Summary
Il s'agit d'un protocole d'isoler actif Kinesin pleine longueur à partir de
Abstract
Protéines motrices transporter des marchandises le long des microtubules, et les transporter à des sous-cellulaires endroits. Parce que le transport modifié est proposé à la base une variété de maladies neurodégénératives, la compréhension des microtubules du transport basé à moteur et de son règlement sera probablement finalement conduire à l'amélioration des approches thérapeutiques. Kinésine-1 est une protéine eucaryote moteur qui se déplace dans une direction antérograde (plus fin) le long des microtubules (MT), généré par hydrolyse de l'ATP. Nous rapportons ici un protocole de purification pour isoler détaillée actif kinésine pleine longueur à partir d'embryons de drosophile, ce qui permet la combinaison de génétique de la Drosophile avec une seule molécule d'études biophysiques. À partir avec environ 50 tasses de pose, avec environ 1000 femmes par tasse, nous avons réalisé des collections pendant la nuit. Cela a fourni environ 10 ml d'embryons emballés. Les embryons ont été l'eau de Javel dechorionated (ce qui donne environ 9 grammes d'embryons), puis homogénéisé. Afperturbations ter, l'homogénat a été précisé en utilisant une vitesse d'essorage à faible suivie d'une centrifugation à grande vitesse. Le surnageant clarifié a été traitée avec GTP et le taxol à polymériser MT. Kinésine a été immobilisé sur polymérisé par addition MT l'analogue de l'ATP, 5'-adénylate imidodiphosphate à la température ambiante. Après kinésine contraignant, les microtubules ont été sédimentées par centrifugation à grande vitesse grâce à un coussin de saccharose. Le culot a été microtubules ensuite remis en suspension, et ce processus a été répété. Enfin, l'ATP a été ajouté à libérer la kinésine de la MT. Centrifugation à grande vitesse, puis filé vers le bas de la MT, laissant la kinésine dans le surnageant. Cette kinésine a été soumis à une filtration centrifuge en utilisant une réduction de 100 KD hors du filtre pour une purification supplémentaire, aliquotés, enclenchez congelés dans l'azote liquide, et conservés à -80 ° C. Électrophorèse sur gel SDS et western blot a été réalisée en utilisant l'échantillon purifié. L'activité motrice des échantillons purifiés avant et après l'étape finale de filtration centrifugea été évaluée en utilisant un test in vitro molécule microtubules unique. Les fractions kinésine avant et après la filtration centrifuge montré processivité comme précédemment rapporté dans la littérature. D'autres expériences sont en cours pour évaluer l'interaction entre kinésine et autres protéines de transport connexes.
Protocol
Les souches de mouches peuvent être achetés et amplifié dans le laboratoire. Selon la quantité de flacons de culture de Drosophila reçues, un besoin de fréquemment "retourner" les flacons de culture, une fois les flacons a atteint sa capacité maximale. L'amplification se poursuit jusqu'à environ 50 flacons de culture de Drosophila sont remplis. On fait alors «voler tasses" avec 100 ml béchers tricorne (Fly décision tasse est discuté dans la section suivante). Après 24 heures, utiliser des embryons à partir de ces tasses à graines nouveaux flacons de culture avec de la nourriture volée drosophile apposée au bas. A température ambiante, le temps de croissance pour les embryons de drosophile à partir d'embryons nuit à la pleine mouches cultivées sont environ 8,5 jours. Embryons ensemencées éclosent après 12-15 heures dans le stade de larves de premier. Les larves se développer pendant environ 4 jours mue deux fois dans le stade larvaire des deuxième et troisième, à 24 et 48 heures après l'éclosion. Les larves, puis encapsuler dans pupariums et de soumettre à une métamorphose 4 jours jusqu'à ce émergent à partir de tcas héritier pupes 1. Autoriser pour plus de croissance pendant environ deux à trois jours dans les flacons de culture de Drosophila pour augmenter la quantité de mouches dans chaque. Lorsque 400 flacons sont remplis, il y aura une quantité suffisante de mouches pour la cinquante tasses de ponte (environ 1.000 mouches femelles par tasse). Les mouches ont besoin de temps pour s'adapter à leur nouvel environnement. Cela prend habituellement environ deux jours pour qu'ils soient prêts pour la collecte, après avoir été transféré aux tasses. Remplacement des plaques d'agar par jour permet de garder les tasses de mouches propre, qui permettent de vivre plus longtemps mouches. (Pour plus de compréhension des soins de la drosophile et l'amplification, s'il vous plaît se référer à la drosophile DB Roberts: A Practical Approach 2).
Une bonne source pour obtenir de grandes quantités d'embryons de drosophile sont 3 cages de la population, qui sont disponibles dans le commerce. Le montage et la maintenance des cages de la population peut être vu sur le chapitre 5 et 7 dans le livre Drosophila melanogaster: PPRATIQUE utilisations dans la cellule et 4 de biologie moléculaire. Cependant, les cages de la population sont coûteux et difficiles à maintenir. Depuis des cages de la population peut contenir une quantité abondante de mouches, l'utilisation du dioxyde de carbone est nécessaire pour le transfert et l'alimentation des mouches. Comme indiqué précédemment, le dioxyde de carbone diminue la santé des mouches, les obligeant à ne pas jeter ainsi. Sur une petite échelle, 100 ml béchers tricorne peut être utilisé. Avec béchers ml cinquante 100, 9 grammes d'embryons dechorionated peut être atteint. Pour enlever les mouches mortes, de la pâte de levure utilisé et d'autres impuretés que nous avons créés un capteur de tamis à double couche avec différentes tailles de mailles. Un des pièges à tamis matières indésirables comme des mouches mortes, tout en permettant de passer à travers les embryons (350 microns la taille des pores). La deuxième partie contient une maille (120 microns la taille des pores), qui vise à rattraper embryons de drosophile et d'autres impuretés passera à travers les mailles.
1. Fly Préparation de la Coupe et Collection d'embryons
- Feuilleterles mouches amplifiés à partir de plusieurs flacons dans un flacon en plastique vide, jusqu'à ce que la quantité de mouches ont atteint un pouce de hauteur du flacon. Ensuite, transférer ces mouches dans un oeuf 100 ml de collecte tasse (bécher Tricon avec filet de nylon les fenêtres). Continuez à tapoter la tasse sur une surface dure pour empêcher l'évasion des mouches lors du transfert de mouches. Couvrir la tasse avec plaque de gélose de levure pâte contenant et permettre à 24-48 heures de temps de stabilisation.
- Recueillir des plaques d'agar nuit à partir de cinquante tasses de mouches et de laver le contenu des assiettes au receveur tamis à l'aide d'un pinceau propre et l'eau courante. Chair des embryons dans le tamis et abondamment avec de l'eau jusqu'à ce que toute la pâte de levure est emporté.
- Dechorionate les embryons nettoyés en les immergeant dans l'eau de Javel à 50% pendant 3 min.
- Rincer abondamment à l'eau distillée jusqu'à ce que les embryons en vrac l'odeur de javellisant. Puis sécher le maillage avec des embryons en le plaçant sur les temps d'ac-serviettes pliage multiples. Transfert des embryons dans un flacon propre et enregistrer le poids. </ Li>
2. Homogénéisation de l'embryon et de clarification
- Placez embryons dechorionated dans Dounce homogénéisateur à 1,5 x le volume du tampon d'extraction glacée.
- Avez-5 coups avec le pilon en vrac. Aliquoter l'homogénat dans des tubes à centrifuger propres. Centrifuger à 15000 g pendant 40 min. à 4 ° C.
- Recueillir soigneusement le liquide clair surnageant sans la couche lipidique blanche supérieure ou inférieure de la pastille.
- Transférer le surnageant dans des tubes propres à centrifuger et centrifuger à 50000 g pendant 30 min. à 4 ° C
- Résultant haute vitesse surnageant recueilli, comme expliqué ci-dessus peut être utilisé immédiatement ou peut être enclencher congelés et conservés à -80 ° C pendant des mois.
3. Polymérisation des microtubules et la kinésine reliure
- Décongeler l'congelé haute vitesse surnageant à la température ambiante. Pour polymériser microtubules, ajouter GTP (0,3 mM) et le taxol (20 uM) et agiter doucement à température ambiante pendant 20 min dansun agitateur rotatif.
- Pour lier la kinésine, ajouter 2,5 mM ATP hydrolysé analogique 5'-cyclase imidodiphosphate (AMPPNP), suivie d'une agitation 10 min à température ambiante dans un agitateur rotatif.
4. Sédimentation différentielle des microtubules et la kinésine
- Sédiments par un coussin de saccharose volume égal (saccharose à 20% et 10 taxol uM dans un tampon d'extraction) par centrifugation à 23 000 g (sw41ti rotor, TLS 55) pendant 30 min. à 4 ° C.
- Laver à granulés remise en suspension dans 10% du volume d'homogénat d'origine dans le tampon d'extraction contenant 10 taxol uM et 75 mM de NaCl.
- Répétez la sédimentation avec un autre coussin de saccharose à volume égal que dans l'étape 4.1.
- Re-suspendre pastille de lavage de sel dans un tampon d'extraction à 5% avec 20 uM de taxol, 75 mM NaCl, 10 mM MgSO 4, et 10 mM d'ATP.
- Des sédiments à 120.000 g (sw41ti rotor: 31000 rpm, TLS-55: 42.000 rpm) pendant 20 minutes à 4 ° C. Recueillir le surnageant (kinésinefraction).
- Effectuer une filtration centrifuge à 14000 g pendant 15 min à 4 ° C. Récupérer échantillon concentré et répéter la filtration avec un nouveau filtre comme ci-dessus pendant 30 minutes et recueillir l'échantillon concentré.
- Effectuer un dosage de protéines pour déterminer la concentration. En bref, des concentrations variables d'une protéine connue (albumine de sérum bovin; BSA) a été mélangé avec un volume connu de réactif de Bradford et de mesurer la densité optique à 595nm de longueur d'onde. Puis une densité optique par rapport courbe standard de concentration a été établi pour calculer la concentration inconnue du fraction purifiée kinésine utilisant la densité optique mesurée de l'échantillon dans des conditions similaires à celle des échantillons standards BSA. L'électrophorèse sur gel ainsi que western blot a également été réalisée en utilisant une quantité connue de la kinésine purifié.
- Fraction kinésine Aliquoter dans de petits volumes de concentration voulue et gel inattendu dans l'azote liquide pour stocker à -80 ° C.
Sur toute la longueur Kinesin fonctionnelle a été purifié à partir d'embryons de drosophile. La figure 1 illustre le gel coloré à l'argent montrant les différentes fractions au cours de la purification. La ligne 1 est un échantillon du surnageant à grande vitesse après clarification (étape 2.5), la piste 2 est un échantillon de la pastille, après clarification, la piste 3 est un échantillon du surnageant après la sédimentation d'abord avec coussin de saccharose (étape 4.1), la piste 4 est un échantillon de la pastille après la première sédimentation, la piste 5 est un échantillon du surnageant après décantation de la seconde (étape 4.3), la piste 6 est un échantillon de la pastille après la sédimentation seconde, la piste 7 est un échantillon de la pastille de la sédimentation finale (étape 4.5), la piste 8 de l'échantillon est purifié kinésine, la piste 9 est l'échantillon kinésine filtrée, et la piste 10 est le marqueur. Le groupe concentré dans le couloir 8 et 9 à environ 115 kD est kinésine chaîne lourde 1, qui est compatible avec Figure 1, piste 8 du document Saxton publié en 1988 5. La figure 2 représente la tache c ouest de la fraction purifiée kinésine détectée en utilisant l'anticorps de la chaîne lourde de kinésine. L'anticorps AKINO1-A n'est pas significativement une réaction croisée avec d'autres membres de la famille kinésine 6. Notez que bien que ce protocole se traduit par une bonne source de kinésine fonctionnelle, tandis que la fraction est enrichi pour la kinésine-1, il ya des contaminants susceptibles, y compris potentiellement kinésines autres protéines et d'autres moteurs. Nous avons retiré une variété de petits contaminants par filtration. En ce qui concerne supprimant d'autres moteurs qui ne peuvent être effectuées par la taille seule, la purification est similaire à ce qui a été fait par d'autres pour étudier la kinésine 7, et nous croyons que la majorité du moteur actif est Kinesin-1, mais la purification plus sophistiquée pourrait permettre l'élimination des contaminants moteur potentiels, tels que a été faite par Cole et al 8 et Saxton et al. 9 La processivité de la kinésine a été évaluée par dosage in vitro des microtubules molécule de liaison unique, tel que décrit plus en détail dans le livre de Scholey intitulé «test de motilité pour les protéines du moteur" 10. Brièvement, des billes de polystyrène avec un seul moteur connexion ont été mis en contact avec l'microtubules, en présence d'saturant (1 mm) ATP. Le moteur fixé à l'microtubules, et a commencé à s'éloigner du centre du piège laser. À un déplacement prédéfini du bourrelet du centre piège (100 nm) de la puissance du faisceau laser a été automatiquement désactivé, permettant au moteur de pied le long de la MT sous aucune charge. Le film montre un diamètre de 500 nm à billes avec kinésine unique marchant le long de MT. La longueur de l'écran vidéo correspond à 20 um. La figure 3 représente la distribution mesurée de run-longueurs pour célibataires sur toute la longueur des molécules de kinésine drosophile, purifié selon le protocole présenté ici. Le exponential apte à la distribution fournit la longueur de plage moyenne de 1,55 ± seule kinésine 0,1 um et 1,28 ± 0,12 um pour l'échantillon filtré et non filtré, respectivement.
Figure 1 Argent gel coloré des fractions purifiées:. Échantillons de chaque fraction ont été exécutés dans un gel à 10%. 10 ug de protéine a été chargé dans chaque couloir. La ligne 1 est un échantillon du surnageant à grande vitesse après clarification (étape 2.5), la piste 2 est un échantillon de la pastille, après clarification, la piste 3 est un échantillon du surnageant après la sédimentation d'abord avec coussin de saccharose (étape 4.1), la piste 4 est un échantillon de la pastille après la première sédimentation, la piste 5 est un échantillon du surnageant après décantation de la seconde (étape 4.3), la piste 6 est un échantillon de la pastille après la sédimentation seconde, la piste 7 est un échantillon de la pastille de la sédimentation finale (étape 4.5), la voie 8 est la kinésine purifiél'échantillon, la piste 9 est la kinésine filtré en utilisant un 100 kD coupure Amicon ultra filtre centrifuge 0,5 ml (Millipore, USA). Les flèches bleues indiquent les protéines dont les montants ont diminué et la flèche rouge indique la concentration de la kinésine en raison de l'étape de filtration centrifuge utilisée dans ce protocole.
. Figure 2 purifiée KHC fraction effacé contre l'anti-kinésine anticorps: purifiée kinésine échantillon a été soumis à une électrophorèse sur gel et transférés (dans la membrane de nitrocellulose) contre l'anticorps primaire AKINO1-A (1:1000 dans du TBST) pendant 1 heure à température ambiante suivie d'une incubation dans Donkey-anticorps anti-lapin (1:10,000 dans TBST) pendant une heure à température ambiante. Une ECL (chimiluminescence) kit a été utilisé pour détecter le signal kinésine indiqué ci-dessus.
Figure 3. Drosophila seule longueur totale: (A) et (B) de plage et de la vitesse de l'échantillon kinésine filtré. (C) et (D) de longueur de plage et de la vitesse de l'échantillon kinésine non filtré.
Figure 4. Vidéo de la motilité Kinesin. Cliquez ici pour voir la vidéo .
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Discussion
Cerveau bovin est le matériau le plus utilisé à partir du 11 pour purifier pleine longueur kinésine, si le cerveau murin a été utilisé comme puits 12. Un inconvénient important de l'aide cerveau bovin comme source kinésine est la disponibilité de matériau de départ fraîche: les abattoirs sont généralement inaccessibles, et le cerveau doit être extrêmement frais afin d'obtenir kinésine active. En outre, seuls les cerveaux des jeunes vaches sont efficaces. Enfin, la manipulation génétique des vaches n'est actuellement pas une option viable, de sorte que «de type sauvage» des protéines peuvent être étudiées.
Les souris sont plus accessibles, mais la récolte du cerveau murin consomme un peu difficile et le temps que la purification peut exiger plus de 50 cerveaux. En outre, le maintien d'une colonie de souris peut être très coûteux.
Contrairement aux sources bovine ou murine, la drosophile possède un certain nombre d'avantages. Tout d'abord, les mouches peuvent facilement être cultivées en laboratoire avec un capital minimal àlaïcs, et sont donc facilement accessibles. Drosophila jeter embryons prolifiques, qui sont facilement récoltés comme décrit ici. Parce que le génome de la Drosophile peut être manipulé, et même de nombreux mouches mutantes sont faciles à obtenir, les deux protéines de type sauvage et mutant peut être purifié, et en raison de la combinaison de manipulations génétiques et un empan de génération court, plus les mutants peuvent être isolés. Toutefois, il convient de noter que, parce que la perte complète de la fonction kinésine est mortelle, et des protéines dans des embryons est fourni principalement la mère, il n'est pas possible de purifier mutants kinésine pures qui sont considérablement altérées. Néanmoins, il est possible de purifier la protéine à partir d'embryons hétérozygotes (kin-mut / +), et de caractériser la fonction de la population mixte, et puis éventuellement se rapportent de tels changements dans la fonction aux phénotypes observés chez l'animal.
Modification ou altération de transport semble être à l'origine de nombreuses maladies neurodégénératives, mais le lien mécanisteentre la maladie et l'altération de la fonction de molécules simples (due soit à des mutations ou à un environnement de signalisation modifiée) n'est pas claire. Le dosage de purification des protéines développées ici doivent être un outil important dans la poursuite de cette compréhension, parce que d'une seule molécule dosages peuvent être utilisés pour déterminer les moteurs «fonction. En combinant ces études avec la caractérisation in vivo des phénotypes, et aidé par la modélisation, ce qui permet la détermination directe de la relation entre altérant spécifiques simples propriétés moléculaires et les maladies du développement / progression (à titre d'exemple, voir le lien entre la fonction altérée dynéine molécule unique et avec facultés affaiblies transport neuronal, en 13).
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Disclosures
Nous n'avons rien à communiquer.
Acknowledgments
Un merci spécial à Kris Ngai et Jason Del Rio pour leur soutien et leur aide dans ce projet. Ce travail a été soutenu par RO1 subvention GM070676 à SPG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar (Granulated) | Fisher Scientific | 1423-500 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Petri Dishes | BD Biosciences | 35 1007 | 60x15mm Style (Polyester) 20/bag |
| Drosophila Culture Vials | UCI | ||
| Tricorn beaker | Econo Lab Inc. | B700-100 | Volume:100ml, size: 58x72mm |
| Yeast | Red Star | 2751 | |
| Nylon Mesh | Genesee Scientific | 57-102 | 120 micron pore size |
| Nylon Mesh | Small Parts, Inc. | 06-350/35 | |
| Pipes | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Pipes | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 67-42-5 | |
| MgS04(Anhydrous) | Fisher Scientific | 7487-88-9 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 329-98-6 | |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | 103476-89-7 | |
| Aprotonin | Sigma-Aldrich | 9087-70-1 | |
| TAME | Sigma-Aldrich | 178403-8 | |
| STI | Calbiochem | 65635 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | 36051-31-7 | |
| Taxol | Sigma-Aldrich | 33069-62-4 | |
| ATP analog 5’-adenylyl imidodiphosphate | Sigma-Aldrich | 3605-31-7 | |
| NaCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 7647-14-5 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 74804-12-9 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters: .5 mL, 100kD cut off, 8 pack | EMD Millipore | UFC510008 |
References
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- Roberts, D. B. Drosophila: A Practical Approach. , Oxford University Press. (1998).
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