Summary
Questo è un protocollo per isolare attiva Kinesin piena lunghezza da
Abstract
Proteine motrici si muovono carichi lungo i microtubuli, e trasportarli a specifiche sub-cellulari località. Poiché il trasporto alterato viene suggerito alla base di una varietà di malattie neurodegenerative, la comprensione dei microtubuli dei trasporti basata motore e la sua regolamentazione probabilmente in ultima analisi, portare ad un miglioramento degli approcci terapeutici. Kinesina-1 è una proteina eucariotica motore che si muove in una direzione anterogrado (più-end) lungo i microtubuli (MT), alimentato da idrolisi di ATP. Qui riportiamo un protocollo dettagliato di purificazione per isolare attivo chinesina lunghezza intera da embrioni di Drosophila, consentendo così la combinazione di Drosophila genetica con una singola molecola studi biofisici. A partire da circa 50 tazze di posa, con circa 1000 femmine per tazza, abbiamo effettuato le collezioni durante la notte. Questo ha fornito circa 10 ml di embrioni confezionati. Gli embrioni sono stati candeggina dechorionated (producendo circa 9 grammi di embrioni), e quindi omogeneizzato. After interruzione, l'omogenato è stato chiarificato mediante una rotazione a bassa velocità seguita da una centrifugazione ad alta velocità. Il supernatante è stato trattato con chiarito GTP e taxolo a polimerizzare MT. Chinesina è stato immobilizzato su polimerizzato MTs aggiungendo la analogico ATP, 5'-ciclasi imidodiphosphate a temperatura ambiente. Dopo kinesina vincolante, microtubuli sono sedimentate tramite centrifugazione ad alta velocità attraverso un cuscino di saccarosio. Il pellet microtubulo è stata poi ri-sospeso, e questo processo è stato ripetuto. Infine, ATP è stato aggiunto per rilasciare la chinesina dal MT. Centrifugazione ad alta velocità poi centrifugati la MT, lasciando la chinesina nel supernatante. Questo chinesina è stato sottoposto ad una filtrazione centrifuga 100 utilizzando un cut off KD filtro per ulteriore purificazione, frazionare, congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C. SDS gel elettroforesi e western blotting è stato eseguito utilizzando il campione purificato. L'attività motoria dei campioni purificati prima e dopo la fase finale di filtrazione centrifugaè stata valutata utilizzando un saggio in vitro singola molecola microtubuli. Le frazioni chinesina prima e dopo la filtrazione centrifuga mostrato processività come precedentemente riportato in letteratura. Ulteriori esperimenti sono in corso per valutare l'interazione tra chinesina e altre proteine di trasporto correlate.
Protocol
I ceppi di mosche possono essere acquistati e amplificato in laboratorio. A seconda della quantità di flaconi di coltura di Drosophila ricevuti, una necessità di frequenti 'capovolgere' i flaconi di coltura, una volta che le fiale ha raggiunto la capacità massima. L'amplificazione prosegue fino a circa 50 flaconi di coltura di Drosophila sono riempiti. Si fa poi 'volare coppe' con 100 ml bicchieri tricorno (Fly making cup è discusso nella prossima sezione). Dopo 24 ore, utilizzare gli embrioni da queste tazze di semi nuovi flaconi di coltura di Drosophila con il cibo volare apposta in fondo. A temperatura ambiente, il tempo di crescita per gli embrioni di Drosophila dagli embrioni durante la notte per intero le mosche coltivati sono circa 8,5 giorni. Prioritari gli embrioni si schiudono dopo 12-15 ore nella prima fase delle larve. Le larve crescono per circa 4 giorni la muta due volte nella fase larve secondo e terzo, a 24 e 48 ore dopo la schiusa. Le larve quindi incapsulare in pupariums e presentare una metamorfosi quattro giorni fino a che emerge dalla tcasi erede pupa 1. Consentire una maggiore crescita per circa due o tre giorni in flaconi di coltura di Drosophila per aumentare la quantità di mosche in ciascuno di essi. Quando 400 fiale sono riempite, ci sarà una quantità sufficiente di mosche per cinquanta tazze deposizione delle uova (circa 1.000 mosche di sesso femminile per tazza). Le mosche bisogno di tempo per adattarsi al loro nuovo ambiente. Solitamente occorrono due giorni per loro per essere pronto per la raccolta, dopo essere stato trasferito alle tazze. Sostituzione piastre di agar quotidiano mantenere le tazze pulite mosca, che permettono di vivere più a lungo le mosche. (Per una maggiore comprensione della cura Drosophila e amplificazione, consultare Drosophila DB Roberts ': A Practical Approach 2).
Una buona fonte di ottenere grandi quantità di embrioni di Drosophila sono gabbie popolazione 3, che sono commercialmente disponibili. Il montaggio e la manutenzione delle gabbie popolazione può essere visto sul capitolo 5 e 7 nel libro Drosophila melanogaster: PUsi ractical nella cella e 4 Biologia Molecolare. Tuttavia, le gabbie di popolazione sono costosi e sono difficili da mantenere. Poiché gabbie popolazione può contenere una quantità abbondante di mosche, l'uso di anidride carbonica è necessaria per il trasferimento e di alimentazione mosche. Come affermato prima, biossido di carbonio diminuisce la salute delle mosche, inducendoli non prevedere anche. Su scala piccola, 100 ml bicchieri tricorni può essere utilizzato. Con cinquanta bicchieri 100 ml, 9 grammi di embrioni dechorionated può essere raggiunta. Per rimuovere le mosche morte, pasta di lievito inutilizzata e altre impurità che abbiamo creato un collettore a doppio strato setaccio con maglie di dimensioni diverse. Uno trappole setaccio materiali indesiderati, come mosche morte pur consentendo di passare attraverso gli embrioni (350 micron dimensione dei pori). La seconda parte contiene una mesh (120 micron dimensioni dei pori), che si propone di cogliere embrioni di Drosophila e altre impurità passeranno attraverso le maglie.
1. Vola Preparazione Cup e di raccolta di embrioni
- Lanciarele mosche amplificati da più flaconcini in un flacone di plastica vuota, fino a quando la quantità di mosche hanno raggiunto un pollice di altezza della fiala. Poi, trasferire quelle mosche in un uovo 100 ml di raccolta cup (bicchiere Tricon con nylon finestre a maglie). Tenere la coppa battendo su una superficie dura per impedire la fuga durante il trasferimento delle mosche mosche. Coprire tazza con pasta di lievito piastra contenente agar e consentire 24-48 ore di tempo di stabilizzazione.
- Raccogliere piastre di agar notte da cinquanta tazze mosca e lavare i contenuti delle piastre al catcher setaccio con un pennello pulito vernice e acqua corrente. Flesh gli embrioni nel setaccio con abbondante acqua fino a quando tutta la pasta di lievito viene lavato via.
- Dechorionate gli embrioni puliti immergendoli in 50% candeggina per 3 min.
- Sciacquare con acqua distillata molto fino a quando gli embrioni liberi l'odore di candeggina. Asciugare quindi la rete con gli embrioni mettendolo sui tempi di asciugamani piegati ac multipli. Trasferire gli embrioni in una fiala pulita e registrare il peso. </ Li>
2. Embryo Omogeneizzazione e Chiarimenti
- Mettere gli embrioni dechorionated in Dounce omogeneizzatore con 1,5 x volume di ghiaccio-freddo tampone di estrazione.
- Do 5 colpi con il pestello allentata. Aliquotare l'omogeneizzato in provette pulite. Centrifugare a 15000 g per 40 min. a 4 ° C.
- Raccogliere accuratamente il liquido chiaro sopranatante senza lo strato lipidico bianco superiore o inferiore del pellet.
- Trasferire il supernatante per pulire provette e centrifugare a 50.000 g per 30 min. a 4 ° C
- Risultante ad alta velocità supernatante raccolto come spiegato sopra possono essere utilizzati immediatamente o può essere scatto congelate e conservate a -80 ° C per mesi.
3. Microtubuli di polimerizzazione e Kinesin Binding
- Scongelare il congelate ad alta velocità supernatante a temperatura ambiente. Per polimerizzare microtubuli, aggiungere GTP (0,3 mM) e taxolo (20 pM) e agitare delicatamente a temperatura ambiente per 20 min inun agitatore rotante.
- Per associare chinesina, aggiungere 2,5 mM ATP nonhydrolyzable analogico 5'-ciclasi imidodiphosphate (AMPPNP), seguito da un'agitazione di 10 minuti a temperatura ambiente in un agitatore rotante.
4. Sedimentazione differenziale dei microtubuli e Kinesin
- Sedimento attraverso un cuscino uguale volume di saccarosio (20% di saccarosio e 10 pM taxolo in tampone di estrazione) tramite centrifugazione a 23.000 g (sw41ti rotore, TLS-55) per 30 min. a 4 ° C.
- Lavare pellet mediante risospensione in 10% dei volumi omogenato in tampone di estrazione contenente 10 taxolo pM e 75 mM NaCl.
- Ripetere la sedimentazione con un altro cuscino uguale volume di saccarosio come nel passaggio 4,1.
- Risospendere pellet di lavaggio sale in tampone di estrazione 5% con 20 pM taxolo, 75 mM NaCl, 10 mM MgSO 4, e 10 mM ATP.
- Sedimenti a 120.000 g (sw41ti rotore: 31.000 rpm, TLS-55: 42.000 rpm) per 20 minuti a 4 ° C. Raccogliere il surnatante (chinesinafrazione).
- Eseguire una filtrazione centrifuga a 14.000 g per 15 min a 4 ° C. Recupero campione concentrato e ripetere filtrazione con un filtro nuovo come sopra per 30 minuti e raccogliere il campione concentrato.
- Eseguire un saggio di proteina per determinare la concentrazione. Brevemente, variando le concentrazioni di una proteina nota (albumina sierica bovina; BSA) è stata miscelata con un volume noto di reagente di Bradford e misurata la densità ottica alla lunghezza d'onda di 595nm. Poi una densità ottica trattamento standard curva di concentrazione è stato stabilito per calcolare la concentrazione sconosciuta di chinesina frazione purificata utilizzando la densità ottica di questo campione misurato in condizioni simili a quella dei campioni standard di BSA. Gel elettroforesi nonché western blotting è stato effettuato anche una quantità nota della chinesina purificato.
- Chinesina frazione Aliquotare in piccoli volumi di concentrazione desiderata e congelare a scatto in azoto liquido per conservare a -80 ° C.
A tutta lunghezza Kinesina funzionale è stato purificato da embrioni di Drosophila. Figura 1 illustra il gel colorato argento mostra le frazioni differenti durante la purificazione. Corsia 1 è un esempio del surnatante dopo la chiarificazione alta velocità (passo 2,5), corsia 2 è un esempio di pellet dopo chiarificazione, corsia 3 è un esempio del surnatante dopo la sedimentazione primo cuscino saccarosio (punto 4.1), corsia 4 è un campione del pellet dopo la sedimentazione prima, corsia 5 è un esempio del surnatante dopo la sedimentazione secondo (passo 4,3), corsia 6 è un esempio di pellet dopo la sedimentazione secondo, corsia 7 è un esempio di pellet di la sedimentazione finale (punto 4.5), corsia 8 è il campione chinesina purificato, corsia 9 è il campione chinesina filtrato, e Lane 10 è il marcatore. La band concentrato sulla corsia di 8 e 9 a circa 115 kD è chinesina pesante catena 1, che è coerente con Figure 1, corsia 8 della carta Saxton pubblicato nel 1988 5. figura 2 rappresenta il blot c occidentale della frazione purificata chinesina rilevato usando l'anticorpo chinesina catena pesante. L'anticorpo AKINO1-A non influisce significativamente cross-reagiscono con gli altri membri della famiglia chinesina 6. Si noti che anche se questo protocollo si traduce in una buona fonte di chinesina funzionale, mentre la frazione è arricchito per kinesina-1, ci sono probabili agenti contaminanti, tra cui potenzialmente kinesine altre proteine a motore. Abbiamo rimosso una varietà di contaminanti più piccoli per filtrazione. Per quanto riguarda la rimozione altri motori che non può essere fatto da sola dimensione, la purificazione è simile a quanto fatto da altri per studiare chinesina 7, e crediamo che la maggioranza del motore attivo è Kinesina-1, ma la purificazione più sofisticati permetterebbe la rimozione di contaminanti motore potenziali, come è stato fatto da Cole et al 8 e Saxton et al. 9 La processività della chinesina è stata valutata mediante test in vitro microtubuli singola molecola legante, come descritto più in dettaglio nel libro di Scholey intitolato "Assay motilità per Motor Proteins" 10. Brevemente, perle di polistirene con un solo motore attivo sono stati portati in contatto con i microtubuli, in presenza di saturazione (1 mm) ATP. Il motore collegato al microtubulo, e cominciò a camminare di distanza dal centro della trappola laser. In un predefinito spostamento del tallone dal centro trappola (100 nm) la potenza del fascio laser è automaticamente disattivata, consentendo al motore a percorrere il MT sotto vuoto. Il film mostra un diametro di 500 nm tallone con chinesina singola a piedi lungo MT. La lunghezza della schermata video corrisponde a 20 micron. Figura 3 rappresenta la distribuzione misurata di run-lunghezze per singola lunghezza intera Drosophila molecole chinesina, purificato secondo il protocollo qui presentata. Il EXPOnential adatta alla distribuzione fornisce la runlength media singola chinesina 1,55 ± 0,1 micron e 1.28 ± 0.12 micron per il campione filtrato e non filtrato, rispettivamente.
Figura 1 gel colorato d'argento delle frazioni purificate:. Campioni provenienti da ciascuna frazione sono stati eseguiti in un gel al 10%. 10 pg di proteina è stato caricato in ciascuna corsia. Corsia 1 è un esempio del surnatante dopo la chiarificazione alta velocità (passo 2,5), corsia 2 è un esempio di pellet dopo chiarificazione, corsia 3 è un esempio del surnatante dopo la sedimentazione primo cuscino saccarosio (punto 4.1), corsia 4 è un campione del pellet dopo la sedimentazione prima, corsia 5 è un esempio del surnatante dopo la sedimentazione secondo (passo 4,3), corsia 6 è un esempio di pellet dopo la sedimentazione secondo, corsia 7 è un esempio di pellet di la sedimentazione finale (punto 4.5), corsia 8 è il chinesina purificatacampione, corsia 9 è la chinesina filtrato usando un 100 kD cut-off Amicon ultra filtro centrifugo 0,5 ml (Millipore, USA). Le frecce blu indicano le proteine i cui importi sono diminuiti e la freccia rossa indica la concentrazione degli chinesina a causa della fase di filtrazione centrifuga utilizzata nel presente protocollo.
. Figura 2 frazione purificata KHC cancellato contro l'anti-anticorpo chinesina: purificato campione chinesina stata sottoposta ad elettroforesi su gel e cancellati (in membrana di nitrocellulosa) contro l'anticorpo primario AKINO1-A (1:1000 in TBST) per 1 ora a temperatura ambiente seguita da incubazione in Donkey-anticorpo anti-coniglio (1:10.000 in TBST) per un'ora a temperatura ambiente. An (chemiluminescente) ECL kit è stato utilizzato per rilevare il segnale di chinesina mostrato sopra.
Figura 3. Drosophila completa: (A) e (B) RunLength e la velocità del campione chinesina filtrato. (C) e (D) runlength e la velocità di campione filtrato chinesina.
Figura 4. Video della motilità chinesina. Clicca qui per visualizzare il video .
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Discussion
Cervello bovino è il materiale più ampiamente usato per purificare partenza 11 full-length chinesina, sebbene cervello murina è stato usato come pure 12. Un grande svantaggio di utilizzare cervello bovino come fonte chinesina è la disponibilità di fresco materiale di partenza: macelli sono tipicamente inaccessibili, e il cervello deve essere estremamente fresca per ottenere chinesina attivo. Inoltre, solo il cervello dei giovani mucche sono efficaci. Infine, la manipolazione genetica delle vacche non è attualmente una valida opzione, in modo che solo 'wild-type' proteina può essere studiato.
I topi sono più accessibili, ma la raccolta del cervello di topo sta consumando un po 'difficile e il tempo come purificazione può richiedere più di 50 cervelli. Inoltre, il mantenimento di una colonia del mouse può essere molto costoso.
In contrasto con fonti bovina o murina, Drosophila ha un numero di vantaggi. In primo luogo, le mosche possono essere facilmente coltivate in laboratorio con un capitale minimo outlaici, e sono quindi facilmente accessibili. Drosophila laici prolifici embrioni, che sono facilmente raccolte come descritto qui. Poiché il genoma Drosophila può essere manipolato, e in effetti molte mosche mutanti sono ottenuti facilmente, entrambe le proteine wild-type e mutante può essere purificato, e grazie alla combinazione delle manipolazioni genetiche e un palmo generazione breve, più mutanti può essere isolato. Tuttavia, occorre notare che, a causa perdita completa della funzione chinesina è letale, proteine e negli embrioni sono fornite prevalentemente materna, non è possibile purificare mutanti chinesina puri che sono drammaticamente compromesso. Tuttavia, è possibile purificare proteine da embrioni eterozigoti (kin-Mut / +), e caratterizzare funzione della popolazione mista, e quindi potenzialmente riferiscono tali variazioni in funzione di fenotipi nell'animale.
L'alterazione o compromissione del trasporto sembra essere alla base di molte malattie neurodegenerative, tuttavia, il collegamento meccanicisticotra malattia e l'alterazione delle singola molecola la funzione (in seguito a mutazioni o di un ambiente di segnalazione alterato) non è chiaro. Il dosaggio purificazione della proteina sviluppato qui dovrebbe essere uno strumento importante nel perseguire questo comprensione, poiché una singola molecola saggi possono essere utilizzati per determinare i motori 'funzione. Combinando questi studi con la caratterizzazione in vivo dei fenotipi, e aiutato dalla modellazione, questo permette la determinazione diretta del rapporto tra alterando specifiche singole proprietà molecolari e malattie dello sviluppo / progressione (ad esempio, vedere il legame tra alterata funzione dynein singola molecola e alterata trasporto neuronale, in 13).
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Un ringraziamento speciale a Kris Ngai e Jason Del Rio per il loro sostegno e l'assistenza in questo progetto. Questo lavoro è stato supportato da RO1 concessione GM070676 di SPG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar (Granulated) | Fisher Scientific | 1423-500 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Petri Dishes | BD Biosciences | 35 1007 | 60x15mm Style (Polyester) 20/bag |
| Drosophila Culture Vials | UCI | ||
| Tricorn beaker | Econo Lab Inc. | B700-100 | Volume:100ml, size: 58x72mm |
| Yeast | Red Star | 2751 | |
| Nylon Mesh | Genesee Scientific | 57-102 | 120 micron pore size |
| Nylon Mesh | Small Parts, Inc. | 06-350/35 | |
| Pipes | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Pipes | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 67-42-5 | |
| MgS04(Anhydrous) | Fisher Scientific | 7487-88-9 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 329-98-6 | |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | 103476-89-7 | |
| Aprotonin | Sigma-Aldrich | 9087-70-1 | |
| TAME | Sigma-Aldrich | 178403-8 | |
| STI | Calbiochem | 65635 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | 36051-31-7 | |
| Taxol | Sigma-Aldrich | 33069-62-4 | |
| ATP analog 5’-adenylyl imidodiphosphate | Sigma-Aldrich | 3605-31-7 | |
| NaCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 7647-14-5 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 74804-12-9 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters: .5 mL, 100kD cut off, 8 pack | EMD Millipore | UFC510008 |
References
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