Summary
这是一个协议隔离积极全长驱动蛋白
Abstract
马达蛋白沿着微管移动的货物，并运送到特定的亚细胞位置。由于改变交通建议多种神经退行性疾病的基础，了解微管的汽车运输及其调控最终可能会导致更好的治疗方法。动蛋白是真核细胞马达蛋白在ATP水解供电，沿微管（MTS）顺（加末）的方向移动。在这里，我们报告了详细的净化从果蝇胚胎中分离的积极全长kinesin的协议，从而使单分子生物物理研究果蝇遗传学相结合。拥有大约1000名女性，每杯，约50铺设杯开始，我们进行了隔夜的集合。这提供了约10毫升装的胚胎。胚胎漂白dechorionated（产生的胚胎约9克），然后均匀。 AF之三的破坏，匀浆，利用低速旋转，由高速离心澄清。澄清的上清液治疗GTP和紫杉醇微管聚合。动蛋白聚合微管上，通过增加ATP的模拟在室温下，5'-腺苷酸imidodiphosphate固定。 kinesin的绑定后，微管沉降的通过通过蔗糖坐垫高速离心。微球，然后再暂停，并重复此过程。最后，ATP的释放从MTS动蛋白。高速离心，然后降速MTS，留在上清动蛋白。这kinesin的使用100第纳尔切断进一步净化过滤离心过滤，分装，捕捉液氮冷冻，储存在-80°C。使用纯化的样品进行SDS凝胶电泳和免疫印迹。最后离心过滤步骤之前和之后的纯化的样品电机活动在体外单分子微管法进行了评估。离心过滤前后动蛋白组分显示processivity以前文献报道。进一步的实验正在进行评估动蛋白和其他运输相关的蛋白质之间的相互作用。
Protocol
苍蝇可以购买，并在实验室中扩增菌株。根据对果蝇文化收到小瓶量，需要频繁地“翻转”文化小瓶，小瓶已达到最大容量。扩增继续填充，直到大约50 果蝇的培养瓶。然后，一个“飞杯”三角帽100毫升烧杯（飞杯决策将在下一节讨论）。 24小时后，使用胚胎从这些杯种子新果 蝇的培养瓶，贴在底部飞食品。在室温下从隔夜胚胎全面增长的苍蝇， 果蝇胚胎的生长时间约8.5天。种子的胚胎孵化到幼虫阶段后12-15小时。幼虫成长为4天左右蜕皮两次在24小时和48小时孵化后，进入第二和第三的幼虫阶段。幼虫，然后封装成pupariums和提交了4天的蜕变，直到新兴从T继承人蛹1例。大约两到三天的增长，在果蝇的培养瓶，允许在每一个苍蝇的数量增加。 400瓶充满时，会有足够的苍蝇，金额为50产蛋杯（每杯约1,000雌蝇）。苍蝇需要时间来适应新的环境。它通常需要大约两天为他们准备收集后，被转移到杯子。每天更换平板将保持干净的飞杯，这让苍蝇活得更长。 （ 果蝇的关怀和放大的进一步了解，请参考DB罗伯茨的果蝇 ：一个实用的方法2）。
一个很好的来源，获得大量的果蝇胚胎人口笼3，这是市售。人口笼的组装和维护，可以看出，在第5和第7章在书中果蝇 ：Practical利用细胞和分子生物学4。然而，人口笼是昂贵的，是很难维持的。由于人口的笼子可容纳丰富的苍蝇数量，使用二氧化碳转移和喂养苍蝇是必要的。如前所述，二氧化碳减少苍蝇的健康，使他们没有打好，以及。对规模小，100毫升三角帽烧杯都可以使用。 50 100毫升烧杯中，可能会达到9克dechorionated胚胎。为了消除死苍蝇，未使用的酵母膏和其它杂质，我们已经创建了一个不同的网目尺寸的双分层筛捕手。一个筛陷阱不必要的材料，如死苍蝇，同时允许通过胚胎（350微米孔径）。第二部分包含一个网格（孔径120微米），这是为了赶上果蝇胚胎和其他杂质，将通过网格。
1。飞杯的制备及胚胎收集
- 翻动从多个小瓶的扩增到一个空塑料瓶的苍蝇，直到苍蝇的数量已达到一英寸瓶的高度。那么，那些苍蝇转移到100毫升鸡蛋收集杯（TRICON烧杯用尼龙网窗口）。在坚硬的表面保持攻杯转移苍蝇逃生时防止苍蝇。盖杯琼脂平板含有酵母膏，并允许稳定时间24-48小时。
- 收集从五十飞杯隔夜的琼脂板和筛除尘器，使用干净的油漆刷和自来水洗板块的内容。肉用大量的水筛胚胎冲走，直到所有的酵母膏。
- Dechorionate在50％的漂白粉浸泡3分钟清洗的胚胎。
- 广泛用蒸馏水冲洗，直到胚胎宽松的漂白剂气味。然后放置在AC折叠毛巾多次与胚胎干网。胚胎转移到一个干净的小瓶和记录重量。 </ LI>
2。胚胎的同质化和澄清
- 放置在Dounce均质与冰冷的提取液1.5 X卷dechorionated胚胎。
- 做宽松杵5招。干净的离心管分装成匀浆。 15,000Ğ离心40分钟。在4°C
- 精心收集没有明确上清液上的白色脂肪层或较低的颗粒。
- 将上清转移到清洁离心管，离心30分钟50,000Ğ。在4°C
- 由此产生的高速上清收集正如上文解释，可以立即使用，或可以捕捉冻结几个月储存于-80°C。
3。微管聚合和驱动蛋白结合
- 室温解冻的冷冻高速上清。聚合微管，添加的GTP（0.3毫米）和紫杉醇（20μM），并在室温下轻轻搅动20分钟旋转振动筛。
- kinesin的绑定，添加2.5毫米nonhydrolyzable ATP的模拟5'-腺苷酸imidodiphosphate（AMPPNP），在室温10分钟旋转摇床搅拌。
4。微管和驱动蛋白的不均匀沉降
- 泥沙通过等量蔗糖垫在23,000克（sw41ti转子时，TLS-55）（20％的蔗糖和10μM的紫杉醇提取液），离心30分钟。在4°C
- 洗颗粒悬浮在原始提取缓冲区含有10μM的紫杉醇和75毫米氯化钠匀浆量的10％。
- 重复步骤4.1与其他同等体积蔗糖垫沉淀。
- 重新暂停5％提取液中的颗粒盐洗20微米紫杉醇，75毫米氯化钠， 硫酸镁 10毫米，和10毫米的三磷酸腺苷。
- 泥沙在120,000克（sw41ti转子：31000转，TLS-55：42,000 RPM）为20分钟，4°C。收集上清（kinesin的分数）。
- 执行14,000Ğ15分钟离心过滤，在4°C。恢复浓缩样品和30分钟重复了上述新的过滤器过滤和收集浓缩样本。
- 进行蛋白质检测，以确定浓度。简单地说，不同的已知蛋白浓度（牛血清白蛋白BSA）混合与布拉德福德试剂的体积已知，在波长595nm处测定光密度。然后成立光密度与浓度的标准曲线计算kinesin的分数，此示例使用类似条件下的光密度测量标准牛血清白蛋白样品纯化的未知浓度。凝胶电泳以及免疫印迹也用纯化kinesin的金额。
- 分装成小容量所需的浓度和在液氮中的单元冻结kinesin的分数存放在-80°C。
全长功能驱动蛋白纯化果蝇胚胎。 图1描述了银染凝胶，在纯化过程中的不同部位。巷1是高速上清澄清后的样品（步骤2.5），2巷澄清是一个沉淀的样品后，3车道是上清样品后第一次沉淀与蔗糖垫（步骤4.1），4车道是一个样品的颗粒先沉淀后，5巷是一个样品后的第二次沉淀（步骤4.3）上清，6车道是一个沉淀的样品后的第二次沉淀，7巷是样品颗粒最后沉淀（步骤4.5），8车道是kinesin的样品纯化，9巷过滤kinesin的样品，10巷是标记。集中在8日和9车道约115 kD的带动蛋白重链1，是与Figur一致萨克斯顿纸公布的1988年5巷8 E 1， 图2表示西部的c纯化kinesin的分数印迹检测使用动蛋白重链抗体。抗体AKINO1-A并没有显着交叉反应与其他动蛋白家族成员6。请注意，虽然此协议的结果，在功能动蛋白的良好来源，而分数动蛋白-1丰富，有可能的污染物，包括潜在的其他动蛋白和其他机动蛋白。我们删除，过滤各种较小的污染物。尽量消除它可以不被按尺寸做单独其它电机，净化类似什么，别人做研究驱动蛋白7，和我们相信，大多数活跃的电机是驱动蛋白-1，但更复杂的净化将允许潜力的汽车污染物的去除，如科尔等 8和萨克斯顿等 。 kinesin的processivity 在体外单分子微管结合实验Scholey题为“马达蛋白的运动功能检测”10书更详细的描述，评价。简单地说，用一个积极的电机的聚苯乙烯珠被带进接触与微管，在饱和的存在（1毫米）ATP。电机连接到微管，并开始步行激光陷阱中心。在预定义的珠陷阱中心的位移（100 nm）的激光束功率自动关闭，使电机空载下步行沿MT。影片展示了一个直径为500纳米的单kinesin的步行沿吨珠。视频画面的长度相当于20微米。 图3表示运行长度的测量单全长果蝇动蛋白分子的分布，纯化按照这里介绍的协议。在exponenti人适合的分布，提供游程平均单kinesin的1.55±0.1微米和1.28±0.12微米的过滤和过滤的样品分别。
图1纯化组分银染凝胶：从每个部分样品运行在10％的凝胶。被装在每个泳道10μg蛋白。巷1是高速上清澄清后的样品（步骤2.5），2巷澄清是一个沉淀的样品后，3车道是上清样品后第一次沉淀与蔗糖垫（步骤4.1），4车道是一个样品的颗粒先沉淀后，5巷是一个样品后的第二次沉淀（步骤4.3）上清，6车道是一个沉淀的样品后的第二次沉淀，7巷是样品颗粒最后沉淀（步骤4.5），8车道动蛋白纯化样品9巷是过滤kinesin的使用1 100 kD的截止Amicon超0.5毫升离心过滤（Millipore公司，美国）。蓝色箭头表示的蛋白质，其金额分别下降，红色箭头表示动蛋白的浓度，由于在该协议中使用的离心过滤步骤。
图2纯化餐旅学院分数抹杀反对反动蛋白抗体纯化kinesin的样品凝胶电泳和抹杀对初级抗体（硝酸纤维素膜）AKINO1一个1小时（TBST 1:1,000）在室温下孵育驴抗兔抗体（在TBST 1:10,000）在室温下一个小时。一个ECL试剂盒（化学发光）用于检测上面显示的kinesin的信号。
图3。 果蝇全长kinesin的速度：（一）及（B）过滤驱动蛋白样的游程和速度。 （三）及（D）游程和kinesin的样品过滤的速度。
图4。kinesin的运动视频。 点击这里观看视频 。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
牛脑是最广泛使用的起始原料11净化全长kinesin的，虽然小鼠的大脑已被使用，以及12。使用牛脑动蛋白源作为一个大的缺点是新鲜的起始原料的可用性：屠宰场通常无法进入，必须非常新鲜，以取得积极的kinesin的大脑。此外，青年奶牛的大脑是有效的。最后，牛的基因操纵，目前没有一个可行的选择，所以只有野生型的蛋白质进行研究。
小鼠更容易，但收获小鼠大脑是有些困难和费时的净化可以要求超过50大脑。此外，保持鼠标殖民地可以是相当昂贵的。
果蝇在牛或鼠源相比，具有许多优点。首先，可以很容易地种植的苍蝇，用最少的资金出在实验室打下，因此方便。 果蝇奠定的多产胚胎，这很容易收获此处所述。由于果蝇的基因组可以被操纵，确实很容易获得许多突 变的果蝇，野生型和突变蛋白进行纯化，由于遗传操作和一代人的时间短的组合，更多的突变可以被隔离。然而，应当指出，kinesin的功能完全丧失，因为是致命的，并在胚胎中的蛋白质主要是提供母体，这是不可能净化纯kinesin的突变大大受损。尽管如此，它是可能的纯化蛋白（健物/ +）杂合子胚胎，混合人口和表征功能，则可能涉及的功能，如在动物的表型变化。
改建或运输的减值出现许多神经退行性疾病的基础，但是，机械链接单分子功能（由于基因突变或改变信号环境）的改变和疾病之间是不清楚。这里开发的蛋白质纯化实验应该在追求这种认识的重要工具，因为单分子检测，可用于确定电机的功能。通过结合这些研究在体内的表型特征，并通过模拟资助，这使得改变具体的单分子性质和疾病发展/进展（之间的关系直接测定作为一个例子，改变单分子动力蛋白的功能和之间的联系受损神经元的运输，在13个 ）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
特别感谢克里斯艺和贾森德尔里奥在这个项目的支持和援助。这项工作被授予GM070676石药RO1的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar (Granulated) | Fisher Scientific | 1423-500 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Petri Dishes | BD Biosciences | 35 1007 | 60x15mm Style (Polyester) 20/bag |
| Drosophila Culture Vials | UCI | ||
| Tricorn beaker | Econo Lab Inc. | B700-100 | Volume:100ml, size: 58x72mm |
| Yeast | Red Star | 2751 | |
| Nylon Mesh | Genesee Scientific | 57-102 | 120 micron pore size |
| Nylon Mesh | Small Parts, Inc. | 06-350/35 | |
| Pipes | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Pipes | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 67-42-5 | |
| MgS04(Anhydrous) | Fisher Scientific | 7487-88-9 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 329-98-6 | |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | 103476-89-7 | |
| Aprotonin | Sigma-Aldrich | 9087-70-1 | |
| TAME | Sigma-Aldrich | 178403-8 | |
| STI | Calbiochem | 65635 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | 36051-31-7 | |
| Taxol | Sigma-Aldrich | 33069-62-4 | |
| ATP analog 5’-adenylyl imidodiphosphate | Sigma-Aldrich | 3605-31-7 | |
| NaCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 7647-14-5 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 74804-12-9 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters: .5 mL, 100kD cut off, 8 pack | EMD Millipore | UFC510008 |
References
- Ashburner, M., Thompson, J. N. The laboratory culture of Drosophila 2A. The genetics and biology of Drosophila. Ashburner, M., Wright, T. R. F. , Academic Press. 1-81 (1978).
- Roberts, D. B. Drosophila: A Practical Approach. , Oxford University Press. (1998).
- Kunert, N., Brehm, A. Mass production of Drosophila Embryosand Chromatographic Purification of Native Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 420, 359 (2008).
- Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A., Wilson, L., Matsudaira, P. T., Eds, Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. 44, (1994).
- Saxton, W. M. Drosophila kinesin: Characterization of microtubule motility and ATPase. Proceedings of the National Academy of Science. 85, 1109 (1988).
- Shubeita, G. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1098 (2008).
- Svoboda, K., Block, S. M. Force and Velocity Measured for Single Kinesin Molecules. Cell. 77, 773 (1994).
- Cole, D. G., Saxton, W. M., Sheehan, K. B., Scholey, J. M. A "Slow" Homotetrameric Kinesin-related Motor Protein Purified from Drosophila embryos. J. Biol. Chem. 269, 22917-22917 (1994).
- Saxton, W. M. Isolation and Analysis of Microtuble Motor Proteins. Drosophila Melanogaster. Bloomington: Academic. 44, 279 (1994).
- Scholey, J. Motility Assay for Motor Proteins. Methods in Cell Biology. 39, 138 (1993).
- Wagner, M. C., Pfister, K., Brody, S., Bloom, G. Purification of kinesin from bovine brain and assay of microtubule-stimulated ATPase activity. Methods in Enzymology. 196, 157 (1991).
- Aizawa, H. Kinesin Family in Murine Nerwous System. The Journal of Cell Biology. 119, 1287-1287 (1992).
- Ori-McKenney, K. M., Xu, J., Gross, S. P., Vallee, R. B. A cytoplasmic dynein tail mutation impairs motor processivity. Nature Cell Biology. 12, 1228-1228 (2010).
