terminata con l'aggiunta di 5μl di 4x tampone campione SDS e denaturazione a 100 ° C per 10 minuti. Centrifuga impulso di portare liquidi a fondo della provetta, riducendo al minimo il rischio di contaminazione.
3. Immunoblotting i campioni e analisi dei risultati
- I campioni eseguiti su SDS-PAGE
- 10 e 4-12% Bis-tris gel per l'elettroforesi polyacrilamide preparato utilizzando tampone MOPS esecuzione.
- 20μl di ciascun campione caricati su gel insieme 7μl di diesismantenere scala delle proteine standard.
- Gel funzionare a 160V per 90 minuti, o fino a fronte del colorante ha raggiunto la fine del gel. Tutto il liquido a contatto con radioisotopi devono essere trattati come rifiuti radioattivi e smaltiti secondo le linee guida istituzionali. Regolamenti UCL affermare che i rifiuti liquidi radioattivi deve essere eliminata versando giù designato affonda disposizione radioattivo con acqua abbondante.
- Proteine di membrana PVDF trasferiti tramite Western Blot.
- Buffer di trasferimento preparato, 1x Tris Glicina più il 20% di metanolo. PVDF membrana e carta da filtro tagliata a dimensioni corrette per il gel e attivato con metanolo glaciale nel caso della membrana o pre-umido con buffer di trasferimento nel caso della carta da filtro. La membrana deve essere pre-etichettati con inchiostro a sfera per consentire l'identificazione di orientamento. Gel rimosso dal plastic involucro e acrilamide in eccesso rimossi e smaltiti come rifiuti radioattivi.
- Il gel deve essere formato in un panino con la membrana e carta da filtro, assicurando che non bolle esistono tra la membrana e il gel, e poi disposte in dell'apparato Western Blot con la membrana tra il gel e l'anodo.
- Trasferimento effettuato a 25V per 16 ore.
- Buffer di trasferimento preparato, 1x Tris Glicina più il 20% di metanolo. PVDF membrana e carta da filtro tagliata a dimensioni corrette per il gel e attivato con metanolo glaciale nel caso della membrana o pre-umido con buffer di trasferimento nel caso della carta da filtro. La membrana deve essere pre-etichettati con inchiostro a sfera per consentire l'identificazione di orientamento.
- In seguito al trasferimento di PVDF proteine, la membrana deve essere essiccata a temperatura ambiente. Infine, la membrana a secco dovrebbe essere isolato tra fogli di acetato di cellulosa e esposti a uno schermo al fosforo o pellicola di raggi X per permettere il rilevamento di proteine radiomarcato. Tempo di esposizione può essere eseguito da diverse ore a più di una settimana a seconda della specifica attività del radioisotopo utilizzato e la cinetica enzimatica della reazione.
- Phosphoscreen scansione / pellicola sviluppata. Se si utilizza uno schermo al fosforo, l'immagine deve essere salvato come ad alta risoluzione TIFF o file bitmap, se si utilizza pellicola poi la risultante transparency sottoporre a scansione utilizzando uno scanner desktop e salvate come TIFF ad alta risoluzione o file bitmap. L'immagine può quindi essere analizzato in ImageJ, un programma freeware disponibile sul sito web del National Institutes of Health ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ).
4. Rappresentante Risultati
La figura 1 mostra i risultati di rappresentanza per un test effettuato con wild-type, G2019S e LRRK2 D1994A con proteina basica della mielina come substrato generico accettore di fosfato. Autofosforilazione di LRRK2 è visibile a ≈ 200kDa, con bande multiple rappresentano MBP fosforilata visibile dal 20-40kDa. Si noti l'assenza di autofosforilazione nella (chinasi morti) corsia D1994A, e una maggiore fosforilazione a causa della mutazione G2019S. Nota fosforilazione anche residua del MBP nella corsia chinasi morti. Ciò può essere dovuto ad ablazione incompleta dell'attività chinasi di LRRK2 dal mutante D1994A o riflettere la presenza of traccia contaminanti chinasi nella reazione.
Figura 1.
Discussion
Questo documento descrive un protocollo di base per saggiare l'attività chinasi di LRRK2 utilizzando un sistema in vitro. Per motivi di brevità, questo è stato limitato ad una durata di un'ora modello punto di arrivo utilizzando un substrato generico, ma il protocollo generale è applicabile a una vasta gamma di substrati potenziale e suscettibili di analisi più sofisticate esaminando la cinetica dell'attività chinasi di LRRK2 . Questo evidenzia uno dei vantaggi principali dell'utilizzo di un sistema in vitro per esaminare il comportamento di una proteina chinasi come questa: perché c'è il controllo completo sulle concentrazioni di enzima e substrato, è possibile generare dati cinetici e calcolare K m e V valori massimi per la reazione. Per le valutazioni cinetiche più dettagliate o per valutare l'impatto degli inibitori putativo, un sistema di throughput più elevato (come ad esempio quello offerto dalla utilizzando il substrato LRRKtide, disponibile da Invitrogen) è un superiore alternative per l'approccio descritto qui.
E 'importante, tuttavia, riconoscere che il sistema modello riduzionista fornite da test in vitro chinasi è solo uno strumento per esaminare la biologia di una chinasi e dei suoi rapporti con i substrati potenziale. I dati di test come questo deve essere usato in combinazione con altri approcci per ottenere un quadro completo di come si comporta una chinasi in vitro e in un contesto cellulare. Per esempio, un substrato putativo fosforilato in vitro possono essere analizzati mediante spettrometria di massa per identificare phosphosites possibili che possono poi essere manipolati da mutagenesi mirata (ad es. Serina la conversione o la treonina residui accettore di fosfato a nessuno-phosphorylatable residui come l'alanina) per esaminare il funzionale conseguenze di fosforilazione ex vivo.
Una considerazione chiave per interpretare i dati da un sistema di analisi in vitro come questo sarebbe il rischio di either tipo I o tipo II (falsi positivi o falsi negativi) errori. La natura riduzionista di questo sistema dispone purtroppo di entrambi - nel caso della prima, avendo un substrato purificato putativo e purificata chinasi artificialmente nelle immediate vicinanze e ad alta concentrazione (rispetto al milieu cellulare) può causare eventi fosforilazione artefatti. Al contrario, molte chinasi funzionare come parte di un complesso all'interno del contesto della cellula, e richiedono co-fattori per la fosforilazione di un substrato dato che si verifichi. Come notato sopra, un risultato positivo da fosforilazione di un substrato putativo utilizzando un sistema di dosaggio in vitro dovrebbe poi essere testato in un sistema cellulare per convalidare il risultato, e un risultato negativo devono essere interpretati con cautela.
Alla luce di questo, è fondamentale dove è possibile avere controlli sia positivi che negativi per consentire uno studio comparativo delle attività della vostra chinasi di interesse. L'attenta selezione di un Contro positivol che ha un'attività conosciuta verso la vostra proteina di interesse, insieme a un controllo negativo che è improbabile che fosforilare il tuo substrato putativo, è estremamente prezioso. Un controllo candidato LRRK2 è Receptor interagire chinasi 3, che ha una sequenza strettamente legata primario al dominio della chinasi di LRRK2, ma ha una struttura molto diversa dominio totale 18. Questo è disponibile come proteina ricombinante da Invitrogen e viene utilizzato come controllo standard nel nostro laboratorio.
Va inoltre notato che la forma commercialmente disponibile di LRRK2 manca l'N-terminale della proteina ed è etichettato con il glutatione-s-transferasi, e questo dovrebbe essere preso in considerazione come potenziale fattore di confondimento nello svolgimento di test con questa proteina chinasi, come non si sa quale ruolo l'N-terminale di LRRK2 può giocare nella funzione normale di questa proteina. Se, per esempio, la porzione N-terminale di LRRK2, che è assente nella proteina utilizzata nel presente protocolloè fondamentale per l'assunzione di un substrato specifico per il dominio della chinasi di LRRK2 allora questo avrà un impatto importante sulla fosforilazione osservato di tale substrato nel sistema in vitro sopra descritto.
Anche con queste riserve, tuttavia, l'importanza attribuita alla biologia di LRRK2 nella ricerca di Parkinson mette in evidenza l'utilità di questo protocollo come uno strumento prezioso per indagare il comportamento di questa proteina in un ambiente in vitro.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
L'autore è un Parkinson UK Research Fellow (borsa F1002). Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla fiducia / MRC chiamata Wellcome comune in premio Neurodegenerazione (WT089698) al Consorzio Malattia di Parkinson Regno Unito (UKPDC) i cui membri sono presso l'Istituto UCL di Neurologia, Università di Sheffield e l'unità Proteine MRC fosforilazione a l'Università di Dundee.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LRRK2 wild type | Invitrogen | PV4873 | |
| LRRK2 G2019S | Invitrogen | PV4881 | |
| LRRK2 D1994A | Invitrogen | PV6051 | |
| Kinase buffer | Cell Signaling Technology | 9802S | |
| MBP | Sigma-Aldrich | M1891 | |
| 32P g ATP | PerkinElmer, Inc. | BLU002X500UC | 500μCi, 30Ci /mMole |
| 4x LDS sample buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| 2-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Protein standards | Invitrogen | LC5800 | |
| MOPS running buffer | Invitrogen | NP0001 | |
| Bis-tris acrylamide gel | Invitrogen | NP0321 | 4-12% 1mm 10well |
| PVDF membrane | EMD Millipore | IPVH00010 | |
| Transfer buffer | Invitrogen | NP0006 | |
| Table 1. Reagents | |||
| Distilled and de-ionized water was used for all dilution steps | |||
| Geiger counter | Mini Instruments | ||
| SDS PAGE tank | Invitrogen | ||
| Transfer tank | Invitrogen | ||
| Heat blocks (2) | Eppendorf | ||
| Phosphor screen | GE Healthcare | X-ray film can be substituted | |
| Phosphor imager | GE Healthcare | ||
| Exposure cassette | GE Healthcare | ||
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Perspex shielding | |||
| 1.5ml tubes | VWR international | Screw top with O ring | |
| Table 2. Equipment | |||
References
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