Summary
Bu aktif tam uzunlukta kinesin izole bir protokoldür
Abstract
Motor proteinleri mikrotübüllerin boyunca yükler taşımak ve belirli alt-hücresel bir yere taşırlar. Değişmiş ulaşım mikrotübül dayalı motorlu taşıtlar ve düzenlenmesi anlamak, nörodejeneratif hastalıklar çeşitli altında yatan önerilmektedir Çünkü muhtemelen sonuçta daha iyi terapötik yaklaşımlara yol açacaktır. Kinesin-1 ATP hidrolizi powered by mikrotübüllerin (MTS) boyunca bir anterograd (artı uç) yönünde, içinde hareket eden bir ökaryotik motoru proteindir. İşte biz böylece tek-molekül biyofiziksel çalışmalarla Drosophila genetiği kombinasyonu sağlayan, Drosophila embriyo aktif tam uzunlukta kinesin izole etmek için ayrıntılı bir arıtma protokolü sunduk. Fincan başına yaklaşık 1000 kadın ile birlikte, yaklaşık 50 yumurta kapları ile başlayarak, biz bir gecede koleksiyonları yürütülmektedir. Bu paketlenmiş embriyoların yaklaşık 10 ml sağladı. Embriyo (embriyonun yaklaşık 9 gram kadar) dechorionated çamaşır suyu vardı ve sonra homojenize. After bozulması, Homojenat yüksek hızlı santrifüj düşük hızlı dönüş kullanılarak açıklanabilir. Açıklık süpernatan MTs polimerize etmek GTP ve taksol ile muamele edildi. Kinesin ATP analog, oda sıcaklığında, 5'-adenilat imidodiphosphate ekleyerek polimerize MTs üzerinde hareketsiz kılındı. Kinesin bağlandıktan sonra, mikrotübüllerin bir sükroz yastık aracılığıyla yüksek hızda santrifüj ile çöktürülmüştür. Mikrotübül pelet daha sonra yeniden süspansiyon haline getirildi, ve bu işlem tekrarlanmıştır. Son olarak, ATP MTS kinesin serbest bırakmak için ilave edildi. Yüksek hızlı santrifüjleme sonra üstte yüzen madde içindeki kinesin bırakarak, MTs aşağı doğru bükülmüş. Bu kinesin daha arıtılması için bir filtre 100 KD kesme kapalı bir santrifüj kullanılarak filtrasyon tabi tutuldu bölünüp, sıvı nitrojende dondurulmuş ve -80 ° C'de saklanır kapandığından Blotting SDS jel elektroforezi ve batı arıtılmış örnek kullanılarak gerçekleştirildi. Nihai santrifüj süzme aşaması önce ve sonra saflaştırılmış örneklerin motor aktivitein vitro tek bir molekül mikrotübül tayininde kullanılarak değerlendirilmiştir. Daha önce literatürde rapor edilen merkezkaç filtrasyon öncesi ve sonrası kinesin fraksiyonlar processivity gösterdi. Ayrıca deneyler kinesin ve diğer ulaşım ilgili proteinler arasındaki etkileşimi değerlendirmek için çalışmalar devam etmektedir.
Protocol
Sineklerin Suşlarının satın laboratuarda çoğaltılabilir. Alınan Drosophila kültür şişeleri miktarına bağlı olarak, bir zamanlar sık sık şişeleri maksimum kapasiteye ulaşmış, kültür şişeleri 'çevirmek' gerekir. Yaklaşık 50 Drosophila kültür şişeleri dolana kadar amplifikasyon devam eder. Kişi o zaman (kupa alma Fly sonraki bölümde ele alınmıştır) 100 ml bardak ile tricorn fincanları uçmak 'yapar. 24 saat sonra, altta yapıştırılmış sinek gıda ile bu kupalarda tohum yeni Drosophila kültür şişeleri için embriyolar kullanın. Oda sıcaklığında, gece embriyo tam büyüdü sinekler için Drosophila embriyo için büyüme zamanı yaklaşık 8,5 gün vardır. Tohumlu embriyoların ilk larva aşamasında içine 12-15 saat sonra yumurtadan çıkar. Larva yaklaşık 4 gün Yumurtadan çıktıktan sonra 24 ve 48 saat, ikinci ve üçüncü larva aşamasında içine iki kez tüy dökme için büyür. Larvalar daha sonra pupariums içine saklanması ve t çıkan kadar 4 günlük bir metamorfoz teslimvarisi pupa durumlarda 1. Her sinek miktarını artırmak için Drosophila kültür şişeleri üç yaklaşık iki gün için daha fazla büyümesi için izin verin. 400 şişe dolu olduğunda, elli yumurtlama bardak (fincan başına 1,000 Hakkında erkek sineklerin) için sinekler yeterli miktarda olacaktır. Sinekler onların yeni ortama uyum için zamana ihtiyacım var. Genellikle bardak devredildikten sonra, koleksiyon için hazır olmak onlar için iki gün sürer. Günlük agar Değiştirilmesi sinekler daha uzun yaşamak için izin verir, sinek bardak temiz tutacağız. (Drosophila bakım ve amplifikasyon daha iyi anlaşılması için, DB Roberts 'Drosophila bakınız: Pratik Bir Yaklaşım 2).
Drosophila embriyo büyük miktarda elde etmek için iyi bir kaynak ticari olarak mevcuttur nüfusu kafeslerde 3, bulunmaktadır. Nüfus kafeslerinin montaj ve bakım kitabı Drosophila melanogaster bölüm 5 ve 7 görülebilir: PHücre ve Moleküler Biyoloji 4 ractical Kullanımlar. Ancak, nüfus kafesleri pahalı ve bakımı zordur. Nüfusu kafeslerde sinekler bir bol miktarda içerebilir beri, karbon dioksit kullanımı sinekler aktarma ve beslemek için gereklidir. Daha önce de belirtildiği gibi, karbondioksit gibi bakmamasını bunları neden, sineklerin sağlık azaltır. Küçük bir ölçekte, 100 ml'lik beher tricorn kullanılabilir. Elli 100 ml bardak ile dechorionated embriyoların 9 gram elde edilebilir. Amacıyla biz farklı örgü boyutları ile çift katmanlı bir elek alıcı oluşturduğunuz ölü sinek, kullanılmayan maya yapıştırın ve diğer yabancı maddeleri kaldırmak. Ölü sinek gibi bir elek tuzakları istenmeyen malzeme embriyolar (350 mikron gözenek boyutu) geçmesine izin verirken. İkinci bölümde örgü geçecek Drosophila embriyo ve diğer kirlilikler yakalamak için bir anlamı olan bir kafes (120 mikron gözenek boyutu) içerir.
1. Kupası Hazırlık ve Embriyo Toplama Fly
- ÇevirmekBoş bir plastik bir şişeye birden flakonlarından amplifiye sinekler, dek sinekler miktarı şişeye yüksekliği bir inç ulaşmıştır. Sonra, bir 100 ml yumurta toplama kabı (naylon örgü pencereli Tricon beher) içine bu sinekler aktarın. Sinekler aktarırken sineklerin kaçmasını önlemek için sert bir yüzeye fincan dokunmaya devam edin. Agar içeren maya hamuru ile kap kapak ve sabitleme süresi 24-48 saat bekleyin.
- Elli sinek kupalarda gece agar toplayın ve temiz bir fırça ve su kullanarak elek alıcı için plakalar içeriğini yıkayın. Flesh tüm maya hamur bol su ile elek embriyolar yıkanıp kadar.
- 3 dakika boyunca% 50 çamaşır suyu onları daldırarak temizlenir embriyolar Dechorionate.
- Embriyoların suyu kokusu gevşek kadar yaygın distile su ile durulayın. Sonra ac kat havlu birden çok kez yerleştirerek embriyolar ile örgü kurulayın. Temiz bir şişeye aktarın ve embriyolar ağırlığı kaydetmek. </ Li>
2. Embriyo Homojenizasyon ve Açıklama
- Buz gibi soğuk ekstraksiyon tamponu 1.5 x hacmi ile Dounce homojenleştiricide dechorionated embriyo yerleştirin.
- Gevşek havaneli 5 vuruş yapın. Temiz santrifüj tüplerine tablet Homojenat. 40 dakika boyunca 15.000 g'de santrifüje. 4 ° C.
- Üst beyaz lipit tabakası veya alt pelet olmadan yüzen berrak sıvı dikkatlice topluyoruz.
- Santrifüj tüplerine temizlemek ve 30 dakika 50.000 g de santrifüj süpernatant aktarın. 4 ° C'de
- Yukarıda açıklandığı gibi, toplanan çıkan yüksek hızlı süpernatant hemen kullanılabilir veya ay için dondurulmuş ve -80 ° C'de saklandı oturtun olabilir.
3. Mikrotubul Polimerizasyon ve kinesin Bağlama
- Oda sıcaklığına kadar donmuş yüksek hızda süpernatan çözünmesi. , Mikrotübüllerin polimerize GTP (0.3 mM) ve taksol (20 uM) ekleyin ve 20 dakika için oda sıcaklığında yavaşça karıştırmaDöner çalkalayıcı.
- Kinesin bağlamak için, döner bir çalkalayıcı içinde oda sıcaklığında 10 dakika karıştırma izledi 2.5 mM ATP nonhydrolyzable analog 5'-adenilat imidodiphosphate (AMPPNP), ekleyin.
4. Mikrotubul ve kinesin Diferansiyel Sedimentasyon
- 30 dakika boyunca 23.000 g (sw41ti rotor, TLS-55) santrifüj ile eşit hacimde bir sükroz tampon (ekstraksiyon tampon içinde% 20 sukroz ve 10 uM taksol) vasıtasıyla katı madde. 4 ° C.
- 10 uM Taksol ve 75 mM NaCl içeren ekstraksiyon tamponu orijinal homojenatında hacminin% 10 tabanda tarafından pelet yıkayın.
- Adım 4.1 gibi başka bir eşit miktarda sükroz yastık sedimantasyon tekrarlayın.
- 20 uM taksol, 75 mM NaCl, 10 mM MgSO 4, ve 10 mM ATP ile% 5 ekstraksiyon tampon tuzu yıkama gelen pelet tekrar askıya.
- 4 az 20 dakika ° C 120.000 g (42.000 rpm: 31.000 rpm, TLS-55 sw41ti rotor) de Tortu Supernatant (kinesin toplayınkesir).
- 4 de 15 dakika boyunca 14.000 g'de santrifüj filtrasyon ° C. gerçekleştirmek Konsantre örnek Kurtar ve 30 dakika boyunca yukarıdaki gibi yeni bir filtre ile filtrasyon tekrarlayın ve konsantre örnek toplamak.
- Konsantrasyonunu belirlemek için, bir protein metodu gerçekleştirmek. Kısaca, bilinen bir protein konsantrasyonları değişen (sığır serumu albümini; BSA) Bradford reaktifin, bilinen bir hacmi ile karıştırılır ve dalgaboyu 595nm de optik yoğunluk ölçüldü. Sonra bir optik yoğunluk karşısında konsantrasyon standart eğri standart BSA örneklerinin olduğu gibi benzer koşullar altında ölçülen bu örnek optik yoğunluk kinesin fraksiyonu saflaştırılmış bilinmeyen konsantrasyonu hesaplamak için kurulmuştur. Jel elektroforezi gibi Western blot da saflaştırılmış kinesin bilinen bir miktarda kullanılarak gerçekleştirildi.
- Sıvı azot içerisinde istenen konsantrasyon ve erken donma küçük birimlere tablet kinesin fraksiyonu -80 de saklamak için ° C
Tam uzunluktaki işlevsel kinesin Drosophila embriyosu saflaştırıldı. Şekil 1 saflaştırılması sırasında farklı fraksiyonlar gösteren gümüş lekeli jel tasvir etmektedir. Lane 1 açıklama sonrasında yüksek hızlı supernatant (Adım 2.5) bir örnek olduğunu, şeritli 2 açıklama sonrası pelet bir örnek, şerit 3, sakaroz minder ile ilk sedimantasyon (adım 4.1) sonra 4 şeritli süpernatant bir örnek pelet bir örnek ilk sedimentasyon sonra şeritli 5 ikinci sedimantasyon (adım 4.3) sonra süpernatant bir örnek olup, 6 şeritli ikinci sedimantasyon sonrası pelet bir örnek, şerit 7 pelet bir örnek son çökeltme (adım 4.5), şerit 8 saflaştırılmış kinesin örnek, şerit 9 filtre kinesin örnektir ve şerit 10 göstergesidir. 115 etrafında kD az şeritli 8 ve 9'da konsantre grubu Figür ile tutarlıdır kinesin ağır zincirinin 1, olduğue 1, 1988 5 yayınlanan Saxton kağıt şerit 8. Şekil 2 saflaştırılmış kinesin fraksiyonu c western blot temsil kinesin ağır zincir antikor kullanarak algılandı. Antikor AKINO1-A tedavisi diğer kinesin aile üyeleri 6 ile çapraz reaksiyon vermez. Not olduğu halde fraksiyonu kinesin-1 için zenginleştirilmiş iken, diğer potansiyel olarak kinesins ve diğer motor proteinler de dahil olmak üzere kirletici olasılığı vardır, fonksiyonel kinesin iyi bir kaynak Bu protokol sonuçlar,. Biz, filtrasyon ile daha küçük bir kirletici maddeler, çeşitli çıkarıldı. Bildiğim kadarıyla sadece büyüklüğü ile yapılması mümkün olmayan diğer motorlar kaldırarak olarak, arıtma kinesin 7 çalışmak için başkaları tarafından yapıldığını ne benzer olduğunu ve aktif motor çoğunluğu kinesin-1 olduğuna inanıyoruz, ama daha gelişmiş arıtma sağlayacak Bu tür potansiyel olarak motorun kirletici maddeler, uzaklaştırılması Cole ve ark 8 ve Saxton ve arkadaşları tarafından yapılmıştır. 9 Kinesin ve processivity olarak "Motor Proteinler için Motilite Testi" başlıklı 10 Scholey tarafından kitapta daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır vitro tek bir molekül mikrotübül bağlanma analizi, içinde değerlendirilmiştir. Kısaca, bir tek aktif motor ile polistiren boncuklar satüre varlığında (1 mm) ATP, mikrotübül ile temas haline getirildi. Motor mikrotübül bağlı ve lazer tuzak merkezinden uzağa yürümeye başladı. Tuzak merkezi (100 nm) boncuk önceden tanımlanmış bir deplasman lazer ışınının gücünü otomatik motorda yük altında MT yürümek için izin kapatıldı. Film MT yürürken tek kinesin ile boncuk, 500 nm çaplı gösterir. Video ekran uzunluğu 20 um karşılık gelir. Şekil 3 burada sunulan protokolüne göre arıtılmış, tek bir tam uzunlukta Drosophila kinesin molekülleri için çalışma-uzunlukları ölçülen dağılımını temsil eder. Exponential dağılımına uyacak tek kinesin 1.55 ortalama geçiş-uzunluklu ± 0.1 mikron ve 1.28 ± filtre ve filtre uygulanmamış örnek için 0.12 mikron sırasıyla sağlar.
Şekil 1 saflaştırılmış fraksiyonların gümüş lekeli jel:. Numuneler her fraksiyondan% 10 jelde yürütüldü. Protein 10 mg her kulvarın yüklenmiş. Lane 1 açıklama sonrasında yüksek hızlı supernatant (Adım 2.5) bir örnek olduğunu, şeritli 2 açıklama sonrası pelet bir örnek, şerit 3, sakaroz minder ile ilk sedimantasyon (adım 4.1) sonra 4 şeritli süpernatant bir örnek pelet bir örnek ilk sedimentasyon sonra şeritli 5 ikinci sedimantasyon (adım 4.3) sonra süpernatant bir örnek olup, 6 şeritli ikinci sedimantasyon sonrası pelet bir örnek, şerit 7 pelet bir örnek son çökeltme (adım 4.5), şerit 8 saflaştırılmış kinesin olduğunuörnek, şerit 9 100 kD kesme Amicon ultra 0.5 ml santrifüj filtre (Millipore, ABD) kullanılarak süzülür kinesin olduğunu. Mavi oklar olan miktarlar azalmış ve kırmızı ok Bu protokolde kullanılan santrifüj süzme aşaması nedeniyle kinesin konsantrasyonunu göstermektedir edildi proteinleri göstermektedir.
. Şekil 2 Saflaştırılmış KHC fraksiyonu anti-kinesin antikoru karşı blotted: Saflaştırılmış kinesin Örnek AKINO1-A 1 saat için (TBST in 1:1,000), oda sıcaklığında inkübe edildi jel elektroforezi tabi tutuldu ve primer antikorun karşı (Nitroselüloz zar olarak) blotted edildi oda sıcaklığında bir saat boyunca da Donkey-anti-tavşan antikoru (TBST in 1:10,000). Bir ECL (chemiluminescent) kiti yukarıda gösterilen kinesin sinyal tespit etmek için kullanıldı.
Şekil 3. Drosophila tam uzunlukta kinesin arasında> geçiş-uzunluğu ve Hız: (A) ve (B) filtre kinesin örnek geçiş-uzunluğu ve Velocity. (C) ve (D) filtrelenmemiş kinesin numunenin geçiş-uzunluğu ve hızı.
Şekil 4. Kinesin motilite Video. Videoyu izlemek için burayı tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mürin beyin yanı 12 kullanılmıştır ama Bovine beyin, tam uzunlukta kinesin arındırmak için en yaygın olarak kullanılan başlangıç materyali 11'dir. Bir kinesin kaynağı olarak sığır beyin kullanılarak büyük bir dezavantajı, taze başlangıç malzemesinin mevcut olmasıdır: kesimhanelerinde tipik olarak erişilemez ve beynin aktif kinesin elde edilmesi için son derece taze olmalıdır. Ayrıca, küçük inek, sadece beyinleri etkilidir. Son olarak, ineklerin genetik manipülasyon henüz uygun bir seçenek değildir, bu yüzden sadece 'wild-tip' proteini ele alınabilir.
Fareler daha erişilebilir, ancak fare beyin hasat arıtma 50'den fazla beyinleri gerektirebilir olarak biraz zor ve zaman alıcıdır. Ayrıca, bir fare koloni bakımı oldukça pahalı olabilir.
Bovine ya Mürin kaynaklar tersine, Drosophila birçok avantajı vardır. İlk olarak, sineklerin kolayca minimum sermaye ile laboratuvarda yetiştirilen edilebiliryattı ve böylece kolayca ulaşılabilir. Drosophila burada açıklandığı gibi kolayca hasat edilir üretken embriyolar, yatıyordu edilir. Drosophila genomunun manipüle edilebilir, ve aslında birçok mutant sinekler kolayca elde edilir, çünkü her iki vahşi tip ve mutant proteinlerin antılabilir, ve bağlı genetik manipülasyonlar ve kısa bir kuşak yayılma kombinasyonu, daha mutantları izole edilebilir. Bununla birlikte, kinesin fonksiyonunun tamamen kaybı ölümcül olduğunu ve embriyo protein dramatik bozulduğundan saf kinesin mutantları arıtmak mümkün değildir, ana tarafından ağırlıklı sağlanır, çünkü, olduğu not edilmelidir. Bununla birlikte, heterozigot embriyolar (akraba-mut / +) protein arındırmak ve karışık bir nüfus fonksiyonu karakterize etmek mümkündür ve ardından potansiyel hayvan fenotipleri işlev değişiklikleri gibi değişiklikler ile ilgilidir.
Ulaşım değişiklik veya bozulma birçok nörodejeneratif hastalıkların altında yatan görünüyor, ancak mekanik bağlantıtek-molekül fonksiyonu (nedeniyle ya mutasyonlar veya değiştirilmiş bir sinyal çevre) hastalığı ve alterasyon arasında belirsizdir. Tek-molekül testleri motorlar 'işlevini belirlemek için kullanılabilir, çünkü burada geliştirilen protein saflaştırılması tayini, bu anlayışla takip önemli bir araç olmalıdır. Fenotipleri in vivo karakterizasyonunda ile bu tür çalışmaların birleştirilmesi ve modelleme yardımıyla, bu değiştirerek spesifik tek moleküler özellikler ve hastalık gelişme / kalkınma atılımlarından (arasındaki ilişkinin doğrudan belirlenmesi sağlayan bir örnek olarak, değişen tek-molekül dynein fonksiyonu arasındaki bağlantıya bakın bozulmuş nöronal nakil, 13).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Kris Ngai ve bu projeye verdikleri destek ve yardım için Jason Del Rio özel teşekkürler. Bu çalışma RO1 SPG için hibe GM070676 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar (Granulated) | Fisher Scientific | 1423-500 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Petri Dishes | BD Biosciences | 35 1007 | 60x15mm Style (Polyester) 20/bag |
| Drosophila Culture Vials | UCI | ||
| Tricorn beaker | Econo Lab Inc. | B700-100 | Volume:100ml, size: 58x72mm |
| Yeast | Red Star | 2751 | |
| Nylon Mesh | Genesee Scientific | 57-102 | 120 micron pore size |
| Nylon Mesh | Small Parts, Inc. | 06-350/35 | |
| Pipes | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Pipes | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 67-42-5 | |
| MgS04(Anhydrous) | Fisher Scientific | 7487-88-9 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 329-98-6 | |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | 103476-89-7 | |
| Aprotonin | Sigma-Aldrich | 9087-70-1 | |
| TAME | Sigma-Aldrich | 178403-8 | |
| STI | Calbiochem | 65635 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | 36051-31-7 | |
| Taxol | Sigma-Aldrich | 33069-62-4 | |
| ATP analog 5’-adenylyl imidodiphosphate | Sigma-Aldrich | 3605-31-7 | |
| NaCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 7647-14-5 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 74804-12-9 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters: .5 mL, 100kD cut off, 8 pack | EMD Millipore | UFC510008 |
References
- Ashburner, M., Thompson, J. N. The laboratory culture of Drosophila 2A. The genetics and biology of Drosophila. Ashburner, M., Wright, T. R. F. , Academic Press. 1-81 (1978).
- Roberts, D. B. Drosophila: A Practical Approach. , Oxford University Press. (1998).
- Kunert, N., Brehm, A. Mass production of Drosophila Embryosand Chromatographic Purification of Native Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 420, 359 (2008).
- Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A., Wilson, L., Matsudaira, P. T., Eds, Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. 44, (1994).
- Saxton, W. M. Drosophila kinesin: Characterization of microtubule motility and ATPase. Proceedings of the National Academy of Science. 85, 1109 (1988).
- Shubeita, G. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1098 (2008).
- Svoboda, K., Block, S. M. Force and Velocity Measured for Single Kinesin Molecules. Cell. 77, 773 (1994).
- Cole, D. G., Saxton, W. M., Sheehan, K. B., Scholey, J. M. A "Slow" Homotetrameric Kinesin-related Motor Protein Purified from Drosophila embryos. J. Biol. Chem. 269, 22917-22917 (1994).
- Saxton, W. M. Isolation and Analysis of Microtuble Motor Proteins. Drosophila Melanogaster. Bloomington: Academic. 44, 279 (1994).
- Scholey, J. Motility Assay for Motor Proteins. Methods in Cell Biology. 39, 138 (1993).
- Wagner, M. C., Pfister, K., Brody, S., Bloom, G. Purification of kinesin from bovine brain and assay of microtubule-stimulated ATPase activity. Methods in Enzymology. 196, 157 (1991).
- Aizawa, H.
- Ori-McKenney, K. M., Xu, J., Gross, S. P., Vallee, R. B. A cytoplasmic dynein tail mutation impairs motor processivity. Nature Cell Biology. 12, 1228-1228 (2010).
