Summary
Лейцин Богатые киназы Повторите 2 является большой киназы многодоменных, мутации в которых наиболее распространенных генетических причин болезни Паркинсона. Анализ активности киназы этого белка оказалась важнейшим инструментом в понимании биологии и дисфункции этого белка. В данной работе
Protocol
Безопасность
Протокол, описанный ниже, используется АТФ, меченных радиоактивными 32 P в позицию γ фосфат следовать киназы деятельности LRRK2. Она основана на стандартных протоколов, используемых в нашей лаборатории, и поэтому в отношении многих из шагов в этом процессе такие как бег гели, западной промокательной и т.д. материалов и точные условия должны быть приняты в качестве руководства в качестве оборудования и протоколов используемые для этих процессов зависит от лаборатории к лаборатории. Соединения, содержащие изотопы, которые испускают ионизирующее излучение, потенциально вредных для здоровья человека и строгого лицензирования и правил на институциональном и национальном уровне контролировать их использование. Эксперименты в этом протоколе были проведены следующие обучение в открытое использование источника излучения в Университетском колледже Лондона и после надлежащей лабораторной практики указаниями безопасности услуг в колледже (руководства лавинilable на http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf ). Использование открытых источников излучения не должно быть предпринято до соответствующей подготовки и утверждения регулирующими органами. Регулирующий орган ответственный за открытое источника излучения в научно-исследовательской лаборатории варьируется от страны к стране. Примерами этого являются: в Великобритании, здравоохранения и безопасности ( http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm ), в США Комиссия по ядерному регулированию ( http:// www.nrc.gov / материалы / MIAU / Новых-гидов-comm.html ), в Канаде, канадская Комиссия по ядерной безопасности ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ), а в Германии Das Bundesamt für Strahlenschutz ( HTTP : / / www.bfs.de / де / BFS ). Пользователи в других странах, должны подтвердить местные нормы, правила и лицензирующих органов с их офицер радиационной безопасности. Меры безопасности, имеющие отношение к этому протоколу были отмечены в тексте, выделены радиоактивные символ трилистника ( 
).
1. Подготовка киназы реакция
Все реакционные смеси, подготовленный в 1,5 мл трубы образца с винтовыми колпачками, содержащих уплотнительное кольцо для предотвращения распространения радиоактивности.
- Оттепель белка на льду - LRRK2 дикого типа, D1994A, G2019S.
- составляют реакция на льду - 10 нм LRRK2, 0.5μg/μl MBP, 5ul 10х буфера киназы, доливают до 50 мкл с водой.
2. Запуск анализа
Все шаги, используя 32 P СПС, следует взять ркружева в специально отведенных зонах излучения.
Подходящие средства индивидуальной защиты должны носить - под стандартной операционной процедурой в нашей лаборатории, к ним относятся лабораторный халат, двойные перчатки и защитные очки.
Образцы, содержащие 32 P АТФ должны быть защищены от пользователей, 6мм экранах Perspex сведения к минимуму воздействия.
В случае необходимости, индивидуальные средства для мониторинга должны быть использованы - в UCL, любой сертифицированной открытой пользователем источник излучения должен иметь фильма значок для контроля радиационного облучения в ходе экспериментов.
Все экспериментальные поверхности должны быть оценены на предмет радиоактивного загрязнения до и после использования использованием Гейгер счетчика.
Все потенциально загрязненных расходных материалов должны быть утилизированы в строгом соответствии с руководящими принципами институциональной для захоронения радиоактивных отходов.
- Перед началом теста, набор блоков для отопления 30 ° C и 100 ° С соответственно
- Удалить 32 P ATP от -20 морозильник (заметим, что условия хранения сюда 32 P СПС может варьироваться в зависимости от поставщика или тип radionucleotides используется).
сканирования за пределами контейнера перед использованием, оттепель за экраном плексиглас. - При реакции на льду, добавить 1 мкл 32 Р АТФ каждому наряду с 10 мкм холодной АТФ.
- Хорошо перемешайте с пипеткой. Импульсный центрифуги довести жидкость до нижней части трубки, сводя к минимуму риск заражения.
- Удалить 15μl аликвоту для нулевой момент времениг прекращает реакцию в аликвоту добавлением 5 мкл 4х образец SDS буфера и денатурации при 100 ° С в течение 10 минут. Импульсный центрифуги довести жидкость до нижней части трубки, сводя к минимуму риск заражения.
- Оставшиеся образец, помещенный в нагревательный блок и инкубировали при 30 ° С в течение 60 минут.
- 15μl удален на 60 минуте точку времени и реакция прекращается добавлением 5 мкл 4х образец SDS буфера и денатурации при 100 ° С в течение 10 минут. Импульсный центрифуги довести жидкость до нижней части трубки, сводя к минимуму риск заражения.
3. Иммуноблоттинг образцов и анализ результатов
- Образцы работать на SDS-PAGE
- 10 и 4-12% Bis-трис polyacrilamide геля, приготовленного для электрофореза использованием MOPS работает буфера.
- 20 мкл каждого образца загружены на гель вместе с 7μl острыхTain белка стандартные лестницы.
- Гель работает на 160В в течение 90 минут, или пока красителя перед достиг конца геля. Все жидкости в контакте с радиоизотопы должны рассматриваться как радиоактивные отходы и утилизировать в соответствии с ведомственным руководящим принципам. UCL правила диктуют, что жидкие радиоактивные отходы должны быть отброшены льется назначенный радиоактивных раковины распоряжении с обильной водой.
- Белки передаются на мембрану PVDF через пятно западной.
- Передача буфера подготовлены, 1x Трис глицин плюс 20% метанола. PVDF мембранные и фильтровальной бумаги вырезать до правильного размера для геля и активированный с ледниковыми метанола в случае мембранной или предварительно мокрые от перевода буфера в случае фильтровальную бумагу. Мембрана должна быть предварительно помечен чернилами шариковой чтобы позволить идентификацию ориентации. Гель удален из пластКорпус микросхемы и избыток акриламида удалить и утилизировать как радиоактивные отходы.
- Гель должен быть сформирован в бутерброд с мембраной и фильтровальную бумагу, чтобы не было пузырей существуют между мембраной и гель, а затем, расположенных в западной аппарата пятно с мембраной между гелем и анодом.
- Передача осуществляется на 25В в течение 16 часов.
- Передача буфера подготовлены, 1x Трис глицин плюс 20% метанола. PVDF мембранные и фильтровальной бумаги вырезать до правильного размера для геля и активированный с ледниковыми метанола в случае мембранной или предварительно мокрые от перевода буфера в случае фильтровальную бумагу. Мембрана должна быть предварительно помечен чернилами шариковой чтобы позволить идентификацию ориентации.
- После белка-переносчика к PVDF, мембрана должна быть сушат при комнатной температуре. Наконец, сухой мембраны должны быть изолированы между листами ацетата целлюлозы и подвергают либо люминесцентном экране или рентгеновской пленки, чтобы обнаружить меченого белка. Выдержка может работать от нескольких часов до более чем неделю в зависимости от удельной активности радиоизотопного используются и фермент кинетики реакции.
- Phosphoscreen отсканированных / пленка обрабатывается. При использовании экрана фосфор, изображения должны быть сохранены в высоком разрешении TIFF или растровый файл, если используется пленка то результирующая переходыsparency должны быть отсканированы с помощью настольного сканера и сохранены в высоком разрешении TIFF или растровый файл. Образ может быть проанализирована в ImageJ, бесплатная программа доступна на Национальных Институтов Здоровья веб-сайт ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ).
4. Представитель Результаты
На рисунке 1 показаны репрезентативные результаты для анализа осуществляется с помощью дикого типа, G2019S и D1994A LRRK2 с основному белку миелина как общий субстрат акцептора фосфата. Аутофосфорилирование LRRK2 виден ≈ 200kDa, с несколькими полосами представляющих фосфорилированных MBP видно 20-40kDa. Обратите внимание на отсутствие в аутофосфорилирование D1994A (киназы мертвых) полосу, и повышение фосфорилирования из-за мутации G2019S. Отметим также, остаточная фосфорилирование MBP в киназы мертвой полосе. Это может быть из-за неполной аблации киназы деятельности LRRK2 по D1994A мутант или отражать присутствие ое следов загрязнения киназ в реакции.
Рисунок 1.
Discussion
Эта статья описывает основные протокол для опробования киназы деятельности LRRK2 использования в системе пробирке. В интересах краткости, это была ограничена один час конечная точка шаблона с помощью универсального субстрата, но общий протокол применяется к кругу потенциальных субстратов и поддаются более сложный анализ изучения кинетики активности киназы LRRK2 . Это подчеркивает одно из ключевых преимуществ использования системы в пробирке для изучения поведения киназы белка, такие как это: потому что есть полный контроль над концентрации фермента и субстрата, можно генерировать кинетических данных и рассчитать К м и макс значения для реакции. Для получения более подробной кинетической оценки или оценки воздействия предполагаемого ингибиторы, более высокая пропускная способность системы (например, той, которая обеспечивается использованием LRRKtide подложку, которую можно получить Invitrogen) является превосходным alternatiве с подходом, описанным здесь.
Важно, однако, признать, что система редукционистской модели, предоставляемой в анализах пробирке киназы является лишь одним из инструментов для изучения биологии киназы и его отношения с потенциальными субстратов. Данные анализов, таких как это должно быть использован в сочетании с другими подходами, чтобы получить полную картину того, как ведет себя киназы в пробирке и в сотовой связи. Например, предполагаемый субстрат фосфорилированных в пробирке могут быть проанализированы масс-спектрометрии для выявления возможных phosphosites, которые затем можно манипулировать направленного мутагенеза (например,. Превращение серина или треонина акцептор фосфата остатки никому-phosphorylatable отходы, такие как аланин) для изучения функционального Последствия фосфорилирования естественных отл.
Ключевым моментом в интерпретации данных в пробирке анализ системы, такие как это вероятность eitheГ типа я или типа II (ложный положительный или ложно отрицательные) ошибок. Редукционистской характер этой системы, к сожалению располагает его к обеим - в случае с бывшей, с очищенной предполагаемый субстрат и очищенный киназы в искусственно непосредственной близости и в высокой концентрации (по сравнению с сотовой среды) может привести к артефактного событий фосфорилирования. И наоборот, многие киназы функционируют как часть комплекса в контексте клетки, и требуют кофакторами для фосфорилирования данного субстрата, чтобы произойти. Как отмечалось выше, положительный результат от фосфорилирования предполагаемого подложку с использованием в системе анализа пробирке должна быть протестирована в системе сотовой для проверки результата, а отрицательный результат следует интерпретировать с осторожностью.
В свете этого, очень важно, где можно иметь как положительные, так и отрицательные элементы управления для сравнительного исследования активности киназы ваш интерес. Тщательный отбор положительных противоречивыел, которая известна активность по отношению к вашей белок, наряду с отрицательным контролем, который вряд ли фосфорилировать ваш предполагаемый субстрат, имеют большую ценность. Один из кандидатов управления LRRK2 является Рецептор взаимодействует киназы 3, которая тесно связана с первичной последовательности киназы области LRRK2 но очень разные общей доменной структуры 18. Эта функция доступна в качестве рекомбинантного белка из Invitrogen и используется в качестве стандартного элемента управления в нашей лаборатории.
Следует также отметить, что коммерчески доступные формы LRRK2 не хватает N-конец белка и помечается глутатион-S-трансферазы, и это должно приниматься во внимание как потенциальных вмешивающихся факторов при проведении анализов киназы с этим белком, как это не известно, какую роль N-терминал LRRK2 могут играть в нормальной функции этого белка. Если, например, N-концевой части LRRK2, которая отсутствует в белке, используемые в настоящем протоколеимеет решающее значение для вербовки специфическим субстратом для киназы области LRRK2 то это будет иметь большое влияние на наблюдаемые фосфорилирование сказал субстрата в пробирке в системе, описанной выше.
Даже с этими оговорками, однако, значение, которое придается биологии LRRK2 в исследования Паркинсона подчеркивает полезность этого протокола, как ценный инструмент для изучения поведения этого белка в пробирке в определении.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Автор Паркинсона Великобритании научный сотрудник (грант F1002). Эта работа была выполнена при частичной поддержке Велком Траст / MRC Совместный призыв в нейродегенерации награду (WT089698), чтобы болезнь Консорциум Великобритании Паркинсона (UKPDC), члены которого из UCL институт неврологии, Университета Шеффилда и Фосфорилирование MRC белка подразделение в Университет Данди.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LRRK2 wild type | Invitrogen | PV4873 | |
| LRRK2 G2019S | Invitrogen | PV4881 | |
| LRRK2 D1994A | Invitrogen | PV6051 | |
| Kinase buffer | Cell Signaling Technology | 9802S | |
| MBP | Sigma-Aldrich | M1891 | |
| 32P g ATP | PerkinElmer, Inc. | BLU002X500UC | 500μCi, 30Ci /mMole |
| 4x LDS sample buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| 2-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Protein standards | Invitrogen | LC5800 | |
| MOPS running buffer | Invitrogen | NP0001 | |
| Bis-tris acrylamide gel | Invitrogen | NP0321 | 4-12% 1mm 10well |
| PVDF membrane | EMD Millipore | IPVH00010 | |
| Transfer buffer | Invitrogen | NP0006 | |
| Table 1. Reagents | |||
| Distilled and de-ionized water was used for all dilution steps | |||
| Geiger counter | Mini Instruments | ||
| SDS PAGE tank | Invitrogen | ||
| Transfer tank | Invitrogen | ||
| Heat blocks (2) | Eppendorf | ||
| Phosphor screen | GE Healthcare | X-ray film can be substituted | |
| Phosphor imager | GE Healthcare | ||
| Exposure cassette | GE Healthcare | ||
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Perspex shielding | |||
| 1.5ml tubes | VWR international | Screw top with O ring | |
| Table 2. Equipment | |||
References
- Lewis, P. A. The function of ROCO proteins in health and disease. Biol. Cell. 101, 183-191 (2009).
- Paisan-Ruiz, C. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44, 595-600 (2004).
- Zimprich, A. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44, 601-607 (2004).
- West, A. B. Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 16842-16847 (2005).
- Gloeckner, C. J. The Parkinson disease causing LRRK2 mutation I2020T is associated with increased kinase activity. Hum. Mol. Genet. 15, 223-232 (2006).
- Lewis, P. A. The R1441C mutation of LRRK2 disrupts GTP hydrolysis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 668-671 (2007).
- Greggio, E. Kinase activity is required for the toxic effects of mutant LRRK2/dardarin. Neurobiol. Dis. 23, 329-341 (2006).
- Smith, W. W. Kinase activity of mutant LRRK2 mediates neuronal toxicity. Nat. Neurosci. 9, 1231-1233 (2006).
- Deng, X. Characterization of a selective inhibitor of the Parkinson's disease kinase LRRK2. Nat. Chem. Biol. 7, 203-205 (2011).
- Lee, B. D. Inhibitors of leucine-rich repeat kinase-2 protect against models of Parkinson's disease. Nat. Med. 16, 998-1000 (2010).
- Nichols, R. J. Substrate specificity and inhibitors of LRRK2, a protein kinase mutated in Parkinson's disease. The Biochemical Journal. 424, 47-60 (2009).
- Anand, V. S. Investigation of leucine-rich repeat kinase 2: enzymological properties and novel assays. FEBS. J. 276, 466-478 (2009).
- Daniels, V. Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant. Journal of Neurochemistry. 116, 304-315 (2011).
- Jaleel, M. LRRK2 phosphorylates moesin at Thr558; characterisation of how Parkinson's disease mutants affect kinase activity. Biochem. J. , (2007).
- Qing, H., Wong, W., McGeer, E. G., McGeer, P. L. Lrrk2 phosphorylates alpha synuclein at serine 129: Parkinson disease implications. Biochem. Biophys. Res. Commun. 387, 149-152 (2009).
- Imai, Y. Phosphorylation of 4E-BP by LRRK2 affects the maintenance of dopaminergic neurons in Drosophila. Embo. J. 27, 2432-2443 (2008).
- Greggio, E. The Parkinson disease-associated leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) is a dimer that undergoes intramolecular autophosphorylation. J. Biol. Chem. 283, 16906-16914 (2008).
- Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science. 298, 1912-1934 (2002).
