Summary
Biz roman laboratuar araçları ve timus intravital görüntü elde etmek için protokoller geliştirdik. Bizim tekniği T hücre gelişimi oluşur timus içinde "nişler" belirlenmesinde yardımcı olacaktır.
Abstract
İki foton Mikroskobu (TPM), doku ve organları içinde derin alanlarında görüntü alımı sağlar. Yeni stereotaktik araçları ve cerrahi işlemlerin gelişimi ile birlikte, TPM organları içinde "nişler" belirlemek ve canlı hayvan hücresel "davranışlar" belgelemek için güçlü bir tekniği haline gelir. Intravital görüntüleme en iyi organ içindeki gerçek hücresel davranış benzer bilgiler sunarken, daha zahmetli ve daha teknik daha gerekli ekipman / alternatif ex vivo görüntüleme satın alma prosedürleri açısından zorlu hem de . Bu nedenle, biz, cerrahi bir işlemdir ve Foxp3, hareketleri + hücreleri timus içinde izlemenizi sağlar romanı "stereotaktik" organ sahibinin tarif.
Foxp3 düzenleyici T hücreleri (Tregs) üretimi için ana düzenleyicisidir. Yani: Ayrıca, bu hücrelerin kökenlerine göre sınıflandırılmış olabilir. timus diferansiye Tregs o, "doğal olarak meydana gelen Tregs" (nTregs) denirperiferik dönüştürülmüş Tregs (pTregs) pposed. Önemli miktarda araştırma, bu T hücre fenotipi ve fizyolojisi ile ilgili literatürde bildirilmiş olmasına rağmen, onların diğer hücrelere in vivo etkileşimleri hakkında bilinen çok az. Bu eksiklik, bu tür gözlemler izin verecek teknikler olmaması nedeniyle olabilir. Bu yazıda açıklanan protokol, bu durum için bir çare sağlar.
Protokol zamanında timik epitel hücreleri dahil olmak üzere bazı epitel hücrelerinin farklılaşması ödün DNA dizilimi bir mutasyon beri endojen bir timus yoksun çıplak farelerin kullanarak oluşur. Çıplak fareler gama ışınlanmış ve Foxp3-KI GFP / GFP farelerden alınan kemik ilikleri (BM) ile sulandırılır. BM kurtarma (6 hafta) sonra, her bir hayvan, böbrek kapsülü içinde embriyonik timus nakli yapıldı. Timus kabul (6 hafta) sonra, hayvanların anestezi; böbrek içerennakledilen timus, maruz kalan organ tutucuya sabit ve in vivo görüntüleme için TPM tarafından fizyolojik şartlar altında tutulur . Biz düzenleyici T hücrelerinin nesil ilaçların etkisini incelemek için bu yaklaşım olmuştur.
Protocol
1. Hayvan hazırlık
Önemli notlar: BM hücre süspansiyonları ve timik transplantasyon aseptik koşullarda yapıldı. Timik nakli hayvan tesis içinde yer alan cerrahi odasında yapıldı BM süspansiyonlar, hücre kültürü oda davlumbaz içinde hazırlandı. Bu aseptik koşullarda tutmak ve garanti altına almak için, biz bu yerlerin video kaydetmek için izin verilmiyordu. Ancak, tüm cerrahi malzemelerin otoklava ve daha önce cerrahi tezgah Virkon ® (Pharmacal Research Laboratories Inc) ve% 70 etanol ile temizlendi. Tüm işlemler onaylanmış ve Kurumsal Hayvan Bakım Komitesi (IACUC) kullanın ve Avrupa Laboratuar Hayvan Bilimi Birlikleri (FELASA) direktifleri Federasyonu ile anlaşmaya vardı. Onay ID'niz AO10/2010. Tüm görüntü deneyler terminali prosedürleri ve hayvanlar görüntü sona ermesinin ardından hemen ötenaziedinimi.
Ayrıntılı prosedür aşağıdaki gibidir:
- Işın tedavisi (γ ışınlama ile) kemik ilikleri (BM) içinde endojen hematopoietik öncüleri yok etmek için 900 rad ile 8 hafta eski Çıplak fareler. Intravenöz enjeksiyon ve daha fazla BM sulandırıldıktan için donör BM hücreleri hazırlamak kadar ışınlama sonra, kafesler, hayvanların geri. Bu BM transferi 1 saat ışınlama sonrası yapıldı.
- BM donör hayvanlar ayırın. Bir hayvanın arka bacaklarda tibiaları ve femur 3 alıcı hayvanlara sulandırmak için yeterli. CO 2 ile ötenazi sonra, arka bacaklarda kaldırmak ve sonra kemiklerinden kas ve deri kaldırın.
- Her kemik kapalı ucunu kesin ve BM kaldırmak için 2 ml PBS (ya da RPMI) bir havaneli kullanarak PBS (veya RPMI) ile yıkayın ya da bir havanda döv.
- Dinç aspirasyon USI tekrar tek bir hücre süspansiyonu içine BM yapısını bozabilirng P1000 pipet. Alternatif olarak, aynı zamanda bir 21G şırınga iğnesi boyunca birkaç kez BM geçebilir. Santrifüj (400g, 5 dakika, RT), PBS içinde hücre yeniden askıya alma, ve çıplak ışınlanmış alıcıları içine intravenöz enjekte. Deneylerde tüm düzenleyici T hücreleri (Tregs) GFP 1 ifade Foxp3-KI GFP / GFP fareler BM kullandı.
- -BM-sulandırılmış olmayan hayvanların 14 günden fazla yaşayamaz beri donör BM Kabul, transferinden sonra ilk günlerinde ortaya çıkar. Ancak, bir bütün BM bölmeleri tam iyileşme sağlamak için 4 ila 6 hafta beklemeniz gerekir. Bactrim (Roche) bakteriyel enfeksiyonların riskini azaltmak için ışınlama sonrası ilk hafta içinde (2 mg / ml) su eklendi.
- Embriyonik timus nakli zaten 2 tarif edilmiştir. Kısaca, isogenic farelerin üreme çiftleri başlayın ve her gün takarak (birleşmede kanıt) kontrol edin. Ayrı takılı kadın ve CO pregn gün 15 2-euthanizeANCY (fiş gözlem gebeliğin 1. gün). Embriyoların ve thymuses çıkarın. Transferi kadar soğuk PBS içinde embriyonik thymuses yerleştirin.
- Thymuses nakli, ketamin (120 mg / g fare ağırlık) / ksilizin (fare ağırlığı 16 mg / g) ile anestezi BM-alıcı Çıplak fareler gerçekleştirmek ve aldıkları 37 ° C kadar bir ısıtma yastığı üstünde tutmak için bilinçsiz.
- Cerrahi thymuses nakli gerçekleştirmek için böbrek maruz kalmaktadır. İlk ChloraPrep (Carefusion A.Ş.) ve% 70 etanol ile cilt fırçalayın. Daha sonra, hayvanın arka-lateral vücut parçası, 2 mm körüklü son torasik kaburga cilt üzerinde kesilmiş bir 1 cm.
- Periton boşluğuna kesin ve bu boşlukta böbrek çekin. Bir neşter bıçağı ile böbrek kapsülü küçük bir yüzeysel kesik olun. Çok ince bir ucu ile forseps kullanma alıcı fare böbrek kapsülü altında bir kese yapmak ve bu kese içine 4 timus lobları ekleyebilirsiniz.
- Böbrek b koyun yerine ack, bir ya da iki dikiş ile periton boşluğuna dikiş, ve daha sonra aynı dikiş yöntemi kullanarak fare deri yakın. Alternatif olarak, dikişlerle cerrahi yapıştırıcı kullanılarak yapılabilir.
- Subkutan sağ hayvan ağrıyı önlemek ve bunlar anestezi kurtarmak için başlayana kadar bir ısıtma pedi hayvanlar tutmak için ameliyat bittikten sonra (5 mg / kg butorfanol) analjezik enjekte edilir. Fareler kafes arkadaşları dikiş kaldırmasını önlemek için transplantasyon sonrası ilk 3 gün için ayrı ayrı kafesli. 1 hafta sonra dikişler çıkarın.
- Çıplak fareler, T hücreleri yoktur. Bu nedenle, kandaki CD4 + veya CD8 + T hücrelerinin yüzde izleme timus greft kabul değerlendirebilir. Haftada bir kez, 2 hafta timus naklinden sonra, hayvanların kanama ve anti-CD4 ve CD8 anti-monoklonal antikor (mAb) ile kan lekesi. CD4: CD8 oranı yaklaşık 2:1 'dir, nakledilen timus tamamen işlevseldir (Şekil 1).
Önceden ihtiyaç ve onları bir kenara koyacağız tüm malzemeleri hazırlayın.
- 37 ketamin / xylazine (madde 1.5 açıklanan aynı dozlarda) ile hayvanların anestezisi ve bir ısıtma yastığı üstüne koyun ° C Kan akımının gelecekteki görselleştirme izin intravenöz rodamin B izotiyosiyanat-Dextran (PBS içinde 20 mg / ml) 100 ul enjekte edilir.
- Böbrek nakledilen timus içeren öğe 1.6, daha önce açıklanan protokole göre Açığa.
- Orijinal konumuna geri böbrek önlemek için dikiş ile cilt insizyonu lateral taraf kapatın.
- PBS batırılmış pamuk organın üstüne nemli tutmak için bir parça yerleştirin.
- Hayvan sahibinin aşama (Şekil 2A) üstüne ısıtma yastığı koyun.
- Hayvan, hayvan sahibi, organ kadar (Şekil 2B) ısıtma yastığı üstüne koyun.
- Her iki tarafta bir kelepçe m organ Pinchade ince alüminyum folyo (Şekil 2C).
- Hayvan sahibinin kapatın ve üst ısıtıcı prob doku (Şekil 2B) mümkün olduğunca yakın yerde. Bu ısıtıcı prob, sürekli bir organ sıcaklığı ölçer 37 ° C tutarak ısıtıcı, elektrik akımı ayarlamak için bu bilgileri gönderir
- PBS batırılmış pamuk çıkarın ve hazırlık üstünde 30 ° C düşük erime agaroz (PBS içinde% 2) ekleyin.
- Üst ısıtıcı (Şekil 2E) ile tüm hazırlık Kapak. Bu ısıtıcı diyafram objektif (Şekil 2F) agaroz izole bir coverglass vardır. Fare anestezi Monitör ve yarım doz artışı her 40 dakikada enjekte. Görüntü alımından sonra, CO 2 ile hayvan euthanize.
Not: alüminyum folyo klip ve üst ısıtıcı resimleri Şekil 3'te sunulmaktadır.
3. İki foton görüntüleme satın alma
Biz dik "Prairie Ultima XY" iki foton mikroskop kullanılır. Bizim sistemi ile donatılmış bir Ti: Safir lazer, aynı anda kadar 4 kanal satın almalar için en büyük dört Proje Yönetim Ekipleri ve 20x suya daldırma hedefi.
- Ti açın: Safir lazer ve tüm mikroskop sistemi.
- Dikroik aynalar ve filtre setleri istenilen dalga boyuna göre ekleyin. Bizim durumumuzda, 565 nm dikroik ayna içeren Olympus BX2 Chroma tutucu, bir 525/50 nm filtre (GFP Foxp3-sinyal için) ve 595/50 nm filtresi (Dextran-rodamin-B kan damarları içinde sinyali için kullanılan .) Kullanılan lazer dalga boyu aralığı 880-900 nm arasında idi.
- Hayvan sahibinin, mikroskop bağlamak ve suya, üst ısıtıcı diyafram üzerine su ekleyin, tüm ısıtıcıların amacı dikkatlice düşük çevirin, ve bir gemi ya da bazı GFP-Tregs odaklanmak.
- Mikroskop x, y, z dış kontrolü, hızlı bir bölge bulmak için doku anket çıkar.
- Proje Yönetim Ekipleri, renk ayrımı optimize ve arka plan üzerinde yeterli sinyal elde etmek için gerekli lazer miktarını en aza indirmek için kazanç ayarlayın. Doku fotoğraf zarar vermemek için lazer az miktarda kullanmaya çalışın.
- Çıkarlarını bölgede yer almaktadır sonra, time-lapse görüntüleme başlar. Bizim durumumuzda, tipik bir 5D (x, y, z, t ve renk) satın alma protokolü, 4.0 mikron z adımları, x ve y uzunluğu 140 mm ayrılır 50 mikron derinlik doku hacmi sıralı görüntüler elde oluşur her biri. Her cilt elde edilecek yaklaşık 30 saniye sürer. Bu nedenle, 60 satın almalar, yaklaşık 30 dakika görüntü alımı gerçekleştirecektir.
- Kurumsal sunucu, veri transferi ve çok boyutlu render ve hücre izleme gerçekleştirmek için ImageJ, Imaris, ya da Volocity yazılımı kullanmak.
4. Temsilcisi Sonuçlar
g1.jpg "/>
Şekil 1. Embriyonik timus kabul ve fonksiyon BM kurtardıktan sonra, embriyonik thymuses BM sulandırılmış hayvan nakledilen; timus nakli iki hafta sonra, bu farelerin anti-CD4 veya anti-CD8 T hücre alt tiplerinin yüzdeleri boyama ile izlemek için haftada bir kere kanadı Mablar. Biz timus CD4 hayvanlarda başarıyla kabul edilmiştir kabul 1.5-2.0:1 etrafında CD8 oranı (A). Işlevselliğini doğrulamak için, bazı timus nakledilen hayvanların kurban ve WT farelerin (B) ile farklı timosit alt popülasyonlarının yüzde karşılaştırıldığında. Alt popülasyonlar (anti-CD25 ve anti-CD44 Mablar ile boyama), çift-pozitif (DP; CD4 + CD8 + timositleri) (- CD8 timositleri CD4 DN) ve tek-pozitif (SP), CD4 çift-negatif yüzdeleri + veya CD8 + timositleri bu hayvanlar arasında benzer bulunmuştur.
ig2.jpg "/>
Şekil 2. Hayvan tutucu sonra derin anestezi, hayvan, bir ısıtma yastığı üstüne konur, daha önce hayvan sahibinin aşama (A) üst üste monte edilmiştir . Böbrek nakledilen timus içeren (B) yukarı bakacak. Bir alüminyum folyo kelepçe incelikle yerinde tutmak için tüm böbrek tutam (C). Şekil 1C insert kelepçe ayrıntılı olarak gösterir. Hayvan sahibinin üst kısmı yere (D) konur. PBS-batırılmış pamuk organın üst, sıcak düşük erime agaroz yerine kaldırılır ve üst ısıtıcı (E) eklenir. Son olarak, tüm montaj, mikroskop transfer hedefi (F) tarafından temsil edilen.
Şekil 3. Tutucu parça Detayları Bu resimler, alüminyum folyo kelepçe (A) (B) böbrek tutarak gösteriyor . Nakledilen timus bulunduğu bölgenin de unutmayın. Bu yaklaşık olarak bölgenin gösterirtimus kapsül kesmek ve embriyonik timus koymak için cepte yapmak. Üst ısıtıcı coverglass (C) alt kısmı (D) silikon yapıştırıcı ile tespit edildi.
Movie 1 Foxp3-GFP + timositleri fizyolojik oksijenlenme ve sıcaklık seviyeleri (37 ° C), tüm süreç boyunca tutuldu timus içinde intravital görüntüleme . Tregs kan akış ve hareket edin. Bu hızları ölçülen ve yayımlanmış verilere göre film görmek için buraya tıklayın.
Film 2 görüntüleri 30 satın alındı timus içinde Tregs intravital görüntüleme ° C Kan akımının bakım rağmen hareket ve yuvarlak şekil hücrelerin yokluğunda film görmek için buraya tıklayın.
Discussion
Bu yazıda, iki foton görüntüleme için yaşayan bir hayvan içinde timositleri işlemleri gösterdi. Biz aynı zamanda kan akımının devam etmesi ve görüntüleme işlemleri sırasında organ sıcaklık bakım gibi, dikkatle kontrol gereken bazı parametreler nitelendirdi. Bununla birlikte, organ sabit tutmak için dikkatli çabalarına rağmen, böyle bir "organı sürüklenen" olarak hareket eserler ortaya çıkabilir. Arka görüntü düzeltme, bu amaç için özel olarak tasarlanmış algoritmalar geliştirme yapılabilir. Daha fazla görüntü analizi de hataları en aza indirmek için çalışan yeni protokol geliştirme kaynağı olabilir.
Timus, T hücreleri, bu nedenle üretilen ve organ, Bağışıklık nesil γδ, anlamak isteyen bir organdır, CD4 veya CD8 T hücreleri, onların dikkatini durulacak. T hücreleri ile ilgili çalışmaların çoğu, bu c sayıda farklılıklar ve / veya istikrar dayanıyorin vitro / in vivo manipülasyonlar sonra arşın. Ancak, sadece in vivo görselleştirme sonra homeostazı 3-7 koruyarak bağışıklık sisteminin hücreleri arasındaki etkileşimi gözlemlemek olabilir. Bu nedenle, in vivo timositleri gözlem muhtemelen T hücre biyolojisi daha iyi anlamak için en önemli eksik bilgileri biridir. Intravital TPM T hücre hareketleri ve etkileşimleri detaylı bir resmini sunar ve biz burada detaylı timosit çalışmalar için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Ancak, her teknik sınırlamaları vardır. Intravital görüntüleme alımı hücreleri vücudun içine davranış yansıtarak için en doğru sistem iken, bu organların eksplante görüntü elde etme, daha az zahmetli ve 8,9 bağışıklık sistemi ile ilgili önemli bilgiler toplamak için kullanılır olmuştur olduğu da doğrudur. Ayrıca, bir vanlarda intravital görüntüleme yöntemleri doku ve kan damarları açığa çıkarmak için ameliyat gerektiren inkar edemeztek başına, tüm organ fizyolojisi 10 bir değişikliğe neden olabilir . Bununla birlikte, non-invaziv yöntemler geliştirilmekte olan cerrahi işlem 11 ve yeni yöntemler neden eserler kaldırılması vardır ki 12 kullanılan hayvanların daha iyi önceden hazırlanmak . Bu nedenle, yeni bir cerrahi prosedür ve geçiş ücretlerine en aza indirmek ya da bypass intravital görüntüleme satın alma gerçek sınırlamalar ve daha fazla bilimsel topluluk tarafından erişilebilir.
Açıklanan yöntem uygundur ve biz kullanmış olduğunuz tüm raporları, in vivo sistemik manipülasyonlar, bu tür ilaç idaresi olduğunu göstermiştir. Böylece, timositleri gelişimi ile ilgili ileri çalışmalar tamamlayacak ve güçlendirmek amacıyla zaten mevcut ex vivo teknikleri ile birlikte bu yöntemin kullanılmasını öneririz .
Disclosures
Biz ifşa etmek başka bir şey var.
Acknowledgments
Biz bu yazının eleştiri, Dr. Nuno Moreno Dr David Olivieri Foxp3-KI GFP / GFP tür bağış için hayvan sahibi ve ısıtma pedleri ve Dr Emre K. Kuchroo oluşturmak için lojistik yardım için teşekkür etmek istiyorum fareler. Bu çalışma, "Fundação para Ciencia e Tecnologia" (FCT, Portekiz), hibe # PTDC/EBB-BIO/115514/2009 tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhodamine B ishothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | prepare stock at 20 mg/ml | |
| Two-photon microscope | Prairie Technologies Inc. | Prairie Ultima X-Y | ||
| Ti:Sapphire laser | Coherent, Inc. | Chameleon Ultra Family | ||
| 20x/1.00 NA immersion objective | Olympus Inc. | XLUMPLFLN 20XW | ||
| Holder (Filters/Dichroic) | Chroma Technology Corp. | 91018 BX2 (U-MF2) | ||
| 525 nm/50 filter | Chroma Technology Corp. | ET525/50m | ||
| 595 nm/50 filter | Chroma Technology Corp. | ET595/50m | ||
| 565 nm dichroic | Chroma Technology Corp. | 565dcxr | ||
| Imaris software | Bitplane AG Inc. | Imaris | ||
| Volocity | PerkinElmer Inc. | Volocity | ||
| ImageJ | NIH, USA | ImageJ |
References
- Bettelli, E. Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells. Nature. 441, 235-238 (2006).
- Ramsdell, F., Zúñiga-Pflücker, J. C., Takahama, Y. In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture. Current protocols in immunology. Coligan, J. E. , (2006).
- Tadokoro, C. E. Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo. J. Exp. Med. 203, 505-511 (2006).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Miller, M. J. Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes. J. Exp. Med. 200, 847-856 (2004).
- Shakhar, G. Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo. Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).
- Hugues, S. Distinct T cell dynamics in lymph nodes during the induction of tolerance and immunity. 5, 1235-1242 (2004).
- Tang, Q. Visualizing regulatory T cell control of autoimmune responses in nonobese diabetic mice. Nat. Immunol. 7, 83-92 (2006).
- Le Borgne, M. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nature immunology. 10, 823-830 (2009).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvascular research. 5, 384-394 (1973).
- Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo. J. Vis. Exp. (46), e2062-e2062 (2010).
- Barretto, R. P. J. Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy. Nature medicine. 17, 223-228 (2011).
