Summary
Dette er en protokoll for å isolere aktive full lengde kinesin fra
Abstract
Motor proteiner flytte cargos langs mikrotubuli, og transportere dem til spesifikke sub-cellulære steder. Fordi endret transport er foreslått å ligge til grunn en rekke nevrodegenerative sykdommer, forstå microtubuli basert motor transport og regulering vil sannsynligvis til slutt føre til bedre terapeutiske tilnærminger. Kinesin-1 er en eukaryot motor protein som beveger seg i en anterograd (pluss-end) retning langs mikrotubuli (MTS), drevet av ATP hydrolyse. Her rapporterer vi en detaljert renselse protokoll for å isolere aktive i full lengde kinesin fra Drosophila embryo, og dermed gir kombinasjonen av Drosophila genetikk med enkelt-molekyl biofysiske studier. Fra og med ca 50 legging kopper, med om lag 1000 kvinner per kopp, gjennomførte vi over natten samlinger. Dette ga ca 10 ml pakket embryoer. Embryoene var blekemiddel dechorionated (som gir ca 9 gram embryo), og deretter homogenisert. AfTer avbrudd, ble homogenat avklart med en lav hastighet spin etterfulgt av en høy hastighet sentrifugering. Den avklart supernatanten ble behandlet med GTP og taxol til Polymeriserer MTS. Kinesin ble immobilisert på polymerisert MTS ved å legge til ATP analog, 5'-adenylat imidodiphosphate ved romtemperatur. Etter kinesin bindende, ble mikrotubuli sedimenteres via høyhastighets sentrifugering gjennom en sukrose pute. Den microtubuli pellet ble deretter re-suspendert, og denne prosessen ble gjentatt. Til slutt ble ATP lagt for å frigjøre kinesin fra MTS. Høy hastighet sentrifugering deretter spunnet ned MTS, forlater kinesin i supernatanten. Dette kinesin ble utsatt for en sentrifugal filtrering ved hjelp av en 100 KD cut off filter for ytterligere rensing, alikvoteres klem frosset i flytende nitrogen og oppbevart ved -80 ° C. SDS gel elektroforese og western blotting ble utført ved hjelp av renset prøven. Motoren aktivitet av renset prøver før og etter finalen sentrifugal filtrering trinnble evaluert med en in vitro enkelt molekyl microtubuli analysen. De kinesin fraksjoner før og etter sentrifugal filtrering viste processivity som tidligere er rapportert i litteraturen. Videre forsøk er underveis for å vurdere samspillet mellom kinesin og andre transportrelaterte proteiner.
Protocol
Stammer av fluer kan kjøpes og forsterkes i laboratoriet. Avhengig av mengden Drosophila kultur hetteglass mottatt, må man ofte 'Flip' kulturindustrien hetteglass, når flaskene har nådd maksimal kapasitet. Forsterkningen fortsetter inntil ca 50 Drosophila kultur hetteglassene er fylt. En gjør deretter 'fly kopper "med 100 ml tricorn begerglass (Fly kopp making drøftes i neste avsnitt). Etter 24 timer, kan du bruke embryoer fra disse kopper til såkorn nye Drosophila kultur hetteglass med festet flua mat på bunnen. Ved romtemperatur, veksten tid for Drosophila embryoer fra overnattingsturer embryo til fullvoksen fluer er ca 8,5 dager. Seeded embryoer klekkes etter 12-15 timer inn i første larvene scenen. Larvene vokser i ca 4 dager molting to ganger inn i andre og tredje larver scenen, på 24 og 48 timer etter klekking. Larvene deretter kapsle inn pupariums og sender til en 4 dagers metamorfose til dukker opp fra tarvingen pupal tilfelle 1. Tillate mer vekst i cirka to til tre dager i Drosophila kultur hetteglassene å øke mengden av fluer i hver. Når 400 ampuller er fylt opp, vil det være en tilstrekkelig mengde av fluer for femti egglegging kopper (ca 1000 kvinnelige fluer per kopp). Fluer trenger tid til å tilpasse seg sitt nye miljø. Det tar vanligvis ca to dager for dem å være klar for innsamling, etter å ha blitt overført til koppene. Skifte agar plater daglig vil holde flua kopper ren, noe som gjør fluene til å leve lenger. (For ytterligere forståelse av Drosophila omsorg og forsterkning, vennligst se DB Roberts 'Drosophila: A Practical Approach to).
En god kilde for å få store mengder Drosophila embryoer er befolkning bur 3, som er kommersielt tilgjengelig. Montering og vedlikehold av befolkningen bur kan ses på kapittel 5 og 7 i boka Drosophila melanogaster: Practical bruksområder i celle-og molekylærbiologi 4. Men befolkningen merder er dyrt og vanskelig å vedlikeholde. Siden befolkningen merder kan holde en rikelig mengde fluer, er bruken av karbondioksid nødvendig for overføring og fôring fluer. Som nevnt før, synker karbondioksid helsen fluene, forårsaker dem ikke til å legge også. På en liten skala, kan 100 ml tricorn begre brukes. Med femti 100 ml begerglass, kan 9 gram dechorionated embryo oppnås. For fjerne døde fluer, ubrukt gjær lime og andre urenheter vi har laget en dobbel lagdelte sil catcher med forskjellige maskevidde. En sil feller uønskede materialer som døde fluer mens du lar embryoer kan passere (350 micron porestørrelse). Den andre delen inneholder en mesh (120 mikron porestørrelse), som er ment å fange Drosophila embryoer og andre urenheter vil passere gjennom mesh.
1. Fly Cup Forberedelse og Embryo Collection
- FlipDen forsterkede fluene fra flere hetteglass i en tom plast flaske, før mengden av fluer har nådd en tomme på hetteglasset høyde. Deretter overføre disse fluer i en 100 ml egg samling kopp (Tricon beger med nylon mesh vinduer). Fortsett å banke koppen på et hardt underlag for å forhindre utslipp av fluene ved overføring fluer. Dekk kopp med agar plate som inneholder gjær pasta og la 24-48 timer med stabilisering tid.
- Samle overnattingsturer agar plater fra femti fluefiskere kopper og vaske innholdet i platene til silen catcher med en ren pensel og rennende vann. Flesh embryoene i silen med rikelig med vann til all gjær pasta blir vasket bort.
- Dechorionate de rensede embryoene ved å dyppe dem i 50% blekemiddel for 3 min.
- Skyll med destillert vann grundig før embryoer løse blekemiddel lukt. Tørk mesh med embryoer ved å plassere den på ac fold håndkle flere ganger. Overfør embryoene til et rent hetteglass og registrere vekt. </ Li>
2. Embryo Homogenisering og Avklaring
- Plasser dechorionated embryoer i Dounce homogenizer med 1,5 x volum iskald utvinning buffer.
- Gjør 5 slag med løs stampe. Delmengde den homogenat til rene sentrifugerør. Sentrifuger til 15.000 g for 40 min. ved 4 ° C.
- Samle forsiktig klar supernatant væske uten øvre hvite lipid lag eller lavere pellet.
- Overfør supernatanten å rengjøre sentrifugerør og sentrifuger ved 50 000 g for 30 min. ved 4 ° C
- Resulterende høy hastighet supernatanten samlet som forklart ovenfor kan brukes umiddelbart eller kan være knipse frosset og lagret ved -80 ° C i månedsvis.
3. Microtubuli Polymerisasjon og kinesin Binding
- Tine den frosne høyhastighets supernatanten til romtemperatur. For å polymerisere mikrotubuli, legg GTP (0,3 mm) og taxol (20 mm) og agitere forsiktig ved romtemperatur i 20 min ien roterende shaker.
- For å binde kinesin legge 2,5 mm nonhydrolyzable ATP analog 5'-adenylat imidodiphosphate (AMPPNP), etterfulgt av en 10 min uro ved romtemperatur i en roterende shaker.
4. Differensiert Sedimentering av mikrotubuli og kinesin
- Sediment gjennom et likt volum sukrose pute (20% sukrose og 10 mM taxol i utvinning buffer) ved sentrifugering på 23 000 g (sw41ti rotor, TLS-55) i 30 min. ved 4 ° C.
- Vask pellet ved resuspensjon i 10% av opprinnelig homogenat volum i utvinning buffer som inneholder 10 mM taxol og 75 mM NaCl.
- Gjenta sedimentering med en annen lik volum sucrose pute som i trinn 4.1.
- Re-suspendere pellet fra salt vask i 5% utvinning buffer med 20 mM Taxol, 75 mM NaCl, 10 mM MgSO 4, og 10 mM ATP.
- Sedimentene på 120 000 g (sw41ti rotor: 31 000 rpm, TLS-55: 42 000 rpm) for 20 minutter ved 4 ° C. Samle supernatanten (kinesinfraksjon).
- Utfør en sentrifugal filtrering på 14 000 g for 15 min ved 4 ° C. Recover konsentrert prøven og gjenta filtrering med et nytt filter som ovenfor i 30 minutter og samle konsentrerte prøven.
- Utfør et protein assay for å bestemme konsentrasjonen. Kort, varierende konsentrasjoner av en kjent protein, ble (bovint serum albumin BSA) blandet med et kjent volum av Bradford reagens og målte optisk tetthet på bølgelengde 595nm. Så en optisk tetthet versus konsentrasjonen standardkurve ble etablert for å beregne den ukjente konsentrasjonen av renset kinesin fraksjon med optisk tetthet på denne prøven måles under lignende forhold som for standard BSA prøvene. Gel elektroforese samt vestlige blotting ble også utført med en kjent mengde av renset kinesin.
- Delmengde kinesin brøkdel i små mengder ønsket konsentrasjon og smekk fryse i flytende nitrogen til å lagre ved -80 ° C.
Full-lengde funksjonell kinesin ble renset fra Drosophila embryo. Figur 1 viser det sølv stained gel som viser de ulike fraksjonene under rensing. Lane 1 er et eksempel på høy hastighet supernatanten etter avklaring (trinn 2,5), er kjørefelt 2 en prøve av pellets etter avklaring, er kjørefelt 3 en prøve av supernatanten etter første sedimentering med sukrose pute (trinn 4,1), kjørefelt 4 er en prøve av pellets etter den første sedimentering, er kjørefelt 5 et utvalg av supernatanten etter den andre sedimentering (trinn 4,3), er kjørefelt 6 en prøve av pellets etter den andre sedimentering, er kjørefelt 7 en prøve av pellet av den endelige sedimentering (trinn 4,5), 8 kjørefelt er renset kinesin prøven, er kjørefelt 9 den filtrerte kinesin prøven, og kjørefelt 10 er markøren. Den konsentrerte band i kjørefelt 8 og 9 på rundt 115 kD er kinesin en tung-kjeden, som er konsistent med Figur1 e, 8 kjørefelt av Saxton artikkel publisert i 1988 5. Figur 2 representerer c Western blot av renset kinesin brøkdel oppdages ved hjelp av kinesin tunge kjeden antistoff. Antistoffet AKINO1-A ikke signifikant kryssreagerer med andre kinesin familiemedlemmer 6. Merk at selv om denne protokollen resulterer i en god kilde til funksjonell kinesin, mens andelen er beriket for kinesin-en, er det sannsynlige forurensninger, inkludert potensielt andre kinesins og andre motoriske proteiner. Vi fjernet en rekke mindre forurensninger ved filtrering. Såvidt fjerne andre motorer som ikke kan gjøres av størrelsen alene, er det renselse lik det som ble gjort av andre å studere kinesin 7, og vi tror at flertallet av den aktive motor er kinesin-1, men mer sofistikert rensing ville tillate fjerning av potensielle motoriske miljøgifter, slik som ble gjort av Cole m.fl. 8 og Saxton et al. 9 Den processivity av kinesin ble evaluert av in vitro enkelt molekyl microtubuli bindende analysen, som beskrevet i mer detalj i boken med Scholey tittelen "motilitet Assay for Motor Proteiner" 10. Kort, ble isopor perler med en enkelt aktiv motor bringes i kontakt med microtubuli, i nærvær av mette (1 mm) ATP. Motoren festet til microtubuli, og begynte å gå bort fra midten av laser fellen. På et forhåndsdefinert forskyvning av perlen fra fellen sentrum (100 nm) laserstrålen strømmen ble automatisk slått av, slik at motoren å gå langs MT under noen belastning. Filmen viser en 500 nm diameter perle med singel kinesin vandre langs MT. Lengden på videoskjermen tilsvarer 20 mikrometer. Figur 3 representerer den målte fordelingen av run-lengder for enslige helaftens Drosophila kinesin molekyler, renset i henhold til protokollen som presenteres her. Den exponential passer til fordeling gir den gjennomsnittlige runlength av single kinesin 1,55 ± 0,1 mikrometer og 1.28 ± 0.12 mikrometer for filtrert og ufiltrert prøve henholdsvis.
Figur 1 Silver beiset gel av de rensede fraksjoner:. Samples fra hver fraksjon ble kjørt i en 10% gel. 10 mikrogram av protein ble lagt i hvert kjørefelt. Lane 1 er et eksempel på høy hastighet supernatanten etter avklaring (trinn 2,5), er kjørefelt 2 en prøve av pellets etter avklaring, er kjørefelt 3 en prøve av supernatanten etter første sedimentering med sukrose pute (trinn 4,1), kjørefelt 4 er en prøve av pellets etter den første sedimentering, er kjørefelt 5 et utvalg av supernatanten etter den andre sedimentering (trinn 4,3), er kjørefelt 6 en prøve av pellets etter den andre sedimentering, er kjørefelt 7 en prøve av pellet av den endelige sedimentering (trinn 4,5), 8 kjørefelt er renset kinesinutvalget, er kjørefelt 9 den filtrerte kinesin hjelp av en 100 kD cut-off Amicon ultra 0,5 ml sentrifugalfilter (Millipore, USA). De blå pilene viser de proteinene som beløpene ble redusert og den røde pilen indikerer konsentrasjonen av kinesin grunn av sentrifugalkraften filtrering trinnet brukt i denne protokollen.
. Figur 2 Renset KHC brøkdel strøket mot anti-kinesin antistoff: Renset kinesin prøven ble utsatt for gelelektroforese og utslettet (i nitrocellulose membran) mot primær antistoff AKINO1-A (1:1,000 i TBST) i 1 time ved romtemperatur etterfulgt av inkubasjon i Donkey-anti-kanin antistoff (1:10,000 i TBST) for en time ved romtemperatur. En ECL (kjemiluminescens) kit ble brukt til å detektere kinesin signal vist ovenfor.
Figur 3. Drosophila full lengde kinesin: (A) og (B) Runlength og Velocity av filtrert kinesin prøven. (C) og (D) Runlength og hastighet av ufiltrert kinesin prøven.
Figur 4. Video av kinesin motilitet. Klikk her for å vise video .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bovine hjernen er den mest brukte utgangsmaterialet 11 til rense full lengde kinesin skjønt murine hjerne har blitt brukt som vel 12. En stor ulempe med å bruke bovin hjerne som en kinesin kilde er tilgjengeligheten av fersk utgangsmaterialet: slakterier er vanligvis utilgjengelige, og hjernen må være ekstremt ferske for å få aktiv kinesin. Videre, bare hjernen til unge kyr er effektive. Endelig er genetisk manipulering av kyr i dag ikke et levedyktig alternativ, så kan bare "vill-type 'protein bli studert.
Mus er mer tilgjengelig, men høsting murine hjerne er litt vanskelig og tidkrevende som rensing kan kreve mer enn 50 hjerner. Videre kan opprettholde en mus koloni være ganske dyrt.
I motsetning til storfe eller murine kilder, har Drosophila en rekke fordeler. Først kan fluene lett dyrkes i laboratoriet med minimal kapital utlå, og er dermed lett tilgjengelig. Drosophila lå profilerte embryo, som er lett høstes som beskrevet her. Fordi Drosophila genome kan manipuleres, og faktisk mange muterte fluer er lett skaffes, kan både villtype og mutant proteiner bli renset, og på grunn av kombinasjonen av genetiske manipulasjoner og en kort generasjon span, kan flere mutanter isoleres. Imidlertid bør det bemerkes at det på grunn fullstendig tap av kinesin funksjon er dødelig, og protein i embryoer gis hovedsakelig mordyr, det er ikke mulig å rense rene kinesin mutanter som er dramatisk svekket. Likevel er det mulig å rense protein fra heterozygote embryoer (KIN-mut / +), og karakteriserer funksjon av blandet befolkning, og deretter potensielt fortelle om slike endringer i funksjon til fenotyper i dyret.
Endring eller svekkelse av transport synes å ligge til grunn mange nevrodegenerative sykdommer, men det mekanistiske koblingenmellom sykdom og endring av single-molekyl funksjon (enten skyldes mutasjoner eller en endret signaler miljø) er uklart. Den proteinrensing analyse utviklet her bør være et viktig verktøy i å forfølge denne forståelsen, fordi enkelt-molekyl-analyser kan brukes til å bestemme motorene "funksjon. Ved å kombinere slike studier med in vivo karakterisering av fenotyper, og hjulpet av modellering, gir dette direkte bestemmelse av forholdet mellom forandre spesifikke single molekylære egenskaper og sykdom utvikling / progresjon (som et eksempel, se sammenhengen mellom endrede single-molekyl dynein funksjon og nedsatt nevrale transport, i 13).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Spesiell takk til Kris Ngai og Jason Del Rio for deres støtte og hjelp i dette prosjektet. Dette arbeidet ble støttet av RO1 bevilgning GM070676 til SPG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar (Granulated) | Fisher Scientific | 1423-500 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Petri Dishes | BD Biosciences | 35 1007 | 60x15mm Style (Polyester) 20/bag |
| Drosophila Culture Vials | UCI | ||
| Tricorn beaker | Econo Lab Inc. | B700-100 | Volume:100ml, size: 58x72mm |
| Yeast | Red Star | 2751 | |
| Nylon Mesh | Genesee Scientific | 57-102 | 120 micron pore size |
| Nylon Mesh | Small Parts, Inc. | 06-350/35 | |
| Pipes | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Pipes | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 67-42-5 | |
| MgS04(Anhydrous) | Fisher Scientific | 7487-88-9 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 329-98-6 | |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | 103476-89-7 | |
| Aprotonin | Sigma-Aldrich | 9087-70-1 | |
| TAME | Sigma-Aldrich | 178403-8 | |
| STI | Calbiochem | 65635 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | 36051-31-7 | |
| Taxol | Sigma-Aldrich | 33069-62-4 | |
| ATP analog 5’-adenylyl imidodiphosphate | Sigma-Aldrich | 3605-31-7 | |
| NaCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 7647-14-5 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 74804-12-9 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters: .5 mL, 100kD cut off, 8 pack | EMD Millipore | UFC510008 |
References
- Ashburner, M., Thompson, J. N. The laboratory culture of Drosophila 2A. The genetics and biology of Drosophila. Ashburner, M., Wright, T. R. F. , Academic Press. 1-81 (1978).
- Roberts, D. B. Drosophila: A Practical Approach. , Oxford University Press. (1998).
- Kunert, N., Brehm, A. Mass production of Drosophila Embryosand Chromatographic Purification of Native Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 420, 359 (2008).
- Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A., Wilson, L., Matsudaira, P. T., Eds, Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. 44, (1994).
- Saxton, W. M. Drosophila kinesin: Characterization of microtubule motility and ATPase. Proceedings of the National Academy of Science. 85, 1109 (1988).
- Shubeita, G. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1098 (2008).
- Svoboda, K., Block, S. M. Force and Velocity Measured for Single Kinesin Molecules. Cell. 77, 773 (1994).
- Cole, D. G., Saxton, W. M., Sheehan, K. B., Scholey, J. M. A "Slow" Homotetrameric Kinesin-related Motor Protein Purified from Drosophila embryos. J. Biol. Chem. 269, 22917-22917 (1994).
- Saxton, W. M. Isolation and Analysis of Microtuble Motor Proteins. Drosophila Melanogaster. Bloomington: Academic. 44, 279 (1994).
- Scholey, J. Motility Assay for Motor Proteins. Methods in Cell Biology. 39, 138 (1993).
- Wagner, M. C., Pfister, K., Brody, S., Bloom, G. Purification of kinesin from bovine brain and assay of microtubule-stimulated ATPase activity. Methods in Enzymology. 196, 157 (1991).
- Aizawa, H. Kinesin Family in Murine Nerwous System. The Journal of Cell Biology. 119, 1287-1287 (1992).
- Ori-McKenney, K. M., Xu, J., Gross, S. P., Vallee, R. B. A cytoplasmic dynein tail mutation impairs motor processivity. Nature Cell Biology. 12, 1228-1228 (2010).
