Summary
Calmodulin (CAM) 풀다운 분석은 다양한 단백질과 CAM의 상호 작용을 조사하기 위해 효과적인 방법입니다. 이 방법은 캠 결합 단백질의 효과적이고 구체적인 분석을 위해 CAM - 세파 로스 구슬을 사용합니다. 이것은 세포 기능의 CAM 신호를 탐험하기위한 중요한 도구를 제공합니다.
Abstract
칼슘 (칼슘 2 +)은 다양한 메커니즘을 통해 세포 기능을 조절에 중요한 이온입니다. 대부분 칼슘 2는 + 신호는 calmodulin (CAM) 1,2로 알려진 칼슘 결합 단백질을 통해 중재 수 있습니다. 캠은 apoptosis, 신진 대사, 부드러운 근육 수축, 신경 소성, 신경 성장, 염증과 면역 반응을 포함한 거의 모든 세포 공정에서 여러 수준에서 참여합니다. 단백질의 숫자 카메론와의 상호 작용을 통해 이러한 경로를 조절 도움이됩니다. 이러한 상호 작용의 대부분은 칼슘으로서 칼슘 2 + 무료 상태 (ApoCaM) 3 반대 2 + (CA 2 + - CAM)에 바인딩 할 때 분명히 다릅니다 캠의 형태에 따라 달라집니다.
대부분의 대상 단백질이 칼슘 2에 바인딩하는 동안 + - 캠, 특정 단백질에만 ApoCaM에 바인딩. neuromodulin 4 neurogranin (잉) 5, 및 특정 myosins 포함한 IQ 도메인을 통해 어떤 바인딩 캠,
세포 기능에 이러한 단백질의 효과는 종종 칼슘 2 +에 의존 방식으로 CAM에 바인딩 자신의 능력에 따라 달라집니다. 예를 들어, 우리는 다른 변이가이 바인딩을 영향을 미치는지 시냅스 기능에 잉 - CAM 바인딩의 관련성을 테스트합니다. 우리는 GFP - 태그 잉 죄수를 생성칼슘 2 +에 의존 방식으로 카메라를 바인딩하는 잉의 능력을 변경할 것입니다 IQ 도메인에서 특정 돌연변이와 구조체. 이러한 서로 다른 돌연변이 연구는 시냅스 기능 8,15에 관련된 중요한 프로세스에 우리에게 큰 통찰력을 주었다. 그러나, 이러한 연구에서, 그것은 변이된 단백질은 CAM에 대한 기대 변경된 구속력이 있는지 입증하는 것이 필수적입니다.
여기서는 예제로 CaMKII과 잉을 사용하여, CA 2 +의 존재 또는 부재에서 CAM에 바인딩하는 단백질의 기능을 테스트하기위한 방법을 제시한다. 이 방법은 캠 풀다운 분석이라고 친화도 크로마 토그래피의 한 형태입니다. 그것은 CAM과 +이 바인딩에 대한 칼슘 2의 영향에 바인딩 단백질을 테스트하기 위해 CAM - 세파 로스 구슬을 사용합니다. 그것은 효율적인 상당히 더 많은 시간을하고 칼럼 크로마 토그래피 및 기타 assays에 상대적으로 적은 단백질을 필요로합니다. 모두, 이것은 + / CAM 신호 및 단백질 거기에 칼슘 2 탐험하는 중요한 도구를 제공합니다CAM과 teract.
Protocol
homogenate와 프로 시저 시작의 기본 도식 1 그림을 참조하십시오. 세포 추출물의 준비에서 CAM 바인딩된 단백질의 용출에 예상 시간은 약 6~7시간 있습니다.
1. 조직 준비
- 재조합 단백질의 관심 (이 예제에서는 녹색 형광 단백질 (GFP) 태그 잉)과 조직이 야간 단백질을 표현할 수있는 표현 플라스미드를 포함하는 바이러스 organotypic hippocampal 조각 주사.
- 약 12-18시간 바이러스 주사 후 (바이러스성 표현 시간에 따라), 조직을 수집 준비. 페트리 접시에 1mL 해부 버퍼를 (5 % O 2 2 95 % CO와 기름 10mM 포도당, 4mm짜리 KCl, 26mM NaHCO3, 233mM 자당, 5mM MgCl 2, 1mM CaCl 2, 페놀 - 붉은 0.1 %) 추가합니다. 페트리 접시에 교양 조직 / 삽입을 전송하고 잠수함 조직에 삽입하는 2mL 해부 버퍼를 추가합니다.
- Collec부드럽게 메스를 사용하여 삽입 막의 조직 무료로 근근이 살아가고에 의해 t organotypic hippocampal 조직 (5 사이의 10 슬라이스). 특히 관심의 특정 지역 (예 : CA1)을 제거하면 옵션입니다. 거꾸로 파스퇴르 피펫을 사용하여 1.5mL microcentrifuge 튜브에 정지 조직을 전송합니다.
- 해부 버퍼에서 조직을 별도로 1 분 1500 rcf에서 샘플을 원심 분리기. 조심스럽게 흡인하여 뜨는을 제거합니다. 펠렛을 방해하지 않도록하십시오.
- 각 슬라이스가 사용 들면, 균질화 버퍼 (150mM NaCl, 20mM 트리스 산도 7.5, 1mM DTT, 1μg/mL 류펩틴, 1μg/mL chemostatin, 1μg/mL antipain, 1μg/mL의 pepstatin,, 1 % 트리톤 X의 30-60 μL를 추가 조직 -100) 및 유봉과 함께 철저히 homogenize.
- 세포 파편을 제거하기 위해서는 10 분 1100 rcf에 남아있는 homogenate를 원심 분리기 및 펠렛의 오염을 피할하면서 조심스럽게 흡인하여 뜨는을 제거합니다.
- 입력 (예제 1) 예제로 뜨는의 10 %를 가져가라. 3 단계에 사용하기 위해 CAM - 세파 로스 구슬의 준비 기간 동안 얼음에 남아있는 뜨는을 저장합니다.
참고 : 여기에 사용되는 조직이 organotypic hippocampal 슬라이스입니다. 그러나, 하나는 dissociated 뉴런 또는 다른 세포 culturing 시스템을 사용할 수 있습니다. 이러한 경우에는 적절한 방식으로 조직을 수집 후 단계 1.4에서 시작합니다.
2. 풀다운을위한 구슬의 준비
비즈 처리에서는, 그것은 구슬을 구조하고 튜브의 측면에 건조에서 구슬을 방지하여 반응의 효율을 극대화하는 것이 중요합니다. 이렇게하려면, 그것은 바로 원심 분리하기 전에 솔루션은 튜브의 벽에 비즈를 엿먹일 수 있도록, 그들의 측면에 튜브를 회전하는 것이 좋습니다.
- 각각의 풀다운, 2 ML의 microcentrifuge 관에 정지 Calmodulin - 세파 로스 비즈의 피펫 400 μL 상대적으로 FLA로 들어T - 맨 아래에 귀하의 incubations 동안 비즈와 함께 솔루션의 표면 영역과 상호 작용을 극대화합니다.
- 30 초 동안 21000 rcf에 구슬을 원심 분리기 조심스럽게 흡인하여 뜨는을 제거합니다. 구슬을 방해하지 않도록하십시오.
- 구슬을 씻어, 풀다운 칼슘이 구슬을위한 + - CAM 바인딩 단백질과 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)이 (칼슘 2 알려진 + chelator) 잡아당기는하는 데 사용되는 사람들에게 CaCl 2 2 MM 중 하나를 포함하고있는 각각의 균질 버퍼 100 μL를 추가 ApoCaM 바인딩 단백질. 부드럽게 1 분 1,500 rcf에서 다시 정지 구슬과 원심 분리기에 튜브를 누릅니다. 조심스럽게 구슬을 방해하지 않도록하고, 흡인하여 뜨는을 제거합니다.
참고 : 모든 열망 단계에 대한, 그것이 구슬을 제거하지 않고 솔루션의 제거를 허용하는 훌륭한 오프닝 (예 겔로드 도움말 참조)이있는 피펫 팁을 사용하는 것이 좋습니다.
3. 단백질의 CAM - 세파 로스 바인딩
- 동일한 볼륨을 포함하는 두 가지 조건에 뜨는 분할. 당신의 상태에 따라 각각 2 MM 농도까지 여러분 뜨는에 CaCl 2 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 해당 금액을 추가합니다.
- 해당 균질화 버퍼에 쓸려 구슬 단계 1.7에서 뜨는을 추가합니다. 부드럽게 섞어 튜브를 누릅니다.
- 뿌리에서 3 시간 4 ° C에서 샘플을 품어. 바인딩의 효율성을 높이기 위해 구슬마다 30 분 정도를 다시 일시 중지합니다.
- 원심 분리기 튜브는 3 분 1500 rcf에서 샘플 및 구슬이 들어있는.
- 언바운드 단백질 (샘플 2) 샘플로 뜨는의 50μL를 가지고 신중하게 열망하고 삭제하여 나머지 뜨는을 제거합니다.
- 각각의 균질화 버퍼 100μL를 사용하여 단계 2.3에서 설명한대로 구슬 세 번 씻으십시오.
4. 용리
- 반대 조건 (10mM C를 포함하는 용출 버퍼 (50mM 트리스 - HCL 산도 7.5, 150mM NaCl과)의 50μL 추가비즈로 ACL 2 10mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)). 예를 들어, CA 2가 들어있는 버퍼에 균질하고 묶여 있던 샘플 + EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 반대를 포함 용출 버퍼에 eluted 있습니다.
옵션 : 구슬에 추가하면 수율을 향상시킬 수 있습니다 37 용출 버퍼를 온난화 ° C 전에.
- 흔드는 30 분 상온에서 구슬과 솔루션을 품어. 부드럽게마다 5 분에 대한 튜브를 눌러서하여 구슬을 섞는다.
- 3 분 1,500 rcf에 구슬을 원심 분리기 조심스럽게 흡인에 의해 구속 단백질 (예제 3) 뜨는의 50μL를 제거합니다. 구슬을 방해하지 않도록하십시오.
- 모든 샘플 (예 : homogenate, 언바운드 및 바운드 단백질뿐만 아니라 그 계속 비즈에 바인딩)에 단백질 로딩 버퍼를 추가합니다.
참고 : 용출을 (특히 비효율적인 용출의 경우) 극대화하려면 해당 용출 버퍼 50μL를 (예 : EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)가 포함된 buf를 추가하는 추가남은 행 단백질과 나머지 바운드 단백질을 제거하는 4.3에서 설명한 단계를 반복을 elute 수 있도록 샘플을 가열하기 전에 비즈까지) CaCl 2 행 구슬로 그다지.
5. SDS - PAGE과 서양 얼룩
SDS - PAGE를 실시하고 긍정적인 제어로 반대 상태로 카메라를 바인딩하는 것으로 알려진 단백질에 대한 관심과 프로브의 단백질에 대해 탐색하여 서양 얼룩을 사용하여 분석할 수 있습니다.
6. 대표 결과
그림 2B는 내생 잉에 비해 GFP - 태그 잉의 캠 바인딩을 테스트 CAM - 풀다운 분석의 예를 보여줍니다. 이렇게하려면, GFP - 잉은 하룻밤 사이에 우리 organotypic hippocampal 조각에 overexpressed되었으며 조직은 균질습니다. homogenate는 칼슘 2 + 또는 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 중 하나의 존재의 CAM - 세파 로스 비즈와 incubated했다. Homogenate 입력 GFP - 잉이 내생 잉 및 CA 2 + / CAM - 의존 키나제 II 이외의 표현이라고 보여줍니다(CaMKII). 마찬가지로 내생 첸 (그림. 2A의 그림)의 알려진 바인딩을 바탕으로 예상, 잉이 칼슘 2 + (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 바인딩 단백질)의 부재 및 CA 2 +의 존재에 언바운드 (그림 2B)에 eluted되었습니다 GFP - 태그 . 반대로, 제어, CaMKII는 오직 칼슘 2 + (행 단백질)의 존재에 eluted되었으며 그 부재 (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))에 언바운드되었습니다. 이것은 CAM 비즈가 제대로 작동다고 표시되고 elutions는 효율적인되었습니다. 가장 중요한 것은, GFP - 잉은 내생 양식과 유사한 방식으로 ApoCaM에 바인딩이 보여주는 GFP 태그 우리 재조합 단백질의 기능을 변경하지 않았 것을 제안.
CAM 풀다운 분석의 그림 1. 개요
(A) 조직 homogenate는 세포 파편을 제거 아래로 잡아 늘인 것입니다. 뜨는의 10 % 정도는 입력 (1)의 샘플로 가져옵니다. 나머지 뜨는는 다른 동일하게 구성되어 있습니다조건 및 적절한 시약 (CaCl 2 혹은 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))는 이러한 조건에서 바인딩을 테스트에 추가됩니다. (CaCl 2 또는 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 중 하나를 포함) 각 뜨는가 각각 준비 CAM - 세파 로스 구슬에로드되고 (B) 바인딩을 허용하는 incubated입니다. 언바운드 단백질이 제거됩니다 (2)와 (C) 행 단백질 (3)은 구속력 반대 조건을 포함한 용출 버퍼 (EB)를 사용하여 구슬에서 eluted 있습니다. 이 세 단백질 샘플의 단백질 합성이 SDS - PAGE와 서양 얼룩 분석을 사용하여 분석하실 수 있습니다.
풀다운 분석 예에 칼슘 2 그림 2. A.) 도식은 + - 의존 CAM 바인딩과 용출은 단백질의 두 종류있는 칼슘 2에 구속 CAM + 종속 방식의 부여됩니다. Neurogranin (잉)은 구속 APO - CAM과 CaMKII가 + 풍부한 칼슘이에 바인딩 단백질을 나타내는 단백질을 나타냅니다캠. CAM은 homogenate 단백질과 사전 배양하기 위해 dissociated 상태로 표시됩니다. 일단 + chelator, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (2 ㎜), 단백질이 적절하게 CAM에 바인딩할 것입니다 높은 칼슘 2 + 농도 (2 ㎜)의 조건이나 칼슘이의 존재에 incubated. NG없이 칼슘 2 + 현재 거의가로 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 상태에서 카메라를 바인딩하고, 칼슘 2 +의 존재에있는 CAM - 세파 로스 구슬을 eluted 것입니다. CaMKII 그러나, CA이 높은 양의 앞에서 캠에 바인딩 것이 +와 칼슘 2 +가 chelated했습니다 한번 떼어 놓다 것입니다.
예를 들어 캠 풀다운 분석에서 B.) 결과. 이 수치는 CAM - 세파 로스의 예상 최종 결과는 샘플 잉과 CaMKII에 대한 탐지와 풀다운 보여줍니다. 내생 잉과 GFP - 잉 모두 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 존재에 캠에 바인딩 단백질의 차선에 존재한다. 샘플 칼슘 2 +의 존재에 CAM과 incubated 때 아무 잉가 보여주는, 구속하지 않는다는 Ng는 APO 카메라를 바인딩합니다. 우리의 긍정적인 제어, CaMKII는 반면에, 오직 칼슘 2의 존재에 캠에 바인딩 +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
제공된 프로토콜은 칼슘이 캠 결합 단백질의 + - 의존도를 조사하기 위해 CAM - 세파 로스 구슬을 활용합니다. 많은 단백질은 칼슘 2 +에 의존 방식으로 카메라를 바인딩합니다. 이러한 상호 작용 카메론 바인딩 단백질과 많은 신호 경로에서 중요한 역할의 수를 주어진 매우 중요 있습니다. 이 프로토콜에서는 CAM - 세파 로스 비즈는 칼슘 2 +의 존재 또는 부재의 조직 homogenate에서 CAM 결합 단백질을 분리하는 데 사용됩니다. 이 간단한 접근 방법의 결과는 단백질이 칼슘 2 +에 의존 방식으로 CAM과 상호 작용하는 수 있는지에 대한 이해를 더욱 것입니다. 이 방법은 구속력을 연구, 칼럼 크로마 토그래피는 그의 CAM - 세파 로스 구슬이 솔루션보다는 매트릭스에서 수정된 단백질에서 일반적으로 사용되는 기법과 다릅니다.
열의없이 프로토콜 적은 시간이 소요되기 때문에 NE가 없습니다로 칼럼의 사용을 피하면,이 접근법의 장점입니다에드는 열을 평형이나 흐름을 통해 중력이 기다리고 있습니다. 그 효율성의 미덕으로 인해, 풀다운 캠 칼럼 크로마 토그래피보다 훨씬 적은 조직이 필요하며 샘플 준비를 단순화, 단백질 샘플에서 세포 파편의 분리으로만 아래 설명 끌어 CAM - 세파 로스에 대한 짧은 원심 분리가 필요합니다. 열 추가 정화 단계를 필요로하는 모든 세포 파편, 무료입니다 단백질 샘플을 필요로합니다. 이러한 접근 방식은 또한 그것을 캡처하는 미끼 단백질과 샘플의 모든 상호 작용하는 단백질에 대한 항체를 필요로 공동 immunoprecipitation 같은 방법을 아래로 당겨 이상 다른 장점을 가지고 있습니다. 실험 중에 항체와 단백질 사이의 상호 작용 가난한 내려 비효율 끌어로 이어질 수 있으므로 미끼 단백질을 캡처하는 항체의 사용은 제한 될 수 있습니다. 이러한 잠재적인 문제는 설명 CAM - 세파 로스 풀다운를 사용하여 피할 수 있습니다.
그러나, 같은공동 immunoprecipitation과 칼럼 크로마 토그래피의 assays는 캠 - 세파 로스는 풀다운 전 생체내 CAM 바인딩로 제한됩니다. 얻어진 결과는 캠 상호 작용의 생체내 현실에 반영되지 않을 수 있습니다. 예를 들어, 포스트 translational 수정은 종종 단백질 상호 작용에 영향을. 이것은 상호 작용 캠과의 IQ 도메인 5 PKC - 중재 인산화에 의해 예방됩니다 neurogranin에 대한 경우입니다. 조직을 Homogenizing하면 같은 kinases이나 phosphatases 같은 효소가 정상적으로 세포 내에서 효소으로부터 격리 될 대상 단백질에 액세스할 수 있으므로 예를 들어, 사후 translational 수정 사항을 변경할 수 있습니다. 현지화 및 / 또는 compartmentalization의 파괴는 또한 두 단백질이 정상적으로 세포의 상호 작용 기회를하지 않았을 때 바인딩을 허용할 수 있습니다. 이러한 반응을 최소화하기 위해서는 준비와 부하 사이의 얼음에 대한 모든 샘플을 저장하는 것이 중요합니다. 그것은 구슬로 부화 '돈'입니다 이런 이유도있다4 E ° C. 인산 가수 분해 효소 억제제 또는 다른 효소 억제제는 또한 효과를 제한할 수 있도록 균질화 버퍼에 추가할 수 있습니다.
긍정적인 통제는 중요한 오류가 실험 도중 발생하지 않도록 해당 실험에 대한 중요합니다. 또한 조건의 차이 그것이 칼슘 2의 존재와 부재에서 다른 단백질을 바인딩할 수 있도록 캠에서 conformational 변화를 일으킬 수있는 충분한 것을 보장할 수 있습니다 +. 예를 들면, 관심 단백질에 대한 신호가 없다면, 그것은로드 오류 또는 다른 잠재적인 오류로 인해 수 있습니다. (예 : 제공된 예제에 CaMKII 등) 다른 조건에 바인딩 알려진 다른 단백질에 대해 탐색하는 것은 잠재적인 오류를 해결하는 데 도움이됩니다. 낮은 칼슘 2 + 또는 칼슘 2 + chelator (예 : EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 농도도 예상 결과와 함께 방해할 수 있습니다. EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)이 성공적으로 사용되었지만 다른 칼슘 2 + chelators (예 : EGTA)이 더 효과적일 수 있습니다 더 높은 concentrat 경우이온은 효과가 있습니다. 그것은 구속해야 할 때 단백질의 용출을 초래 가능한 캠 - 세파 로스 비즈를 포화 수 있으므로 과도한 CAM 결합 단백질은 또한 예기치 않은 결과가 발생할 수 있습니다. GFP - 잉의 상대적으로 적은 수량 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 상태에서 eluted대로 이것은 그림 예에서와 있습니다. 구슬로 부화하기 전에 단백질의 부량이 개량하다 도움이 될 수 있습니다.
실험 내내 CAM - 세파 로스 구슬의 적절한 준비 및 취급은 또한 성공을 위해 필수적입니다. 비즈 쉽게 실수로 폐기해야 뜨는로 제거하거나 2.0 ML 튜브의 측면과 상단에 붙어도 실험 중에 손실될 수 있습니다. 이것은 표면에 뜨는 제거하는 동안주의를 사용하고 철저한 사전 원심 분리 즉시 혼합을 보장함으로써 피할 수 있습니다. 샘플은 혼합하고 CAM - 세파 로스 구슬은 튜브의 측면에서 건조하실 수로 centrifuging 사이에 앉아 있도록하지보십시오. 예방책, resuspend 구슬과 RO으로바로 원심 분리하기 전에 서부 유럽 표준시 구슬로 튜브 주위 테이트 솔루션입니다. 바인딩 및 용출 incubations 모두 동안에 구슬로 샘플 철저한 침지는 매우 중요합니다. 구슬로 샘플의 적당한 혼합하지 않고, 바인딩 및 용출 가능성이 비효율적인 것입니다.
이 프로토콜은 다양한는 쉽게 다른 목적을 위해 수정하실 수 있습니다. 관찰된 경우 잘리거나 변이된 단백질이 실험을 수행하면, 그 지역에 대한 정보 (S)와 + - 의존성 CAM 바인딩 및 CA 2 중요한 단백질 잔류물을 확인할 수 있습니다. 잉의 경우, 우리는 GFP - 첸은 내생 단백질과 같은, 오직 칼슘 2 + 8 부재에 카메라를 바인딩 것을 보여줄 수 있었다. 자세한 CAM뿐만 아니라 사후 translational 수정의 기능과 함께 잉의 상호 작용의 본질을 이해하기 위해 IQ 도메인 도움 변경이 단백질의 결합, 서로 다른 돌연변이 기능을 탐험이 intera을 변경하는ction. 세린의 장소 (S36D 또는 잉 - SD)에 phosphomimic aspartate와 CAM에 바인딩을 방지하기 위해 IQ - 이하 잉 : 잉 우리는 카메라 바인딩을 두 개의 서로 다른 돌연변이를 사용의 중요성을 테스트. 우리는 또한 생성 돌연변이 (잉 - SFAW) CAM에 구속력이 강화된 것으로, CA 2의 존재에도 구속 숙박 +.를 마지막으로, 우리는 내생 잉과 유사한 칼슘 2 +에 의존 방식으로 CAM에 바인딩하지만 단백질 키나제 C (PKC)의 인산화을 방지 이외의 phosphorylatable 돌연변이 (잉 - SA)를 사용합니다. CAM 풀다운 분석이 서로 다른 돌연변이의 기능을 테스트하고 도움이 시냅스 기능 8 잉 - CAM 바인딩의 중요성을 보여주 도움 방법과 잉 인산화를 미세 조정할 시냅스 소성 15 수 있습니다.
또한 캠 결합 단백질에 바인딩 단백질은 eluted 수 있습니다. 이것은 간접적으로 카메라를 바인딩 단백질을 결정하는이 분석의 추가 어플 리케이션을 제공할 수 있습니다. 그것이 다른 상호 작용의 연구를 수이온 CAM 및 바인딩 파트너의 다른 잠재적인 하류 효과.
요약에서 캠 풀다운 분석은 칼슘이 캠 - 단백질 상호 작용 + - 의존도를 조사하기 위해 효율적이고 효과적인 방법을 제공합니다. 이것은 CAM - 단백질 상호 작용을 연구하는 방법과 서로 다른 돌연변이 또는 수정이 상호 작용에 영향을 미칠 수 중요한 도구가 될 수 있습니다. 이것은 칼슘 2 + / CAM 신호 경로의 규정을 탐험에 도움이 될 수 있습니다. 또한, 우리는 + / CAM 신호 칼슘 2에 중단으로 인한 pathologies를 탐험하기 위해 이것을 사용할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는이 프로토콜을 최적화하는 그녀의 도움 티파니 체리 감사드립니다. 이 작품은 국립 노화 연구소 (AG032320)뿐만 아니라 건강한 위스콘신를 발전하여 기금을했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calmodulin-Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0529-01 | |
| Anti-CamKII alpha | Sigma-Aldrich | C6974 | |
| Anti-neurogranin | EMD Millipore | 07-425 | |
| Gel Loading Pipet Tips | Fisher Scientific | 02-707-138 | Use for aspiration of supernatants |
| Microcentrifuge tubes (2.0 mL) | Fisher Scientific | 05-408-146 | Use for all steps involving calmodulin-sepharose beads |
References
- Vincenzi, F. F. Calmodulin in the regulation of intracellular calcium. Proc. West Pharmacol Soc. 22, 289-294 (1979).
- Cheung, W. Y. Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation. Science. 207, 19-27 (1980).
- Zhang, M., Tanaka, T., Ikura, M. Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin. Nat. Struct. Biol. 2, 758-767 (1995).
- Alexander, K. A., Wakim, B. T., Doyle, G. S., Walsh, K. A., Storm, D. R. Identification and characterization of the calmodulin-binding domain of neuromodulin, a neurospecific calmodulin-binding protein. J. Biol. Chem. 263, 7544-7549 (1988).
- Huang, K. P., Huang, F. L., Chen, H. C. Characterization of a 7.5-kDa protein kinase C substrate (RC3 protein, neurogranin) from rat brain. Arch. Biochem. Biophys. 305, 570-580 (1993).
- Bahler, M., Rhoads, A. Calmodulin signaling via the IQ motif. FEBS Lett. 513, 107-113 (2002).
- Routtenberg, A. Protein kinase C activation leading to protein F1 phosphorylation may regulate synaptic plasticity by presynaptic terminal growth. Behav. Neural. Biol. 44, 186-200 (1985).
- Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin. EMBO J. 28, 3027-3039 (2009).
- Needham, D. M. Myosin and adenosinetriphosphate in relation to muscle contraction. Biochim. Biophys. Acta. 4, 42-49 (1950).
- Hathaway, D. R., Adelstein, R. S. Human platelet myosin light chain kinase requires the calcium-binding protein calmodulin for activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1653-1657 (1979).
- Fukunaga, K., Yamamoto, H., Matsui, K., Higashi, K., Miyamoto, E. Purification and characterization of a Ca2+- and calmodulin-dependent protein kinase from rat brain. J. Neurochem. 39, 1607-1617 (1982).
- Yang, S. D., Tallant, E. A., Cheung, W. Y. Calcineurin is a calmodulin-dependent protein phosphatase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 106, 1419-1425 (1982).
- Huestis, W. H., Nelson, M. J., Ferrell, J. E. J. Calmodulin-dependent spectrin kinase activity in human erythrocytes. Prog. Clin. Biol. Res. 56, 137-155 (1981).
- Yamniuk, A. P., Vogel, H. J. Calmodulin's flexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides. Mol. Biotechnol. 27, 33-57 (2004).
- Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation. Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).
