Summary
Calmodulin परख (सीएएम) पुल - डाउन विभिन्न प्रोटीन के साथ सीएएम की बातचीत की जांच के लिए एक प्रभावी तरीका है. इस विधि सीएएम बंधनकारी प्रोटीन के कुशल और विशिष्ट विश्लेषण के लिए अभियान sepharose मनकों का उपयोग करता है. यह एक महत्वपूर्ण सेलुलर समारोह में सीएएम संकेत का पता लगाने के लिए उपकरण प्रदान करता है.
Protocol
Homogenate के साथ एक प्रक्रिया की शुरुआत के बुनियादी ढांच के लिए चित्रा 1 देखें. सेलुलर अर्क की तैयारी से सीएएम बाध्य प्रोटीन की क्षालन अनुमानित समय के बारे में छह से सात घंटे है.
1. ऊतक तैयारी
- एक वायरस युक्त एक ब्याज की पुनः संयोजक प्रोटीन (इस उदाहरण में, हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन एनजी (GFP) टैग) और ऊतक प्रोटीन व्यक्त करने के लिए रातोंरात की अनुमति व्यक्त प्लाज्मिड के साथ organotypic hippocampal स्लाइस इंजेक्षन.
- वायरल इंजेक्शन के बाद लगभग 12 से 18 घंटे (वायरल अभिव्यक्ति के समय पर निर्भर करता है), ऊतक इकट्ठा तैयार. 1ml विच्छेदन बफर (10mm ग्लूकोज, KCl 4mm, NaHCO3 26mm, 233mM sucrose, 5mm 2 MgCl, 1mm 2 CaCl, और 0.1% phenol लाल, मार डाला के साथ 5% 2 हे 2 95% सीओ) एक पेट्री डिश में जोड़ें . पेट्री डिश को सुसंस्कृत ऊतक / डालने के स्थानांतरण और डूब के लिए ऊतक डालने के लिए 2ml विच्छेदन बफर जोड़ने.
- संग्रहधीरे ऊतक डालने झिल्ली के एक स्केलपेल का उपयोग कर मुक्त scraping द्वारा organotypic hippocampal ऊतक (बीच 5 और 10 स्लाइस). विशेष रूप से ब्याज की एक विशेष क्षेत्र (CA1 उदाहरण के लिए) को हटाने के भी एक विकल्प है. 1.5mL microcentrifuge एक औंधा पाश्चर पिपेट का उपयोग कर ट्यूब को निलंबित कर दिया ऊतक स्थानांतरण.
- 1 मिनट के लिए 1,500 आरसीएफ पर नमूने अपकेंद्रित्र विच्छेदन बफर से ऊतक अलग. ध्यान से आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला हटा दें. गोली को परेशान नहीं करने के लिए सुनिश्चित करें.
- के लिए प्रत्येक टुकड़ा इस्तेमाल किया, homogenization बफर (150mm NaCl, 20mm Tris पीएच 7.5, 1mm डीटीटी, 1μg/mL leupeptin, 1μg/mL chemostatin, 1μg/mL antipain, 1μg/mL pepstatin, और 1% Triton एक्स के 30 से 60 μL जोड़ने ऊतक करने के लिए) -100 और मूसल के साथ अच्छी तरह से homogenize.
- आदेश में सेलुलर मलबे को हटाने के लिए, 10 मिनट के लिए 1100 आरसीएफ में शेष homogenate अपकेंद्रित्र और ध्यान से आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला दूर जबकि गोली से संदूषण से परहेज.
- इनपुट (एक नमूना) का एक नमूना के रूप में सतह पर तैरनेवाला का 10% ले लो. चरण 3 में उपयोग के लिए सांचा sepharose मोतियों की तैयारी के दौरान बर्फ पर शेष सतह पर तैरनेवाला स्टोर.
नोट: यहां इस्तेमाल ऊतक organotypic hippocampal स्लाइस हैं. हालांकि, एक अलग न्यूरॉन्स या किसी अन्य सेल संवर्धन प्रणाली का इस्तेमाल कर सकते हैं. ऐसे एक मामले में उचित तरीके से अपने ऊतक एकत्रित के बाद 1.4 कदम पर शुरू करते हैं.
2. मोतियों के पुल से नीचे के लिए तैयार
मोती से निपटने में यह मोती उबार और ट्यूब के पक्षों पर सूखने से मोती को रोकने द्वारा प्रतिक्रियाओं की क्षमता को अधिकतम करने के लिए महत्वपूर्ण है. ऐसा करने के लिए, यह सबसे अच्छा है उनके पक्ष में अपनी ट्यूबों को घुमाने के लिए, समाधान ट्यूब की दीवारों पर मोती गीला करने की अनुमति centrifugation से ठीक पहले.
- के लिए प्रत्येक पुल डाउन, पिपेट एक 2 एमएल microcentrifuge ट्यूब में 400 μL निलंबित Calmodulin Sepharose मोतियों की एक अपेक्षाकृत fla के साथटी नीचे करने के लिए अपने incubations दौरान मोतियों के साथ सतह और अपने समाधान के क्षेत्र में बातचीत को अधिकतम.
- 30 सेकंड के लिए 21,000 आरसीएफ पर मोती अपकेंद्रित्र और ध्यान से आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला हटायें. मोती को परेशान नहीं करने के लिए सुनिश्चित करें.
- मोती धोने के लिए, संबंधित homogenization के लिए पुल डाउन Ca 2 + कैम बाध्यकारी प्रोटीन और मोतियों के लिए 2 मिमी EDTA (2 Ca जाना जाता है + chelator) नीचे खींच के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है उन लोगों के लिए या तो 2 CaCl 2 मिमी युक्त बफर के 100 μL जोड़ें ApoCaM बंधनकारी प्रोटीन. धीरे से 1 मिनट के लिए 1,500 आरसीएफ पर फिर से निलंबित मोती और अपकेंद्रित्र ट्यूब नल. ध्यान से आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला निकालने के लिए, मोती को परेशान नहीं सुनिश्चित करने के.
नोट: सभी आकांक्षा कदम के लिए, यह एक विंदुक टिप है कि एक ठीक (जैसे जेल लोड हो रहा है युक्तियाँ) खोलने के लिए मनकों को हटाने के बिना समाधान को हटाने की अनुमति है का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है.
3. अभियान sepharose प्रोटीन के बंधन
- दो एक बराबर मात्रा युक्त शर्तों में अपनी सतह पर तैरनेवाला भाजित. अपनी हालत पर निर्भर करता है, प्रत्येक के लिए 2 मिमी एकाग्रता के लिए अपने सतह पर तैरनेवाला 2 CaCl या EDTA की उचित राशि जोड़ें.
- 1.7 कदम से सतह पर तैरनेवाला इसी homogenization बफर में धोया मोतियों के लिए जोड़ें. धीरे ट्यूब नल मिश्रण करने के लिए.
- 4 ° C पर एक प्रकार के बरतन पर 3 घंटे के लिए नमूने सेते हैं. मोती हर 30 मिनट या तो पुनः निलंबित लिए बाध्य करने में दक्षता में वृद्धि.
- अपकेंद्रित्र ट्यूब 3 मिनट के लिए 1,500 आरसीएफ पर नमूनों और मोतियों से युक्त.
- अनबाउंड प्रोटीन (2 नमूना) का एक नमूना के रूप में सतह पर तैरनेवाला के 50μL ले लो और ध्यान आकांक्षा और त्यागें द्वारा शेष सतह पर तैरनेवाला हटायें.
- मोती के रूप में तीन बार धो 2.3 कदम संबंधित homogenization बफर के 100μL का उपयोग करने में वर्णित.
4. क्षालन
- 50μL क्षालन बफर (50mm Tris - एचसीएल 7.5 पीएच, और 150mm NaCl) के विपरीत हालत (10mm सी युक्त जोड़ेंएसीएल 2 या 10mm EDTA मोतियों के लिए). उदाहरण के लिए, नमूने है कि homogenized और 2 Ca युक्त बफर में बंधे थे + क्षालन EDTA और उपाध्यक्ष प्रतिकूल युक्त बफर में eluted हैं .
वैकल्पिक: 37 क्षालन बफर वार्मिंग डिग्री सेल्सियस से पहले मोतियों के लिए जोड़ने उपज बढ़ाने सकता है.
- एक प्रकार के बरतन पर 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मोतियों के साथ समाधान सेते हैं. धीरे हर 5 मिनट के बारे में ट्यूब दोहन द्वारा मोती मिक्स.
- 3 मिनट के लिए 1,500 आरसीएफ पर मोती अपकेंद्रित्र और ध्यान से बाध्य प्रोटीन (3 नमूना) के लिए आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला के 50μL हटायें. मोती को परेशान नहीं करने के लिए सुनिश्चित करें.
- सभी नमूने (यानी homogenate अनबाउंड, और बाध्य प्रोटीन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वे अभी भी मोतियों के लिए बाध्य) के लिए प्रोटीन लोड हो रहा है बफर जोड़ें.
नोट: क्षालन (अक्षम क्षालन के मामले में विशेष रूप से) को अधिकतम करने, इसी क्षालन बफर के 50μL (जैसे EDTA युक्त buf जोड़ने जोड़नेCaCl 2 में ही मदद से किसी भी शेष बाध्य प्रोटीन और दोहराने 4.3 में वर्णित शेष बाध्य प्रोटीन निकालने कदम elute नमूने हीटिंग से पहले मोती) मोती के fer.
5. एसडीएस पृष्ठ और पश्चिमी धब्बा
एसडीएस पृष्ठ आचरण और एक एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में विपरीत हालत में सीएएम बाँध के लिए जाना जाता प्रोटीन के लिए ब्याज और जांच के अपने प्रोटीन के लिए जांच करके पश्चिमी दाग का उपयोग विश्लेषण.
6. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 2B एक अभियान पुल डाउन GFP-टैग एनजी के सीएएम अंतर्जात एनजी की तुलना में बाध्यकारी परीक्षण परख का एक उदाहरण से पता चलता है. ऐसा करने के लिए, GFP-एनजी हमारे organotypic hippocampal स्लाइस में overexpressed था रातोंरात और ऊतक homogenized गया था. homogenate अभियान sepharose मोती के साथ या तो 2 Ca + या EDTA की उपस्थिति में incubated था . Homogenate इनपुट से पता चलता है कि GFP-एनजी अंतर्जात एनजी और 2 Ca + / सीएएम निर्भर kinase द्वितीय के अलावा में व्यक्त की गई थी(CaMKII). अंतर्जात एनजी (चित्र 2A में सचित्र) के नाम से जाना बंधन पर आधारित उम्मीद, GFP टैग एनजी 2 Ca + (EDTA बाध्य प्रोटीन) की अनुपस्थिति और 2 Ca + की उपस्थिति में अनबाउंड (छवि 2B) में eluted . इसके विपरीत, नियंत्रण, CaMKII, Ca + 2 (बाध्य प्रोटीन) की उपस्थिति में ही eluted था और इसके अभाव (EDTA) में अनबाउंड था. इससे पता चलता है कि सीएएम मोती ठीक से कार्य कर रहे थे और elutions कुशल थे. सबसे महत्वपूर्ण बात, यह दिखाता है कि GFP-एनजी अंतर्जात फार्म के लिए एक समान फैशन में ApoCaM बांधता है, सुझाव है कि GFP टैग हमारे पुनः संयोजक प्रोटीन के समारोह में बदल नहीं किया.
चित्रा कैम पुल - डाउन परख के बाह्यरेखा 1.
(ए) ऊतक homogenate सेलुलर मलबे को हटाने के नीचे घूमती है. सतह पर तैरनेवाला के बारे में 10% इनपुट (1) का एक नमूना के रूप में लिया जाता है. शेष सतह पर तैरनेवाला समान रूप से अलग करने के लिए विभाजित हैस्थितियों और उपयुक्त अभिकर्मकों (2 CaCl या EDTA) उन शर्तों में बाध्यकारी परीक्षण करने के लिए जोड़ रहे हैं. प्रत्येक सतह पर तैरनेवाला (या तो 2 CaCl या EDTA युक्त) क्रमशः तैयार सीएएम sepharose मोती पर भरी हुई है और (ख) के लिए बाध्य की अनुमति incubated. अनबाउंड प्रोटीन (2) को हटा रहे हैं और (सी) बाध्य प्रोटीन (3) क्षालन (EB) बफर बंधन के रूप में विपरीत हालत युक्त का उपयोग मोतियों की eluted हैं. इन तीन प्रोटीन के नमूने के प्रोटीन संरचना एसडीएस पृष्ठ और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का उपयोग विश्लेषण किया जा सकता है.
चित्रा 2 Ca के 2 ए) योजनाबद्ध + निर्भर सीएएम और पुल - डाउन परख उदाहरण में बाध्यकारी क्षालन प्रोटीन की दो प्रकार कि एक 2 CA में बाँध कैम + निर्भर तरीके से दिया जाता है . Neurogranin (एनजी) प्रोटीन है कि बाँध APO सीएएम और CaMKII प्रोटीन है कि 2 + अमीर Ca करने के लिए बाध्य का प्रतिनिधित्व करता है का प्रतिनिधित्व करता हैसीएएम. कैम अपनी अलग राज्य में दिखाया गया है homogenate प्रोटीन के साथ ऊष्मायन से पहले. एक बार उच्च Ca 2 + सांद्रता (2 मिमी) की शर्तों के तहत या एक 2 Ca की उपस्थिति में incubated + chelator, EDTA (2 मिमी), प्रोटीन कैम तदनुसार बाध्य होगी . एनजी कैम EDTA हालत में बांध के रूप में वहाँ कोई 2 Ca + वर्तमान थोड़ा है, और बंद eluted होगा 2 Ca + की उपस्थिति में सांचा sepharose मोती. CaMKII, तथापि, Ca 2 की उच्च मात्रा की उपस्थिति में सीएएम करने के लिए बाध्य + और एक बार सीए 2 + chelated था अलग कर देना होगा.
बी उदाहरण कैम पुल - डाउन परख से परिणाम). यह आंकड़ा दर्शाता है कि एक अभियान sepharose की उम्मीद अंत परिणाम एनजी और CaMKII के लिए जांच नमूने के साथ नीचे खींच. दोनों अंतर्जात एनजी और GFP-एनजी EDTA की उपस्थिति में सीएएम करने के लिए बाध्य प्रोटीन की गलियों में मौजूद हैं. नहीं एनजी जब नमूने अभियान के साथ Ca + 2 की उपस्थिति में incubated हैं स्वाभाविक है, प्रदर्शन है कि एनछ केवल दूर से सांचा बांधता है. हमारी सकारात्मक नियंत्रण, CaMKII, दूसरे हाथ पर, केवल 2 Ca की उपस्थिति में सीएएम बांध +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
प्रदान प्रोटोकॉल सांचा - sepharose मोती का इस्तेमाल करने के लिए सीए 2 + सीएएम बंधनकारी प्रोटीन की निर्भरता की जांच . कई प्रोटीन Ca 2 + निर्भर तरीके में सीएएम बाँध. इन मुलाकातों सांचा - बंधनकारी प्रोटीन की संख्या और उनके कई संकेत दे रास्ते में महत्वपूर्ण भूमिका दी महान महत्व के हैं. इस प्रोटोकॉल में, सीएएम - sepharose मोती ऊतक homogenate से 2 Ca + की उपस्थिति या अनुपस्थिति में सांचा बंधनकारी प्रोटीन को अलग किया जाता है . इस सरल दृष्टिकोण का परिणाम कैसे प्रोटीन अभियान के साथ Ca 2 + निर्भर तरीके में बातचीत कर सकते हैं की समझ आगे जाएगा. इस प्रोटीन में एक तकनीक आमतौर पर इस्तेमाल किया बाध्यकारी अध्ययन, कॉलम क्रोमैटोग्राफी, कि सीएएम sepharose मोती समाधान के बजाय एक मैट्रिक्स में तय कर रहे हैं दृष्टिकोण से अलग है.
एक स्तंभ के उपयोग से बचना इस दृष्टिकोण का एक लाभ है, क्योंकि स्तंभ बिना प्रोटोकॉल कम समय लगता है, के रूप में वहाँ कोई है NEएड एक स्तंभ संतुलित करना या प्रवाह के माध्यम से गुरुत्वाकर्षण के लिए प्रतीक्षा करें. कारण को अपनी क्षमता के आधार के लिए, पुल डाउन कैम कॉलम क्रोमैटोग्राफी की तुलना में काफी कम ऊतक की आवश्यकता है और नमूना तैयारी सरल, प्रोटीन नमूना से सेलुलर मलबे की जुदाई के रूप में केवल अभियान sepharose के लिए एक छोटी centrifugation पुल से नीचे वर्णित की आवश्यकता है. स्तंभ प्रोटीन के नमूने है कि किसी भी सेलुलर मलबे, जो अतिरिक्त शुद्धि चरणों की आवश्यकता हो सकती है के लिए स्वतंत्र हैं की आवश्यकता होती है. यह दृष्टिकोण भी अन्य खींच अधिक तरीकों नीचे सह immunoprecipitation है, जो चारा इसे कब्जा प्रोटीन और नमूने में किसी भी बातचीत के प्रोटीन के खिलाफ एक एंटीबॉडी की आवश्यकता है जैसे लाभ है. चारा प्रोटीन पर कब्जा करने के लिए एक एंटीबॉडी का उपयोग एक सीमा के रूप में प्रयोग के दौरान एंटीबॉडी और प्रोटीन के बीच गरीब बातचीत एक अक्षम खींचने के लिए नीचे नेतृत्व कर सकते हैं कर सकते हैं. इन संभावित समस्याओं को वर्णित पुल से नीचे अभियान sepharose के उपयोग के साथ से परहेज कर रहे हैं.
हालांकि तरह,सह immunoprecipitation और कॉलम क्रोमैटोग्राफी assays, सीएएम sepharose पुल डाउन पूर्व अभियान बाध्यकारी vivo में करने के लिए सीमित है. प्राप्त परिणामों कैम बातचीत के vivo वास्तविकता में प्रतिबिंबित नहीं कर सकते. उदाहरण के लिए, बाद translational संशोधनों अक्सर प्रोटीन बातचीत का प्रभाव. इस neurogranin, अभियान के साथ बातचीत जिसका PKC अपनी बुद्धि 5 डोमेन की phosphorylation की मध्यस्थता से रोका है के लिए मामला है . ऊतक homogenizing kinases या phosphatases जैसे एंजाइमों लक्ष्य प्रोटीन है जो सामान्य रूप से कोशिका के भीतर एंजाइमों से अलग होगा का उपयोग करने के लिए अनुमति देकर उदाहरण के लिए बाद translational संशोधनों को बदल सकता है. स्थानीयकरण और / या compartmentalization के विघटन भी अनुमति बंधन जब दो प्रोटीन सामान्य रूप से एक कक्ष में बातचीत करने के लिए करने का मौका नहीं होगा सकता है. इन प्रतिक्रियाओं को कम करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है तैयारी और लदान के बीच बर्फ पर सभी नमूनों की दुकान. यह इस कारण के लिए भी है कि मोतियों के साथ ऊष्मायन डॉन है4 में ई डिग्री सेल्सियस फॉस्फेट inhibitors या अन्य एंजाइम inhibitors भी homogenization बफ़र्स के लिए जोड़ा जा सकता है है उनके प्रभाव को सीमित करने में मदद.
यह प्रयोग करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोई महत्वपूर्ण त्रुटियों प्रयोग के दौरान हुई एक सकारात्मक नियंत्रण के लिए महत्वपूर्ण है. यह भी सुनिश्चित + कर सकते हैं कि शर्तों में मतभेद सीएएम में गठनात्मक परिवर्तन के कारण पर्याप्त थे, और सीए 2 की उपस्थिति या अनुपस्थिति में विभिन्न प्रोटीन बाध्य करने की अनुमति. उदाहरण के लिए, अगर वहाँ हित के प्रोटीन के लिए कोई संकेत है, यह लोड करने में त्रुटि या अन्य संभावित त्रुटियों के कारण हो सकता है. एक और अन्य परिस्थितियों में बाँध (जैसे प्रदान उदाहरण में CaMKII के रूप में) ज्ञात प्रोटीन के लिए जांच संभावित त्रुटियों को हल करने में मदद कर सकते हैं. कम 2 Ca + या 2 Ca + chelator सांद्रता (जैसे EDTA) भी परिणाम की उम्मीद के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं . EDTA सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है, लेकिन अन्य दो Ca + chelators (जैसे EGTA) और अधिक प्रभावी हो सकता है है अगर भी उच्च concentratआयनों अप्रभावी कर रहे हैं. अत्यधिक सीएएम बाध्यकारी प्रोटीन भी अप्रत्याशित परिणाम के लिए नेतृत्व के रूप में यह उपलब्ध कैम sepharose मोती तर, प्रोटीन की क्षालन के कारण जब यह बाध्य होने चाहिए हो सकता है सकते हैं. इस दिखाए गए उदाहरण में देखा जाता है GFP-एनजी की एक अपेक्षाकृत छोटी मात्रा के रूप में EDTA हालत में eluted है. मोती के साथ ऊष्मायन पहले प्रोटीन की मात्रा का ठहराव मदद कर सकते हैं इस उन्नति.
उचित और प्रयोग भर में अभियान sepharose मोतियों की तैयारी हैंडलिंग भी सफलता के लिए आवश्यक है. मोती आसानी से प्रयोग के दौरान खो दिया जा सकता है, या तो अनजाने में सतह पर तैरनेवाला के साथ हटा खारिज हो सकता है या और पक्षों 2.0 एमएल ट्यूब के शीर्ष पर अटक. यह सावधानी का उपयोग करते हुए सतह पर तैरनेवाला हटाने और पहले centrifugation पूरी तरह से तुरंत मिश्रण सुनिश्चित करने से बचा जा सकता है. नहीं दो नमूने मिश्रण और centrifuging के रूप में यह अभियान sepharose मोती ट्यूब के पक्षों पर शुष्क करने की अनुमति देता है के बीच बैठ करने की कोशिश करो. एक एहतियाती उपाय, resuspend मोती और ro के रूप मेंcentrifugation तुरंत पहले गीला मोती ट्यूब के आसपास टेट समाधान. मोतियों के साथ दोनों बाध्यकारी और क्षालन incubations के दौरान नमूनों की गहन विसर्जन बहुत महत्वपूर्ण है. मोतियों के साथ नमूने के उपयुक्त मिश्रण के बिना, बाध्यकारी और क्षालन संभावना अक्षम हो जाएगा.
इस प्रोटोकॉल बहुमुखी है और आसानी से अन्य प्रयोजनों के लिए संशोधित किया जा सकता है. छोटा या उत्परिवर्तित प्रोटीन के साथ इस प्रयोग का प्रदर्शन इस क्षेत्र के बारे में जानकारी (एस) और प्रोटीन के अवशेषों कि सीएएम बंधन और सीए 2 + निर्भरता के लिए महत्वपूर्ण हैं पता चलता है, अगर देखा जा. एनजी के मामले में, हम को दिखाने के लिए कि GFP-एनजी, अंतर्जात प्रोटीन की तरह, Ca 2 + 8 के अभाव में ही सीएएम बांध सक्षम थे. आगे इस प्रोटीन के इस बंधन, विभिन्न म्यूटेशनों इसकी मदद बुद्धि डोमेन बदलने के रूप में अच्छी तरह के रूप में बाद translational संशोधनों के समारोह सीएएम, के साथ एनजी बातचीत की प्रकृति को समझने के इस समारोह का पता लगाने के जो इस intera बदलction. सेरीन की जगह (S36D या एनजी - एसडी) में एक phosphomimic aspartate और एक बुद्धि कम सीएएम के लिए बाध्य रोकने के एनजी: हम एनजी सांचा बंधन दो अलग अलग म्यूटेंट का उपयोग करने के महत्व का परीक्षण किया. हम भी एक उत्परिवर्ती (एनजी - SFAW) जो सीएएम के लिए बाध्य बढ़ाया गया है, रह 2 Ca की उपस्थिति में भी बाध्य + उत्पन्न अंत में, हम एक गैर phosphorylatable (एनजी एसए) उत्परिवर्ती जो Ca 2 + निर्भर अंतर्जात एनजी समान फैशन में सीएएम को बांधता है, लेकिन प्रोटीन kinase सी (PKC) से phosphorylation रोकता इस्तेमाल किया . कैम पुल - डाउन परख इन विभिन्न म्यूटेंट की कार्यक्षमता का परीक्षण करने में मदद और मदद की एनजी सांचा synaptic समारोह में 8 बंधन के महत्व को दिखाने के और एनजी कैसे phosphorylation ठीक धुन 15 synaptic plasticity में मदद करता है.
इसके अलावा, प्रोटीन है कि सांचा बंधनकारी प्रोटीन के लिए बाध्य eluted जा सकता है. यह प्रोटीन है कि परोक्ष रूप से सीएएम बाँध का निर्धारण करने में इस परख के आगे अनुप्रयोगों प्रदान कर सके. यह इन अन्य बातचीत के अध्ययन की अनुमति देता हैआयनों और सीएएम और उसके बंधन भागीदारों के अन्य संभावित बहाव प्रभाव.
सारांश में, सीएएम पुल - डाउन परख एक कुशल और प्रभावी Ca 2 + कैम प्रोटीन बातचीत की निर्भरता की जांच के लिए रास्ता प्रदान करता है. इस कैम प्रोटीन बातचीत का अध्ययन और विभिन्न म्यूटेशनों या संशोधन इन मुलाकातों कैसे प्रभावित कर सकता है एक महत्वपूर्ण उपकरण किया जा सकता है. यह Ca 2 + / सीएएम संकेत दे रास्ते के विनियमन की खोज में मूल्यवान हो सकता है है. इसके अलावा, हम इस का उपयोग करने के लिए + सीएएम / संकेतन 2 CA में अवरोधों की वजह से विकृतियों का पता लगाने कर सकते हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों उसकी मदद करने में इस प्रोटोकॉल अनुकूलन में टिफ़नी चेरी का शुक्रिया अदा करना होगा. यह काम उम्र बढ़ने के राष्ट्रीय संस्थान (AG032320) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक स्वस्थ विस्कॉन्सिन में आगे बढ़ने के द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calmodulin-Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0529-01 | |
| Anti-CamKII alpha | Sigma-Aldrich | C6974 | |
| Anti-neurogranin | EMD Millipore | 07-425 | |
| Gel Loading Pipet Tips | Fisher Scientific | 02-707-138 | Use for aspiration of supernatants |
| Microcentrifuge tubes (2.0 mL) | Fisher Scientific | 05-408-146 | Use for all steps involving calmodulin-sepharose beads |
References
- Vincenzi, F. F. Calmodulin in the regulation of intracellular calcium. Proc. West Pharmacol Soc. 22, 289-294 (1979).
- Cheung, W. Y. Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation. Science. 207, 19-27 (1980).
- Zhang, M., Tanaka, T., Ikura, M. Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin. Nat. Struct. Biol. 2, 758-767 (1995).
- Alexander, K. A., Wakim, B. T., Doyle, G. S., Walsh, K. A., Storm, D. R. Identification and characterization of the calmodulin-binding domain of neuromodulin, a neurospecific calmodulin-binding protein. J. Biol. Chem. 263, 7544-7549 (1988).
- Huang, K. P., Huang, F. L., Chen, H. C. Characterization of a 7.5-kDa protein kinase C substrate (RC3 protein, neurogranin) from rat brain. Arch. Biochem. Biophys. 305, 570-580 (1993).
- Bahler, M., Rhoads, A. Calmodulin signaling via the IQ motif. FEBS Lett. 513, 107-113 (2002).
- Routtenberg, A. Protein kinase C activation leading to protein F1 phosphorylation may regulate synaptic plasticity by presynaptic terminal growth. Behav. Neural. Biol. 44, 186-200 (1985).
- Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin. EMBO J. 28, 3027-3039 (2009).
- Needham, D. M. Myosin and adenosinetriphosphate in relation to muscle contraction. Biochim. Biophys. Acta. 4, 42-49 (1950).
- Hathaway, D. R., Adelstein, R. S. Human platelet myosin light chain kinase requires the calcium-binding protein calmodulin for activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1653-1657 (1979).
- Fukunaga, K., Yamamoto, H., Matsui, K., Higashi, K., Miyamoto, E. Purification and characterization of a Ca2+- and calmodulin-dependent protein kinase from rat brain. J. Neurochem. 39, 1607-1617 (1982).
- Yang, S. D., Tallant, E. A., Cheung, W. Y. Calcineurin is a calmodulin-dependent protein phosphatase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 106, 1419-1425 (1982).
- Huestis, W. H., Nelson, M. J., Ferrell, J. E. J. Calmodulin-dependent spectrin kinase activity in human erythrocytes. Prog. Clin. Biol. Res. 56, 137-155 (1981).
- Yamniuk, A. P., Vogel, H. J. Calmodulin's flexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides. Mol. Biotechnol. 27, 33-57 (2004).
- Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation. Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).
