Summary
Detta är ett protokoll för att isolera aktiva fulla längd kinesin från
Abstract
Motorproteiner flytta last längs mikrotubuli, och transportera dem till specifika sub-cellulära platser. Eftersom förändrade transporter föreslås ligga bakom en rad olika neurodegenerativa sjukdomar, förstå mikrotubuli bygger motor transporter och dess reglering kommer sannolikt i slutändan leda till förbättrade behandlingsmetoder. Kinesin-1 är en eukaryot motorn protein som rör sig i en antegrad (plus-änden) längs mikrotubuli (MTs), som drivs av ATP-hydrolys. Här rapporterar vi ett detaljerat reningsprotokoll för att isolera aktiva fulla längd kinesin från Drosophila embryon, vilket gör att kombinationen av Drosophila genetik med enda molekyl biofysiska studier. Från och med cirka 50 Läggning koppar, med cirka 1000 kvinnor per kopp, genomförde vi över natten samlingar. Detta gav ca 10 ml packade embryon. De embryon var blek dechorionated (ger ca 9 gram av embryon) och homogeniseras. Frånter störningar, var homogenatet klargjorts med användning av en låghastighetsrotation följt av en höghastighetscentrifugering. Den klarnade supernatanten behandlades med GTP och taxol för att polymerisera MTS. Kinesin immobiliserades på polymeriserade MTs genom tillsats av ATP-analog, 5'-adeny imidodiphosphate vid rumstemperatur. Efter kinesin bindning var mikrotubuli sedimenterade via höghastighetscentrifugering genom en sackaroskudde. Mikrotubulus Pelleten återsuspenderades sedan, och denna process upprepades. Slutligen, var ATP till att frigöra kinesin från MTS. Höghastighetscentrifugering centrifugerades sedan ned MTS, som lämnar kinesin i supernatanten. Denna kinesin underkastades en centrifugal-filtrering med användning av en 100 KD cut off-filter för ytterligare rening, alikvoteras snabbfrystes i flytande kväve och lagrades vid -80 ° C. SDS-gelelektrofores och Western blotting utfördes med användning av renade provet. Den motoriska aktiviteten av renade prover före och efter det slutliga centrifugalfiltrering stegutvärderades med användning av en in vitro enda molekyl mikrotubulus-analys. De kinesin fraktionerna före och efter centrifugalfiltrering visade processivitet som tidigare rapporterats i litteraturen. Ytterligare försök pågår för att utvärdera samspelet mellan kinesin och andra transportrelaterade proteiner.
Protocol
Stammar av flugor kan köpas och förstärkas i labbet. Beroende på hur mycket Drosophila kultur flaskor fått, behöver man på vanliga "vända" de kultur flaskorna, när flaskorna har nått maximal kapacitet. Förstärkningen fortsätter tills ca 50 Drosophila kultur flaskor är fyllda. Man gör sedan "flyga koppar" med 100 ml Tricorn bägare (Fly kopp beslutsfattande diskuteras i nästa avsnitt). Efter 24 timmar måste du embryon från dessa koppar till utsäde nya Drosophila kultur flaskor med fäst fluga mat på botten. Vid rumstemperatur tillväxten tiden för Drosophila embryon från natten embryon till full odlas flugor är ca 8,5 dagar. Seedade embryon kläcks efter 12-15 timmar i den första larvstadium. Larverna växa under omkring 4 dagar ömsat två gånger in i den andra och den tredje larvstadium, vid 24 och 48 timmar efter kläckningen. Larverna kapsla sedan i pupariums och underkasta sig en 4 dagars metamorfos fram nya från Tarvtagare puppa fall 1. Låt för mer tillväxt för ungefär två till tre dagar i Drosophila kultur flaskorna för att öka mängden flugor i varje. När 400 flaskor fylls kommer det att finnas en tillräcklig mängd av flugor i femtio äggläggning koppar (ca 1.000 kvinnor flugor per kopp). Flugor behöver tid att anpassa sig till sin nya miljö. Det tar vanligtvis cirka två dagar för dem att vara redo för insamling, efter att ha överförts till kopparna. Byta agarplattor dagligen kommer att hålla flyga koppar ren, som gör det möjligt flugor att leva längre. (För ytterligare förståelse av Drosophila omsorg och amplifiering, se DB Roberts Drosophila: A Practical Approach 2).
En bra källa för att få stora mängder Drosophila embryon befolkning burar 3, som är kommersiellt tillgängliga. Montering och underhåll av befolkningen burar kan ses på kapitel 5 och 7 i boken Drosophila melanogaster: Practical användningar i Cell-och molekylärbiologi 4. Men befolkningen burar är dyra och svåra att underhålla. Eftersom befolkningen burar kan hålla en riklig mängd flugor, är användningen av koldioxid som krävs för att överföra och mata flugor. Som tidigare nämnts minskar koldioxid hälsa flugorna, vilket får dem att inte lägga också. På en liten skala, kan 100 ml Tricorn bägare användas. Med femtio 100 ml bägare, kan 9 g dechorionated embryon uppnås. För bort döda flugor, oanvända jäst pasta och andra föroreningar har vi skapat en dubbel lager sikt catcher med olika maskstorlekar. En sil fällor oönskade material såsom döda flugor samtidigt som det medger embryon för att passera genom (350 mikron porstorlek). Den andra delen innehåller en mesh (120 mikron porstorlek), vilken är avsedd att fånga Drosophila embryon och andra föroreningar passerar genom nätet.
1. Fly Cup Förberedelser och embryosamlingsgrupp
- Flipde amplifierade flugor från flera ampuller i en tom flaska av plast, till dess att mängden av flugor har nått en tum av flaskan höjd. Sedan överföra dessa flugor i en 100 ml insamling av ägg kopp (Tricon bägare med nylonnät fönster). Håll knacka koppen på en hård yta för att förhindra flykt av flugor när du överför flugor. Täck kopp med agarplatta innehållande jäst pasta och låt 24-48 timmars stabilisering tid.
- Samla över natten agarplattor från femtio fly koppar och tvätta innehållet i plattorna för att sikten uppfångaren att använda en ren målarpenseln och rinnande vatten. Flesh embryona i sikten med mycket vatten tills all jästen pastan tvättas bort.
- Dechorionate de rengjorda embryon genom nedsänkning av dem i 50% blekmedel under 3 minuter.
- Skölj med destillerat vatten i stor utsträckning fram embryon lösa blekmedel lukt. Torka sedan nät med embryon genom att placera den på ac gånger handduk flera gånger. Överför de embryon som en ren flaska och notera vikten. </ Li>
2. Embryo Homogenisering och förtydligande
- Placera dechorionated embryon i Dounce homogeniseringsanordning med 1,5 x volym iskall extraktionsbuffert.
- Har 5 slag med den lösa mortelstöt. Alikvotera Homogenatet i rena centrifugrör. Centrifugera vid 15.000 g under 40 minuter. vid 4 ° C.
- Noggrant uppsamling av den klara överstående vätskan utan att det övre vitt lipidskiktet eller den nedre pelleten.
- Överför supernatanten till rengöra centrifugrör och centrifugeras vid 50.000 g under 30 minuter. vid 4 ° C
- Resulterande snabba supernatanten uppsamlades såsom förklarats ovan kan användas omedelbart eller kan vara snabbfrystes och lagrades vid -80 ° C i flera månader.
3. Mikrotubuli Polymerisation och kinesin bindning
- Tina den frysta hög hastighet supernatanten till rumstemperatur. Att polymerisera mikrotubuli, tillsätt GTP (0,3 mM) och taxol (20 pM) och rör om försiktigt vid rumstemperatur under 20 min ien roterande skakanordning.
- Att binda kinesin, tillsätt 2,5 mM icke-hydrolyserbar analog ATP 5'-adeny imidodiphosphate (AMPPNP), följt av en 10 minuter omrörning vid rumstemperatur i en roterande skakanordning.
4. Differential Sedimentering av mikrotubuli och kinesin
- Sediment genom en lika stor volym sackaroskudde (20% sackaros och 10 | iM taxol i extraktionsbuffert) genom centrifugering vid 23 tusen g (SW41Ti rötor, TLS-55) under 30 min. vid 4 ° C.
- Tvätta pelleten genom resuspension i 10% av ursprunglig volym homogenat i extraktionsbuffert innehållande 10 | iM taxol och 75 mM NaCl.
- Upprepa sedimentering med en annan lika stor volym sackaroskudde såsom i steg 4.1.
- Återsuspendera pelleten från saltet tvätt i 5% extraktionsbuffert med 20 ^ M taxol, 75 mM NaCl, 10 mM MgSO 4, och 10 mM ATP.
- Sediment vid 120.000 g (SW41Ti rötor: 31 tusen varv per minut, TLS-55: 42 tusen varv per minut) under 20 minuter vid 4 ° C. Samla supernatanten (kinesinfraktion).
- Utföra en centrifugalfiltrering vid 14.000 g under 15 min vid 4 ° C. Recover koncentrerat prov och upprepa filtrering med ett nytt filter som ovan i 30 minuter och samla det koncentrerade provet.
- Utföra en proteinanalys för att bestämma koncentrationen. Kortfattat varierande koncentrationer av en känd proteinspecifik; var (bovint serumalbumin BSA) blandades med en känd volym av Bradford-reagens och mättes den optiska densiteten vid 595 nm våglängd. Sedan en optisk densitet mot koncentration standardkurva upprättades för att beräkna den okända koncentrationen av renat kinesin bråkdel hjälp av den optiska densiteten hos detta prov mättes under liknande förhållanden som för de vanliga BSA proverna. Gelelektrofores och Western blotting utfördes också med användning av en känd mängd av det renade kinesin.
- Alikvot kinesin fraktion i små volymer av önskad koncentration och snäpp frysning i flytande kväve för att lagra vid -80 ° C.
Full längd funktionell kinesin renades från Drosophila-embryon. Figur 1 visar silverfärgad gel som visar de olika fraktionerna under rening. Bana 1 är ett prov av den höga hastigheten supernatanten efter klarning (steg 2.5), provbrunn 2 ett prov av pelleten efter klarning, provbrunn 3 ett prov av supernatanten efter den första sedimentering med sackaroskudde (steg 4.1), spår 4 ett prov av pelleten efter den första sedimentering, provbrunn 5 ett prov av supernatanten efter den andra sedimentering (steg 4.3), provbrunn 6 ett prov av pelleten efter den andra sedimentering, provbrunn 7 ett prov av pelleten av det sista sedimentation (steg 4,5), fält 8 är det renade kinesin provet är spår 9 det filtrerade kinesin provet, och bana 10 är markören. Den koncentrerade bandet i bana 8 och 9 vid cirka 115 kD är kinesin tung kedja 1, som är förenlig med Figure 1, bana 8 av Saxton artikel publicerad i 1988 5. Figur 2 representerar C western blöt av det renade kinesin fraktionen detekterades med användning av kinesin tung kedja-antikropp. Antikroppen AKINO1-A inte signifikant korsreagerar med andra medlemmar kinesin familj 6. Observera att även detta protokoll resulterar i en bra källa av funktionell kinesin, medan fraktionen anrikas med avseende på kinesin-1, det finns sannolika föroreningar, som kan omfatta andra kinesiner och andra proteiner motor. Vi tog bort ett antal mindre föroreningar genom filtrering. När det gäller att ta bort andra motorer som inte kan göras efter storlek ensam, är reningen liknar vad som gjordes av andra för att studera kinesin 7, och vi tror att majoriteten av den aktiva motorn är kinesin-1, men mer sofistikerad rening skulle ge undanröja potentiella motoriska föroreningar, till exempel skedde genom Cole et al 8 och Saxton et al. 9 Processivitet av kinesin utvärderades genom in vitro enda molekyl mikrotubulus bindningsanalys, såsom beskrives mer i detalj i boken av Scholey titeln "Motility Analys för motorproteiner" 10. Kortfattat, polystyrenpärlor med en enda aktiv motorn bringas i kontakt med mikrotubulus, i närvaro av mättande (1 mm) ATP. Motorn ansluten till mikrotubuli, och började gå bort från centrum av lasern fällan. Vid en fördefinierad förskjutning av kulan från fällan centrum (100 nm) för laserstrålen strömmen automatiskt stängs av, vilket tillåter motorn att gå längs nämnda MT utan belastning. Filmen visar en 500 nm i diameter pärla med samma kinesin gående MT. Längden på bildskärmen motsvarar 20 nm. Figur 3 representerar uppmätta fördelningen av körlängderna för enskilda full längd Drosophila kinesin molekyler, renat enligt protokollet presenteras här. Den exponential passar till distribution ger den genomsnittliga löplängd av en enda kinesin 1,55 ± 0,1 m och 1,28 ± 0,12 pm för filtrerade och ofiltrerade prov respektive.
Figur 1 silver färgad gel av de renade fraktionerna. Prover från varje fraktion kördes på en 10% gel. 10 ^ g protein laddades i varje bana. Bana 1 är ett prov av den höga hastigheten supernatanten efter klarning (steg 2.5), provbrunn 2 ett prov av pelleten efter klarning, provbrunn 3 ett prov av supernatanten efter den första sedimentering med sackaroskudde (steg 4.1), spår 4 ett prov av pelleten efter den första sedimentering, provbrunn 5 ett prov av supernatanten efter den andra sedimentering (steg 4.3), provbrunn 6 ett prov av pelleten efter den andra sedimentering, provbrunn 7 ett prov av pelleten av det sista sedimentation (steg 4,5), fält 8 är det renade kinesinprov, spår 9 den filtrerade kinesin med 100 kD cut-off Amicon ultra 0,5 ml centrifugalfilter (Millipore, USA). De blå pilarna visar de proteiner vars belopp minskat och den röda pilen indikerar koncentrationen av kinesin grund centrifugalfiltrering steget används i detta protokoll.
. Figur 2 Renat KHC fraktion blottades mot anti-kinesin-antikropp: Renat kinesin prov utsattes för gelelektrofores och blottades (i nitrocellulosamembran) mot primär antikropp AKINO1-A vid rumstemperatur (1:1000 i TBST) under 1 timme följt av inkubation i åsna-anti-kanin-antikropp (1:10000 i TBST) under en timme vid rumstemperatur. En ECL (kemiluminescent) sats användes för att detektera kinesin-signalen som visas ovan.
Figur 3. Drosophila full längd kinesin: (A) och (B) löplängd och hastighet filtrerat kinesin prov. (C) och (D) löplängd och hastigheten för ofiltrerat kinesin prov.
Figur 4. Video kinesin motilitet. Klicka här för att se video .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bovin hjärna är det mest använda utgångsmaterialet 11 för att rena fullängds-kinesin, fast murin hjärna har använts såväl 12. En stor nackdel med att använda bovin hjärna som en kinesin källa är tillgängligheten av färskt utgångsmaterial: slakterier är typiskt otillgängliga, och hjärnan måste vara extremt färskt för att erhålla aktiva kinesin. Vidare endast hjärnan hos unga kor är effektiva. Slutligen är genetisk manipulation av kor för närvarande inte ett hållbart alternativ, så kan endast "vildtyp" proteinet studeras.
Möss är mer tillgängligt, utan skörd murin hjärna är ganska svårt och tidskrävande eftersom reningen kan kräva mer än 50 hjärnor. Vidare kan bibehålla en muskolonin vara ganska dyra.
I motsats till bovint eller murint källor har Drosophila ett antal fördelar. Först kan flugorna lätt odlas i laboratoriet med minimal kapital urlåg, och är således lätt åtkomliga. Drosophila lägger produktiva embryon, som lätt skördas som beskrivs här. Eftersom Drosophila-genomet kan manipuleras, och faktiskt många mutanta flugor enkelt erhålls, kan både vildtyp och mutanta proteinerna renas och på grund av kombinationen av genetiska manipulationer och en kort generering spännvidd kan fler mutanter isoleras. Det bör dock noteras att eftersom total förlust av kinesin funktion är livsfarlig, och protein i embryona ges främst modern, är det inte möjligt att rena rena kinesin mutanter som dramatiskt försämras. Trots detta är det möjligt att rena protein från heterozygota embryon (KIN-mut / +), och karakterisera funktion blandad befolkning, och sedan eventuellt avser sådana förändringar i funktion till fenotyper hos djuret.
Ändring eller försämring av transporter tycks ligga bakom många neurodegenerativa sjukdomar, men den mekanistiska länkenmellan sjukdom och förändring av en enda molekyl funktion (antingen på grund mutationer eller en förändrad signalering miljö) är oklar. Den proteinrening analysen utvecklats här borde vara ett viktigt verktyg för att uppnå detta förståelse, eftersom enda molekyl analyser kan användas för att bestämma motorerna "-funktionen. Genom att kombinera dessa studier med in vivo karakterisering av fenotyper, och med hjälp av modellering, ger detta direkt bestämning av förhållandet mellan förändrar enda specifikt molekylära egenskaper och sjukdomar utveckling / progression (som ett exempel, se länken mellan förändrade enda molekyl dynein funktion och nedsatt neuronal transport, 13).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Speciellt tack till Kris Ngai och Jason Del Rio för deras stöd och hjälp i detta projekt. Detta arbete stöddes av RO1 bidrag GM070676 till SPG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar (Granulated) | Fisher Scientific | 1423-500 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Petri Dishes | BD Biosciences | 35 1007 | 60x15mm Style (Polyester) 20/bag |
| Drosophila Culture Vials | UCI | ||
| Tricorn beaker | Econo Lab Inc. | B700-100 | Volume:100ml, size: 58x72mm |
| Yeast | Red Star | 2751 | |
| Nylon Mesh | Genesee Scientific | 57-102 | 120 micron pore size |
| Nylon Mesh | Small Parts, Inc. | 06-350/35 | |
| Pipes | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Pipes | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 67-42-5 | |
| MgS04(Anhydrous) | Fisher Scientific | 7487-88-9 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 329-98-6 | |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | 103476-89-7 | |
| Aprotonin | Sigma-Aldrich | 9087-70-1 | |
| TAME | Sigma-Aldrich | 178403-8 | |
| STI | Calbiochem | 65635 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | 36051-31-7 | |
| Taxol | Sigma-Aldrich | 33069-62-4 | |
| ATP analog 5’-adenylyl imidodiphosphate | Sigma-Aldrich | 3605-31-7 | |
| NaCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 7647-14-5 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 74804-12-9 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters: .5 mL, 100kD cut off, 8 pack | EMD Millipore | UFC510008 |
References
- Ashburner, M., Thompson, J. N. The laboratory culture of Drosophila 2A. The genetics and biology of Drosophila. Ashburner, M., Wright, T. R. F. , Academic Press. 1-81 (1978).
- Roberts, D. B. Drosophila: A Practical Approach. , Oxford University Press. (1998).
- Kunert, N., Brehm, A. Mass production of Drosophila Embryosand Chromatographic Purification of Native Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 420, 359 (2008).
- Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A., Wilson, L., Matsudaira, P. T., Eds, Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. 44, (1994).
- Saxton, W. M. Drosophila kinesin: Characterization of microtubule motility and ATPase. Proceedings of the National Academy of Science. 85, 1109 (1988).
- Shubeita, G. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1098 (2008).
- Svoboda, K., Block, S. M. Force and Velocity Measured for Single Kinesin Molecules. Cell. 77, 773 (1994).
- Cole, D. G., Saxton, W. M., Sheehan, K. B., Scholey, J. M. A "Slow" Homotetrameric Kinesin-related Motor Protein Purified from Drosophila embryos. J. Biol. Chem. 269, 22917-22917 (1994).
- Saxton, W. M. Isolation and Analysis of Microtuble Motor Proteins. Drosophila Melanogaster. Bloomington: Academic. 44, 279 (1994).
- Scholey, J. Motility Assay for Motor Proteins. Methods in Cell Biology. 39, 138 (1993).
- Wagner, M. C., Pfister, K., Brody, S., Bloom, G. Purification of kinesin from bovine brain and assay of microtubule-stimulated ATPase activity. Methods in Enzymology. 196, 157 (1991).
- Aizawa, H.
- Ori-McKenney, K. M., Xu, J., Gross, S. P., Vallee, R. B. A cytoplasmic dynein tail mutation impairs motor processivity. Nature Cell Biology. 12, 1228-1228 (2010).
