Summary
Calmodulin (CAM) pull-down-analys är ett effektivt sätt för att undersöka samspelet mellan CAM med olika proteiner. Denna metod använder CAM-sepharose pärlor för effektiv och specifik analys av CAM-bindande proteiner. Detta ger ett viktigt verktyg för att utforska CAM signalering i cellulär funktion.
Abstract
Kalcium (Ca 2 +) är en jon viktigt i regleringen av cellulära funktioner genom olika mekanismer. Mycket av Ca 2 + är signalering förmedlas via kalcium-bindande protein som kallas calmodulin (CAM) 1,2. Cam är inblandade på flera nivåer i nästan alla cellulära processer, inklusive apoptos, metabolism, smidig muskel kontraktion, synaptisk plasticitet, nerv tillväxt, inflammation och immunsvaret. Ett antal proteiner hjälper till att reglera dessa vägar genom deras interaktion med CAM. Många av dessa interaktioner beror på konformation av CAM, vilket är helt olika när de är bundna till Ca 2 + (Ca 2 +-CAM) i motsats till sin Ca2 +-fri stat (ApoCaM) 3.
Medan de flesta målproteiner binder Ca 2 +-CAM, vissa proteiner binder endast till ApoCaM. Några binder CAM genom deras IQ-domän, inklusive neuromodulin 4, neurogranin (Ng) 5, och vissa myosins
Effekterna av dessa proteiner cellens funktion är ofta beroende av deras förmåga att binda till Cam i ett Ca2 +-beroende sätt. Exempelvis testade vi betydelsen av Ng-CAM bindande i synapserna och hur olika mutationer påverkar denna bindning. Vi genererade en GFP-märkta Ng construct med specifika mutationer i IQ-domän som skulle förändra möjligheten för Ng att binda Cam i ett Ca2 +-beroende sätt. Studiet av dessa olika mutationer gav oss stor insikt i viktiga processer som ingår i synapserna 8,15. Men i sådana studier är det viktigt att visa att de muterade proteiner har den förväntade ändrade bindning till CAM.
Här presenterar vi en metod för att testa förmågan hos proteiner att binda till cam i närvaro eller frånvaro av Ca 2 +, med hjälp CaMKII och Ng som exempel. Denna metod är en form av affinitetskromatografi kallad CAM pull-down-analysen. Den använder CAM-Sepharose pärlor för att testa proteiner som binder till CAM och påverkan av Ca 2 + på denna bindande. Det är betydligt mer tidseffektivt och kräver mindre protein i förhållande till kolonnkromatografi och andra analyser. Sammantaget ger detta ett värdefullt verktyg för att utforska Ca 2 + / CAM-signalering och proteiner som imotverka med CAM.
Protocol
Se figur 1 för en grundläggande schematisk av förfarandet börjar med homogenatet. Beräknad tid från förberedelse av cellulära extrakt till eluering av CAM-bundna proteiner är ungefär sex till sju timmar.
1. Tissue förberedelse
- Injicera organotypic hippocampus skivor med ett virus som innehåller en plasmid som uttrycker rekombinant protein av intresse (i detta exempel, grönt fluorescerande protein (GFP)-märkta Ng) och låt vävnad att uttrycka proteinet natten.
- Cirka 12 till 18 timmar efter virus-injektion (beroende på den virala uttryck tiden), förbereda för att samla vävnaden. Tillsätt 1 mL dissektion buffert (10 mM glukos, 4mm KCl, 26mm NaHCO3, 233mM sackaros, 5mm MgCl 2, 1mm CaCl 2 och 0,1% fenol-röd, gasade med 5% CO 2 95% O 2) till en petriskål. Överföring odlade vävnaden / infoga till petriskål och tillsätt 2 ml dissektion buffert för att insatsen för att dränka vävnaden.
- Collect organotypic hippocampus vävnad (mellan 5 och 10 skivor) genom att försiktigt skrapa vävnaden fri från skäret membranet med hjälp av en skalpell. Speciellt att ta bort en viss region av intresse (t.ex. CA1) är också ett alternativ. Överför den suspenderade vävnaden ett 1,5 mL mikrocentrifugrör med ett inverterat pasteurpipett.
- Centrifugera proverna vid 1500 RCF i 1 min för att separera vävnad från dissektion buffert. Ta försiktigt bort supernatanten genom aspiration. Se till att inte störa pelleten.
- För varje skiva som används, lägg till 30 till 60 mikroliter av homogenisering buffert (150mm NaCl, 20mm Tris pH 7,5, 1 mm DTT, 1μg/mL leupeptin, 1μg/mL chemostatin, 1μg/mL antipain, 1μg/mL pepstatin, och 1% Triton X -100) till vävnaden och homogenisera noggrant med mortelstöt.
- För att ta bort cellulära skräp, centrifugera återstående homogenatet på 1100 RCF i 10 min och ta försiktigt bort supernatanten genom aspiration och samtidigt undvika kontamination från pelleten.
- Ta 10% av supernatanten som prov av ingående (urval 1). Förvara de återstående supernatanten på is under förberedelserna av CAM-sepharose pärlor för användning i steg 3.
Obs: vävnad som används här är organotypic hippocampus skivor. Däremot kan man använda dissocierade nervceller eller något annat cellodling system. I sådana fall börjar du med steg 1,4 efter att samla dina vävnad på lämpligt sätt.
2. Beredning av pärlor för pull-down
I hanteringen av pärlor är det viktigt att bärga pärlor och maximera effektiviteten i de reaktioner genom att hindra kulorna från att torka på sidorna av röret. För att göra detta är det bäst att rotera rör på deras sida, vilket gör att lösningen på våta kulorna på väggarna i röret omedelbart före centrifugering.
- För varje pull-down, pipett 400 mikroliter av suspenderade calmodulin-Sepharose pärlor i en 2 ml mikrocentrifugrör med en relativt flaT-botten för att maximera ytan och interaktion av dina lösningar med pärlor under din inkubationer.
- Centrifugera pärlor på 21 tusen RCF i 30 sekunder och ta försiktigt bort supernatanten genom aspiration. Se till att inte störa pärlor.
- Att tvätta pärlor, tillsätt 100 mikroliter av respektive homogenisering buffert som innehåller antingen 2 mM CaCl 2 till de som används för att dra ner Ca2 +-CAM bindande proteiner och 2 mM EDTA (en känd Ca 2 + kelator) för pärlor dra ner ApoCaM proteiner. Knacka försiktigt på röret för att återsuspendera pärlor och centrifugera vid 1500 RCF i 1 min. Ta försiktigt bort supernatanten genom aspiration, att se till att inte störa pärlor.
OBS: För alla strävan steg, är det rekommenderat att använda en pipettspets som har en fin öppning (t.ex. gel lastning tips) att kunna ta bort lösningen utan att ta bort pärlor.
3. CAM-sepharose bindning av proteiner
- Dela dina supernatanten i två villkor som innehåller en lika volym. Beroende på ditt tillstånd, tillsätt lämplig mängd CaCl 2 eller EDTA till din supernatanten upp till 2 mm koncentrationen för varje.
- Tillsätt supernatant från steg 1,7 till pärlor tvättas i motsvarande homogenisering buffert. Knacka försiktigt på röret för att blanda.
- Inkubera proverna vid 4 ° C i 3 timmar på en shaker. Återsuspendera pärlor var 30 min eller så för att öka effektiviteten av bindande.
- Centrifugrör som innehåller prov och pärlor på 1500 RCF i 3 min.
- Ta 50μL av supernatanten som prov av obundet protein (urval 2) och ta försiktigt bort återstående supernatanten genom aspiration och kasta.
- Tvätta pärlor tre gånger enligt beskrivningen i steg 2,3 hjälp 100μL av respektive homogenisering buffert.
4. Eluering
- Tillsätt 50μL av eluering buffert (50 mM Tris-HCl pH 7,5 och 150mm NaCl) innehåller det motsatta tillståndet (10mm Cacl 2 eller 10 mM EDTA) till pärlor. Till exempel, + prover som homogeniserad och bundna i buffert innehållande Ca 2 elueras i eluering buffert innehållande EDTA och vice versa.
Tillval: Uppvärmning elueringen bufferten till 37 ° C innan du lägger till pärlor kan öka avkastningen.
- Inkubera lösning med pärlor i rumstemperatur i 30 min på en shaker. Blanda kulorna genom att knacka försiktigt röret ca var 5 min.
- Centrifugera pärlor på 1500 RCF i 3 min och försiktigt bort 50μL av supernatanten för proteinbundet (prov 3) genom aspiration. Se till att inte störa pärlor.
- Lägg buffert protein lastning till alla prover (dvs. homogenatet, obundna och bundna protein och de som fortfarande är bundna till pärlor).
OBS: För att maximera eluering (särskilt i fråga om ineffektiva eluering), lägg 50μL av motsvarande eluering buffert (t.ex. lägga EDTA innehåller bufFer till pärlor bundet i CaCl 2) för att kulorna innan uppvärmning prover för att hjälpa eluera kvarvarande proteinbundet och upprepa steg som beskrivs i 4,3 för att ta bort kvarvarande bundna proteiner.
5. SDS-PAGE och Western Blot
Genomför SDS-PAGE och analysera med hjälp av Western Blot genom sondering för ditt protein av intresse och söka efter ett protein som kallas att binda CAM i motsatt skick som en positiv kontroll.
6. Representativa resultat
Figur 2B visar ett exempel på en CAM-pull-down-analysen testa CAM bindning av GFP taggade-Ng jämfört med endogena Ng. För att göra det var GFP-Ng överuttryckt i vår organotypic hippocampus skivor över natten och vävnaden var homogeniserade. Den homogenatet var inkuberas med CAM-sepharose pärlor i närvaro av antingen Ca 2 + eller EDTA. Homogenatet ingång visar att GFP-Ng uttrycktes vid sidan av endogena Ng och Ca 2 + / CAM-beroende kinas II(CaMKII). Som väntat baseras på de kända bindningen av endogena Ng (visas på bild. 2A), GFP-märkta Ng var elueras i avsaknad av Ca 2 + (EDTA proteinbundet) och obundna i närvaro av Ca 2 + (Fig. 2B) . Däremot var kontrollen, CaMKII, elueras endast i närvaro av Ca 2 + (proteinbundet) och obundna i sin frånvaro (EDTA). Detta visar att CAM pärlor fungerar och elutions var effektiv. Viktigast här visar att GFP-Ng binder till ApoCaM på ett liknande sätt till den endogena formen, vilket tyder på att GFP-taggen inte ändrar funktionen hos våra rekombinant protein.
Figur 1. Disposition av CAM pull-down-analys
(A) Tissue homogenat spinns ner för att ta bort cellulära skräp. Ungefär 10% av supernatanten tas som ett exempel på ingång (1). Den återstående supernatanten delas lika för de olikavillkor och lämpliga reagens (CaCl 2 eller EDTA) tillsätts för att testa bindande i dessa villkor. Varje supernatant (innehållande antingen CaCl 2 eller EDTA) är lastas på respektive beredd CAM-sepharose pärlor och (B) inkuberas att tillåta bindande. Obundna proteiner tas bort (2) och (C) den bundna proteiner (3) elueras bort av pärlor med hjälp av elueringen buffert (EB) som innehåller den motsatta villkor som de bindande. Det protein sammansättningen av dessa tre protein prover kan analyseras med hjälp av SDS-PAGE och Western blot-analys.
Figur 2. A) Schematisk bild av Ca2 +-beroende CAM bindande och eluering i pull-down-analysen Exempel ges på två typer av protein som binder Cam i ett Ca2 +-beroende sätt. Neurogranin (NG) representerar proteiner som binder apo-CAM och CaMKII representerar proteiner som binder till Ca2 +-rikCam. CAM visas i sin dissocierade staten före inkubation med homogenatet proteiner. När inkuberas under förhållanden med hög Ca 2 + koncentrationer (2 mm) eller i närvaro av en Ca 2 + kelator, EDTA (2 mm), kommer proteiner binder till CAM därefter. Ng binder cam i EDTA skick som det finns liten eller ingen Ca 2 + närvarande, och skulle vara elueras av CAM-sepharose pärlor i närvaro av Ca 2 +. CaMKII skulle dock binder till CAM i närvaro av höga halter av Ca 2 + och skulle ta avstånd när Ca 2 + var kelaterats.
B.) Resultat från exempelvis CAM pull-down-analysen. Denna siffra visar det förväntade slutresultatet av ett CAM-sepharose dra ner med prover sonderade För naturgas-och CaMKII. Både endogena Ng och GFP-Ng finns i gränderna av proteiner bundet till CAM i närvaro av EDTA. Ingen Ng är bunden när prover inkuberas med CAM i närvaro av Ca 2 +, som visar att Ng binder bara APO-Cam. Vår positiva kontrollen, CaMKII, å andra sidan, binder till CAM endast i närvaro av Ca 2 +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den som protokollet använder CAM-sepharose pärlor att undersöka Ca2 +-beroende av CAM-bindande proteiner. Många proteiner binder Cam i ett Ca2 +-beroende sätt. Dessa interaktioner är av stor betydelse med tanke på antalet CAM-bindande proteiner och deras avgörande roll i många signalvägar. I detta protokoll är CAM-sepharose pärlor används för att separera CAM-bindande proteiner från vävnader homogenatet i närvaro eller frånvaro av Ca 2 +. Resultaten av denna enkla metod kommer ytterligare förståelse för hur proteiner kan interagera med Cam i ett Ca2 +-beroende sätt. Detta tillvägagångssätt skiljer sig från en ofta använd teknik i proteinbindningsgraden studier, kolonnkromatografi, i och med att CAM-sepharose pärlor är i lösning snarare än fast i en matris.
Undvika att använda en kolumn är en fördel med denna metod, för utan den kolumn i protokollet är mindre tidskrävande, eftersom det inte neED att balansera en kolumn eller vänta på självfall-through. På grund av den kraft av sin effektivitet kräver CAM rullgardinsmenyn betydligt mindre vävnad än kolonnkromatografi och förenklar provberedning, separation av cellulära skräp från protein prov kräver bara en kort centrifugering för CAM-sepharose dra ner beskrivs. Kolumner kräver protein prover som är fria från cellulära skräp, vilket kan kräva ytterligare reningssteg. Denna metod har också fördelar jämfört med andra pull down metoder, som co-immunoprecipitation, vilket kräver en antikropp mot betet protein för att fånga den och alla samverkande proteiner i provet. Användningen av en antikropp att fånga betet protein kan vara en begränsning som dålig interaktion mellan antikropp och protein under experimentet kan leda till en ineffektiv dra ner. Dessa potentiella problem undviks med hjälp av den beskrivna CAM-sepharose pull-down.
Men liksomsamtidig immunoprecipitation och kolumn analyser kromatografi, CAM-sepharose rullgardinsmenyn är begränsad till ex vivo CAM-bindande. De erhållna resultaten överensstämmer inte nödvändigtvis in vivo verklighet CAM interaktioner. Till exempel, post-translationella modifieringar påverkar ofta proteininteraktioner. Detta är fallet för neurogranin, vars interaktion med CAM hindras av PKC-medierad fosforyleringen av sin IQ domänen 5. Homogenisering vävnad skulle förändra post-translationella modifieringar till exempel genom att enzymer som kinaser eller fosfataser att få tillgång till målproteiner som normalt skulle vara isolerade från enzymer i cellen. Störning av lokalisering och / eller uppdelning kan också ge bindande när två proteiner som normalt inte skulle ha en chans att interagera i cellen. För att minimera dessa reaktioner är det viktigt att förvara alla prover på is mellan beredningen och lastning. Det är också av denna anledning som det inkubation med pärlorna är Done vid 4 ° C. Fosfatas hämmare eller andra hämmare enzym kan också läggas till homogenisering buffertar för att bidra till att begränsa deras effekter.
En positiv kontroll är viktig för detta experiment för att se till att inga väsentliga fel inträffat under försöket. Det kan också se till att skillnader i villkor var tillräckliga för att orsaka konformationsändringar i CAM, gör det möjligt att binda olika proteiner i närvaro och frånvaro av Ca 2 +. Till exempel, om det inte finns någon signal för proteinet av intresse, kan det vara på grund av lastning fel eller andra potentiella fel. Probing för ett annat protein som kallas för att binda i andra förhållanden (t.ex. CaMKII i den medföljande exempel) kan hjälpa till att lösa eventuella fel. Låg Ca 2 + och Ca 2 + kelator (t.ex. EDTA) koncentrationer kan också störa förväntade resultat. EDTA har använts framgångsrikt men andra Ca2 + kelater (t.ex. EGTA) kan vara mer effektivt om ännu högre koncentreradesjoner är ineffektiva. Överdriven CAM-bindande protein kan också leda till oväntade resultat eftersom det kan mätta den tillgängliga CAM-sepharose pärlor, vilket eluering av protein när det borde vara bunden. Detta visas i det visade exemplet som en relativt liten mängd GFP-Ng elueras i EDTA skick. Kvantifiering av protein innan inkubering med pärlor kan hjälpa lindra detta.
Korrekt beredning och hantering av CAM-sepharose pärlor hela experimentet är också viktigt för framgång. Pärlor kan lätt gå förlorad under försöket, antingen av misstag bort med supernatanten till kasseras eller fastna på sidorna och toppen av 2,0 ml tub. Detta kan undvikas genom att använda försiktighet och ta av supernatanten och säkerställa omsorgsfull blandning omedelbart före centrifugering. Försök att inte låta prover sitta mellan blandning och centrifugering eftersom det gör att CAM-sepharose pärlor att torka på sidorna av röret. Som en försiktighetsåtgärd, resuspendera pärlor och roTate lösning runt röret för att blöta pärlor omedelbart före centrifugering. Grundlig nedsänkning av proverna med pärlor både under bindande och inkubationer eluering är mycket viktigt. Utan lämplig blandning av provet med pärlor, kommer bindande och eluering sannolikt ineffektivt.
Detta protokoll är mångsidig och kan lätt ändras för andra ändamål. Genomföra det här försöket med stympade eller muterade proteiner kan avslöja information om regionen (er) och rester av proteinet som är viktiga för CAM bindande och Ca2 +-beroende, om det observerade. I fallet Ng, kunde vi visa att GFP-Ng, som endogena proteinet binder CAM bara i avsaknad av Ca 2 + 8. För att ytterligare utforska denna funktion av denna bindning, olika mutationer av detta protein förändra dess IQ-domän hjälpa till att förstå vilken typ av Ngs interaktion med CAM samt funktion av post-translationella modifieringar, som ändrar detta InteraInsatser. Vi testade om vikten av Ng-CAM bindande med två olika mutanter: en phosphomimic aspartat i stället för en serin (S36D eller naturgas-SD) och en IQ mindre Ng för att förhindra bindning till CAM. Vi genererade också en mutant (Ng-SFAW) som har förbättrat bindning till CAM, vistas bundet även i närvaro av Ca 2 +. Slutligen använde vi en icke-phosphorylatable mutant (Ng-SA) som binder till Cam i ett Ca2 +-beroende sätt som liknar kroppsegna Ng men förhindrar fosforylering av proteinkinas C (PKC). CAM pull-down analys hjälpt testa funktionaliteten av dessa olika mutanter och hjälpte visa på vikten av Ng-CAM bindande av synapserna 8 och hur Ng fosforylering finjustera synaptisk plasticitet 15.
Dessutom kan proteiner som binder till CAM-bindande proteiner elueras. Detta kan ge ytterligare tillämpningar av denna analys för att avgöra proteiner som indirekt binder CAM. Det gör att studier av dessa andra interagerarjoner och andra potentiella nedströms effekter av CAM och dess bindande partner.
Sammanfattningsvis innehåller CAM pull-down-analysen ett effektivt sätt att undersöka Ca2 +-beroende av CAM-protein interaktioner. Detta kan vara ett viktigt verktyg för att studera CAM-protein interaktioner och hur olika mutationer eller ändringar kan påverka dessa interaktioner. Detta kan vara värdefullt att utforska regleringen av Ca 2 + / CAM signalvägar. Dessutom kan vi använda detta för att undersöka sjukdomar som orsakas av störningar i Ca 2 + / CAM-signalering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Tiffany Cherry i hennes hjälp för att optimera detta protokoll. Detta arbete har finansierats av National Institute of Aging (AG032320) samt vidareutveckla ett hälsosammare Wisconsin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calmodulin-Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0529-01 | |
| Anti-CamKII alpha | Sigma-Aldrich | C6974 | |
| Anti-neurogranin | EMD Millipore | 07-425 | |
| Gel Loading Pipet Tips | Fisher Scientific | 02-707-138 | Use for aspiration of supernatants |
| Microcentrifuge tubes (2.0 mL) | Fisher Scientific | 05-408-146 | Use for all steps involving calmodulin-sepharose beads |
References
- Vincenzi, F. F. Calmodulin in the regulation of intracellular calcium. Proc. West Pharmacol Soc. 22, 289-294 (1979).
- Cheung, W. Y. Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation. Science. 207, 19-27 (1980).
- Zhang, M., Tanaka, T., Ikura, M. Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin. Nat. Struct. Biol. 2, 758-767 (1995).
- Alexander, K. A., Wakim, B. T., Doyle, G. S., Walsh, K. A., Storm, D. R. Identification and characterization of the calmodulin-binding domain of neuromodulin, a neurospecific calmodulin-binding protein. J. Biol. Chem. 263, 7544-7549 (1988).
- Huang, K. P., Huang, F. L., Chen, H. C. Characterization of a 7.5-kDa protein kinase C substrate (RC3 protein, neurogranin) from rat brain. Arch. Biochem. Biophys. 305, 570-580 (1993).
- Bahler, M., Rhoads, A. Calmodulin signaling via the IQ motif. FEBS Lett. 513, 107-113 (2002).
- Routtenberg, A. Protein kinase C activation leading to protein F1 phosphorylation may regulate synaptic plasticity by presynaptic terminal growth. Behav. Neural. Biol. 44, 186-200 (1985).
- Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin. EMBO J. 28, 3027-3039 (2009).
- Needham, D. M. Myosin and adenosinetriphosphate in relation to muscle contraction. Biochim. Biophys. Acta. 4, 42-49 (1950).
- Hathaway, D. R., Adelstein, R. S. Human platelet myosin light chain kinase requires the calcium-binding protein calmodulin for activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1653-1657 (1979).
- Fukunaga, K., Yamamoto, H., Matsui, K., Higashi, K., Miyamoto, E. Purification and characterization of a Ca2+- and calmodulin-dependent protein kinase from rat brain. J. Neurochem. 39, 1607-1617 (1982).
- Yang, S. D., Tallant, E. A., Cheung, W. Y. Calcineurin is a calmodulin-dependent protein phosphatase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 106, 1419-1425 (1982).
- Huestis, W. H., Nelson, M. J., Ferrell, J. E. J. Calmodulin-dependent spectrin kinase activity in human erythrocytes. Prog. Clin. Biol. Res. 56, 137-155 (1981).
- Yamniuk, A. P., Vogel, H. J. Calmodulin's flexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides. Mol. Biotechnol. 27, 33-57 (2004).
- Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation. Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).
