Summary
Dit is een protocol om actief volle lengte Kinesine isoleren van
Abstract
Motor eiwitten bewegen ladingen langs microtubuli, en vervoeren ze naar specifieke sub-cellulaire locaties. Omdat de gewijzigde vervoer wordt voorgesteld om een verscheidenheid van neurodegeneratieve ziekten ten grondslag liggen, het begrijpen van microtubuli gebaseerd gemotoriseerd transport en de verordening zal waarschijnlijk uiteindelijk leiden tot een betere therapeutische benaderingen. Kinesine-1 is een eukaryote motor eiwit dat beweegt in een anterograde (plus-end) richting langs microtubuli (MT), aangedreven door ATP hydrolyse. Hier hebben we verslag een gedetailleerde zuivering protocol om actief volle lengte kinesine isoleren van Drosophila embryo's, waardoor de combinatie van Drosophila genetica met single-molecule biofysische studies. Te beginnen met ongeveer 50 kopjes leggen, met ongeveer 1000 vrouwen per kopje, voerden we 's nachts collecties. Dit leverde ongeveer 10 ml verpakte embryo's. De embryo's werden bleekmiddel dechorionated (hetgeen ongeveer 9 gram embryo) en gehomogeniseerd. After verstoring is het homogenaat verduidelijkt met een lage snelheid rotatie gevolgd door een snelle centrifugeren. De geklaarde supernatant werd behandeld met GTP en taxol aan de MT polymeriseren. Kinesine geïmmobiliseerd op gepolymeriseerde MT door de toevoeging ATP analoge 5'-adenylaat imidodiphosphate bij kamertemperatuur. Na kinesine bindend, werden microtubuli gesedimenteerd via hoge snelheid centrifugeren door een sucrose kussen. De microtubuli pellet werd vervolgens opnieuw opgeschort, en dit proces werd herhaald. Tot slot is ATP toegevoegd aan de kinesine los te maken van het MT. Hoge snelheid centrifugeren dan afgedraaid de MTS, waardoor de kinesine in het supernatant. Deze kinesine werd onderworpen aan een centrifugaal filter met 100 KD afgesneden filter voor verdere zuivering, in hoeveelheden verdeeld, snap bevroren in vloeibare stikstof en bij -80 ° C. SDS gelelektroforese en Western blotting werd uitgevoerd met het gezuiverde monster. De motorische activiteit van gezuiverde monsters vóór en na de laatste filtratiestap centrifugalewerd geëvalueerd met behulp van een in vitro enkel molecuul microtubule assay. De kinesine fracties vóór en na de centrifugale filtratie heeft processivity zoals eerder in de literatuur. Verdere experimenten worden gedaan om de interactie tussen kinesine en andere transportmiddelen verwante eiwitten te evalueren.
Protocol
Stammen van vliegen kan worden gekocht en versterkt in het lab. Afhankelijk van de hoeveelheid van Drosophila cultuur flacons ontvangen, dient men regelmatig 'flip' de cultuur flacons, zodra de flesjes heeft een maximale capaciteit bereikt. De versterking gaat door tot ongeveer 50 Drosophila cultuur flacons worden gevuld. Men maakt dan 'vliegen cups' met 100 ml tricorn bekers (Fly cup maken wordt besproken in de volgende paragraaf). Na 24 uur gebruik maken van embryo's van deze bekers om zaad nieuwe Drosophila cultuur flacons met aangebracht vlieg voedsel op de bodem. Bij kamertemperatuur is de groei tijd voor Drosophila embryo's uit 's nachts' s naar volwassen vliegen zijn ongeveer 8,5 dagen. Geplaatste embryo's komen na 12-15 uur in de eerste larvenstadium. De larven groeien ongeveer 4 dagen rui tweemaal de tweede en derde larvenstadium, 24 en 48 uur na het uitkomen. De larven vervolgens in te kapselen in pupariums en te onderwerpen aan een vier dagen metamorfose tot die uit terfgenaam popstadium gevallen 1. Zorg voor meer groei voor ongeveer twee tot drie dagen in de Drosophila cultuur flesjes om de hoeveelheid vliegen te verhogen in elk. Bij 400 flacons zijn gevuld, zal een voldoende hoeveelheid vliegen er voor vijftig eieren te leggen cups (Ongeveer 1.000 vrouwelijke vliegen per kopje). Vliegen hebben tijd nodig om te wennen aan hun nieuwe omgeving. Het duurt meestal ongeveer twee dagen voor ze klaar te zijn voor de inzameling, na overschrijving op de beker. Het vervangen van agarplaten dagelijks zorgt ervoor dat de vlieg kopjes schoon, waardoor vliegen om langer te leven. (Voor een beter begrip van Drosophila zorg en versterking, verwijzen wij u naar DB Roberts 'Drosophila: een praktische benadering 2).
Een goede bron grote hoeveelheden Drosophila embryo's te verkrijgen zijn populatie kooien 3, die in de handel verkrijgbaar. De montage en onderhoud van de bevolking kooien zijn te zien op hoofdstuk 5 en 7 in het boek Drosophila melanogaster: PRAKTISCHE Gebruik in de Cel-en Moleculaire Biologie 4. Echter, populatie kooien zijn duur en moeilijk te handhaven. Aangezien populatie kooien bezit een overvloedige hoeveelheid vliegen, het gebruik van kooldioxide noodzakelijk voor de overdracht en voeden vliegen. Zoals eerder vermeld, kooldioxide vermindert de gezondheid van de vliegen, waardoor ze niet zo goed te leggen. Op kleine schaal, kan 100 ml tricorn bekers worden gebruikt. Met vijftig 100 ml bekers, kan 9 gram dechorionated embryo's worden bereikt. Met het oog verwijderen van de dode vliegen, niet-gebruikte gist pasta en andere onzuiverheden hebben we een dubbele laag zeef catcher met verschillende maaswijdten. Een zeef vallen ongewenste materialen zoals dode vliegen terwijl embryo's door te laten (350 micron poriegrootte). Het tweede deel bevat een mesh (120 micron poriegrootte), dat bedoeld is om Drosophila embryo's en andere onzuiverheden vangen zal door de mazen.
1. Fly Cup Voorbereiding en embryo
- Flipde versterkte vliegen vanuit meerdere flesjes in een lege plastic flacon, totdat het bedrag van vliegen hebben bereikt een centimeter van de hoogte van de flacon's. Dan, over te dragen die vliegen in een 100 ml ei collectie cup (Tricon beker met nylon mazen). Blijf tikken op de beker op een harde ondergrond om het ontsnappen van vliegen te voorkomen dat bij het overbrengen van vliegen. Bedek beker met agar plaat met gist deeg en laat 24-48 uur van stabilisatie tijd.
- Verzamel 's nachts agarplaten van vijftig vliegen kopjes en was de inhoud van de platen om de zeef catcher met een schone penseel en stromend water. Flesh de embryo's in de zeef met veel water totdat alle gist pasta wordt weggespoeld.
- Dechorionate de gereinigde embryo's onder te dompelen in 50% bleekmiddel gedurende 3 minuten.
- Uitgebreid spoelen met gedistilleerd water tot embryo's los het bleekmiddel geur. Droog dan de mesh met embryo's door het op ac vouw handdoek meerdere keren. Breng de embryo's om een schone flacon en registreer het gewicht. </ Li>
2. Embryo homogenisering en Verduidelijking
- Plaats dechorionated embryo's in Dounce homogenisator met 1,5 x het volume van ijs-koude extractie buffer.
- Doe 5 slagen met de losse stamper. Aliquot het homogene mengsel in schone centrifugebuis. Centrifugeer bij 15.000 g gedurende 40 minuten. bij 4 ° C.
- Zorgvuldig verzamelen heldere bovenstaande vloeistof zonder de bovenste witte lipide laag of de lagere pellet.
- Overdracht supernatant centrifugebuizen reinigen en bij 50.000 g gecentrifugeerd gedurende 30 minuten. bij 4 ° C
- De resulterende supernatant snelle verzameld zoals hierboven kan direct worden gebruikt of kunnen breken ingevroren bij -80 ° C gedurende maanden.
3. Microtubuluspolymerisatie en Kinesine Binding
- Ontdooi de bevroren snelle supernatant tot kamertemperatuur. Om microtubules polymeriseren toevoegen GTP (0,3 mM) en taxol (20 uM) en schud voorzichtig bij kamertemperatuur gedurende 20 min ineen roterende schudder.
- Om kinesine binden toevoegen 2,5 mM ATP nonhydrolyzable analoge 5'-adenylaat imidodiphosphate (AMPPNP), gevolgd door 10 minuten roeren bij kamertemperatuur in een roterende schudder.
4. Differentiële sedimentatie van microtubuli en Kinesine
- Sediment door een gelijk volume sucrose kussen (20% sucrose en 10 uM taxol in extractiebuffer) door centrifugeren bij 23.000 g (sw41ti rotor TLS-55) gedurende 30 minuten. bij 4 ° C.
- Was de pellet door hersuspensie in 10% van het oorspronkelijke volume homogenaat extractiebuffer met 10 uM taxol en 75 mM NaCl.
- Herhaal sedimentatie met een gelijk volume sucrose kussen als in stap 4.1.
- Opnieuw te schorten pellet van zout was in 5% extractiebuffer met 20 uM taxol, 75 mM NaCl, 10 mM MgSO 4, en 10 mM ATP.
- Sediment op 120.000 g (sw41ti rotor: 31.000 rpm, TLS-55: 42.000 rpm) gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Verzamel supernatant (kinesinefractie).
- Voer een centrifugale filtratie bij 14.000 g gedurende 15 minuten bij 4 ° C. Recover geconcentreerde monster en herhaal filtratie met een nieuw filter, zoals hierboven gedurende 30 minuten en het verzamelen van de geconcentreerde monster.
- Voer een eiwit assay de concentratie te bepalen. Kort verschillende concentraties van een bekend eiwit, is (bovine serum albumine BSA) gemengd met een bekende hoeveelheid reagens en Bradford gemeten extinctie bij golflengte 595nm. Vervolgens wordt een optische dichtheid versus de concentratie standaardcurve werd ingesteld om de onbekende concentratie van gezuiverde kinesine fractie met de optische dichtheid van het monster gemeten onder dezelfde condities als die van de standaard BSA monsters te berekenen. Gelelektroforese en Western blot werd uitgevoerd met een bekende hoeveelheid van het gezuiverde kinesine.
- Aliquot kinesine fractie in kleine hoeveelheden gewenste concentratie en module bevriezing in vloeibare stikstof te slaan bij -80 ° C.
Doorlopende functionele Kinesine werd gezuiverd uit Drosophila embryo's. Figuur 1 toont de zilver gekleurde gel met de verschillende fracties tijdens de zuivering. Baan 1 is een voorbeeld van de hoge snelheid supernatant na verduidelijking (stap 2.5), baan 2 is een voorbeeld van de pellet na verduidelijking, baan 3 is een monster van de bovenstaande na de eerste sedimentatie met sucrose kussen (stap 4.1), baan 4 wordt een monster van de pellet na de eerste sedimentatie, baan 5 is een voorbeeld van de supernatant na de tweede sedimentatie (stap 4.3), baan 6 is een voorbeeld van de pellet na de tweede sedimentatie, baan 7 is een voorbeeld van de pellet de laatste sedimentatie (stap 4.5), laan 8 is het gezuiverde kinesine monster, baan 9 is de gefilterde kinesine monster, en de baan 10 is de markering. De geconcentreerde band in laan 8 en 9 op ongeveer 115 kD is kinesine zware keten 1, die in overeenstemming is met Figure 1, laan 8 van de Saxton papier gepubliceerd in 1988 5. Figuur 2 de c western blot van het gezuiverde fractie kinesine gedetecteerd met de kinesine zware ketens van antilichamen. Het antilichaam AKINO1-A heeft geen significante kruisreactie met andere kinesine familieleden 6. Merk op dat al deze protocol levert een goede bron van functionele kinesine, terwijl de fractie verrijkt kinesine-1 zijn mogelijke contaminanten die potentieel andere kinesins en andere motorische eiwitten. We verwijderen een verscheidenheid aan kleinere verontreinigingen door middel van filtratie. Wat het verwijderen van andere motoren, die niet kan alleen op grootte, de zuivering gelijk aan wat door anderen kinesine 7 bestuderen en wij dat het merendeel van de actieve motor Kinesine-1, verfijndere zuivering zou verwijdering van mogelijke motor verontreinigingen zoals werd door Cole et al. 8 en Saxton et al.. 9 De processivity van kinesine werd door in vitro enkele molecule microtubule binding assay, zoals in meer detail beschreven in het boek van Scholey getiteld "Test voor Motility Motor eiwitten" 10. In het kort werden polystyreenparels met een actieve motor in contact gebracht met de microtubule, in aanwezigheid van verzadigende (1 mm) ATP. De motor aan de microtubule en liep van het centrum van de laser val. Op vooraf bepaalde verplaatsing van de kraal van de val centrum (100 nm) de laserstraal macht automatisch uitgeschakeld, waardoor de motor aan de MT lopen onbelast. De film toont een 500 nm diameter kraal met enkele kinesine een wandeling langs MT. De lengte van het beeldscherm overeenkomt met 20 pm. Figuur 3 de gemeten spreiding van run-lengte voor een volledige lengte Drosophila kinesine moleculen gezuiverd volgens het protocol hier gepresenteerd. De exponential geschikt om de verdeling geeft de gemiddelde runlength van een kinesine 1,55 ± 0,1 pm en 1,28 ± 0,12 pm voor de gefilterde en ongefiltreerde monster respectievelijk.
Figuur 1 zilver gekleurde gel van het gezuiverde fracties. Monsters van elke fractie werd uitgevoerd in een 10% gel. 10 ug eiwit werd geladen in elke laan. Baan 1 is een voorbeeld van de hoge snelheid supernatant na verduidelijking (stap 2.5), baan 2 is een voorbeeld van de pellet na verduidelijking, baan 3 is een monster van de bovenstaande na de eerste sedimentatie met sucrose kussen (stap 4.1), baan 4 wordt een monster van de pellet na de eerste sedimentatie, baan 5 is een voorbeeld van de supernatant na de tweede sedimentatie (stap 4.3), baan 6 is een voorbeeld van de pellet na de tweede sedimentatie, baan 7 is een voorbeeld van de pellet de laatste sedimentatie (stap 4.5), laan 8 is het gezuiverde kinesinemonster, baan 9 is het gefilterde kinesine met een 100 kD afgesneden Amicon ultra 0,5 ml centrifugale filter (Millipore, USA). De blauwe pijlen geven de eiwitten waarvan de bedragen werden verlaagd en de rode pijl geeft de concentratie van kinesine als gevolg van de centrifugale filtratie stap die in dit protocol.
. Figuur 2 Gezuiverd KHC fractie geblot tegen anti-kinesine antilichaam: Gezuiverd kinesine monster werd onderworpen aan gelelektroforese en geblot (in nitrocellulosemembraan) tegen primaire antilichaam AKINO1-A (1:1000 in TBST) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur gevolgd door incubatie in Donkey-anti-konijnen-antilichamen (1:10.000 in TBST) een uur bij kamertemperatuur. Een ECL (chemiluminescentie) kit werd gebruikt om de kinesine signaal hierboven detecteren.
Figuur 3. Drosophila volledige lengte kinesine: (A) en (B) Runlength en snelheid van gefiltreerd kinesine monster. (C) en (D) Runlength en snelheid van ongefilterde kinesine monster.
Figuur 4. Video van kinesine motiliteit. Klik hier om video te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bovine hersenen de meest gebruikte uitgangsmateriaal 11 volledige lengte kinesine zuiveren echter murine brein is ook 12 gebruikt. Een groot nadeel van het gebruik van runderen hersenen als een kinesine bron is de beschikbaarheid van verse uitgangsmateriaal: slachthuizen zijn meestal niet toegankelijk, en de hersenen moet zeer vers in om actieve kinesine te verkrijgen. Verder alleen de hersenen van jonge koeien effectief. Tot slot, genetische manipulatie van de koeien is op dit moment geen haalbare optie is, kan dus alleen 'wild-type' eiwit bestudeerd worden.
Muizen zijn beter toegankelijk, maar het oogsten van muizen brein is een beetje moeilijk en tijdrovend als zuivering kan meer dan 50 hersenen nodig hebben. Verder kan het handhaven van een muis kolonie vrij duur.
In tegenstelling tot Bovine of Murine bronnen Drosophila heeft een aantal voordelen. Ten eerste kan de vliegen gemakkelijk worden gekweekt in het laboratorium met een minimum aan kapitaal uitleggen, en zijn dus gemakkelijk toegankelijk. Drosophila lag vruchtbaar embryo's, die gemakkelijk kunnen worden geoogst zoals hier beschreven. Omdat de Drosophila genoom worden gemanipuleerd en zelfs vele mutant vliegen gemakkelijk verkregen kunnen zowel wild-type en mutante eiwitten worden gezuiverd en door de combinatie van genetische manipulatie en een korte generatie overspanning meer mutanten kunnen worden geïsoleerd. Er moet echter worden opgemerkt dat vanwege volledig verlies van functie kinesine dodelijk is en eiwitten in de embryo voornamelijk maternaal voorzien, is het niet mogelijk te zuiveren zuivere kinesine mutanten drastisch verminderd worden. Niettemin is het mogelijk om eiwitten te zuiveren van heterozygote embryo (kin-mut / +) en de functie van de gemengde populatie karakteriseren en eventueel betrekking dergelijke veranderingen in functie om fenotypen in het dier.
Wijziging of aantasting van het vervoer blijkt te liggen ten grondslag aan vele neurodegeneratieve ziekten, maar de mechanistische verbandtussen ziekte en verandering van single-molecule functie (als gevolg van hetzij mutaties of een veranderde signalering milieu) is onduidelijk. De eiwitzuivering assay ontwikkeld moet hier een belangrijk hulpmiddel bij voortzetting dit begrip, omdat moleculen assays kunnen worden gebruikt om de motoren functie te bepalen. Door het combineren van dergelijke studies met in vivo karakterisering van fenotypes, en geholpen door modellering, dit maakt directe bepaling van de relatie tussen de te wijzigen specifieke enkele moleculaire eigenschappen en ontwikkeling van de ziekte / progressie (als voorbeeld, zie de link tussen de gewijzigde single-molecule dyneine functie en een verminderde neuronale vervoer, in 13).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Met dank aan Kris Ngai en Jason Del Rio voor hun steun en hulp bij dit project. Dit werk werd ondersteund door RO1 subsidie GM070676 naar SPG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar (Granulated) | Fisher Scientific | 1423-500 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Petri Dishes | BD Biosciences | 35 1007 | 60x15mm Style (Polyester) 20/bag |
| Drosophila Culture Vials | UCI | ||
| Tricorn beaker | Econo Lab Inc. | B700-100 | Volume:100ml, size: 58x72mm |
| Yeast | Red Star | 2751 | |
| Nylon Mesh | Genesee Scientific | 57-102 | 120 micron pore size |
| Nylon Mesh | Small Parts, Inc. | 06-350/35 | |
| Pipes | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Pipes | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 67-42-5 | |
| MgS04(Anhydrous) | Fisher Scientific | 7487-88-9 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 329-98-6 | |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | 103476-89-7 | |
| Aprotonin | Sigma-Aldrich | 9087-70-1 | |
| TAME | Sigma-Aldrich | 178403-8 | |
| STI | Calbiochem | 65635 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | 36051-31-7 | |
| Taxol | Sigma-Aldrich | 33069-62-4 | |
| ATP analog 5’-adenylyl imidodiphosphate | Sigma-Aldrich | 3605-31-7 | |
| NaCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 7647-14-5 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 74804-12-9 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters: .5 mL, 100kD cut off, 8 pack | EMD Millipore | UFC510008 |
References
- Ashburner, M., Thompson, J. N. The laboratory culture of Drosophila 2A. The genetics and biology of Drosophila. Ashburner, M., Wright, T. R. F. , Academic Press. 1-81 (1978).
- Roberts, D. B. Drosophila: A Practical Approach. , Oxford University Press. (1998).
- Kunert, N., Brehm, A. Mass production of Drosophila Embryosand Chromatographic Purification of Native Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 420, 359 (2008).
- Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A., Wilson, L., Matsudaira, P. T., Eds, Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. 44, (1994).
- Saxton, W. M. Drosophila kinesin: Characterization of microtubule motility and ATPase. Proceedings of the National Academy of Science. 85, 1109 (1988).
- Shubeita, G. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1098 (2008).
- Svoboda, K., Block, S. M. Force and Velocity Measured for Single Kinesin Molecules. Cell. 77, 773 (1994).
- Cole, D. G., Saxton, W. M., Sheehan, K. B., Scholey, J. M. A "Slow" Homotetrameric Kinesin-related Motor Protein Purified from Drosophila embryos. J. Biol. Chem. 269, 22917-22917 (1994).
- Saxton, W. M. Isolation and Analysis of Microtuble Motor Proteins. Drosophila Melanogaster. Bloomington: Academic. 44, 279 (1994).
- Scholey, J. Motility Assay for Motor Proteins. Methods in Cell Biology. 39, 138 (1993).
- Wagner, M. C., Pfister, K., Brody, S., Bloom, G. Purification of kinesin from bovine brain and assay of microtubule-stimulated ATPase activity. Methods in Enzymology. 196, 157 (1991).
- Aizawa, H. Kinesin Family in Murine Nerwous System. The Journal of Cell Biology. 119, 1287-1287 (1992).
- Ori-McKenney, K. M., Xu, J., Gross, S. P., Vallee, R. B. A cytoplasmic dynein tail mutation impairs motor processivity. Nature Cell Biology. 12, 1228-1228 (2010).
