Summary
Hemos desarrollado nuevas herramientas de laboratorio y protocolos para la adquisición de imágenes intravital del timo. Nuestra técnica debería ayudar en la identificación de "nichos" en el timo en el desarrollo de células T se produce.
Abstract
De dos fotones de Microscopía (TPM) proporciona la adquisición de imágenes en las zonas más profundo de los tejidos y órganos. En combinación con el desarrollo de herramientas nuevas estereotáctica y procedimientos quirúrgicos, el TPM se convierte en una poderosa técnica para identificar "nichos" dentro de los órganos y documentar celular "comportamientos" de animales vivos. Mientras imagen intravital proporciona información que mejor describa el comportamiento real de celulares dentro del órgano, que es tanto más laborioso y técnicamente exigente en términos de equipo necesario / procedimientos alternativos de adquisición ex vivo de imágenes. Por lo tanto, se describe un procedimiento quirúrgico y la novela "estereotácticos" titular del órgano que nos permite seguir los movimientos de Foxp3 + células en el timo.
Foxp3 es el regulador maestro para la generación de células T reguladoras (Tregs). Además, estas células se pueden clasificar según su origen: es decir. timo diferenciados Tregs se les llama "de origen natural Tregs" (nTregs), o comopposed a la periferia convertida Tregs (pTregs). A pesar de gran cantidad de investigación ha sido reportado en la literatura sobre el fenotipo y la fisiología de las células T, se conoce muy poco acerca de sus interacciones in vivo con otras células. Esta deficiencia puede ser debido a la ausencia de técnicas que permitan tales observaciones. El protocolo se describe en este documento se ofrece un remedio para esta situación.
Nuestro protocolo consiste en el uso de ratones nude que carecen de un timo endógeno, ya que tienen una mutación puntual en la secuencia de ADN que compromete la diferenciación de algunas células epiteliales, como células epiteliales del timo. Ratones desnudos fueron irradiados con rayos gamma y se reconstituyó con médulas ósea (MO) de KI Foxp3-GFP / GFP ratones. Después de la recuperación BM (6 semanas), cada animal recibió el trasplante de timo embrionario dentro de la cápsula renal. Después de la aceptación del timo (6 semanas), los animales fueron anestesiados, el riñón que contiene eltimo trasplantado fue expuesto, fijo en nuestro titular del órgano, y se mantiene bajo condiciones fisiológicas de imágenes in vivo de TPM. Hemos estado utilizando este método para estudiar la influencia de drogas en la generación de células T reguladoras.
Protocol
1. Animal preparación
Notas importantes: BM suspensiones celulares y trasplantes de timo se han realizado en condiciones asépticas. Las suspensiones se prepararon BM dentro de las campanas de la sala de cultivo celular, mientras que el trasplante de timo se llevó a cabo en la sala de operaciones ubicado dentro de nuestras instalaciones para animales. A fin de mantener y garantizar estas condiciones asépticas, no se nos permitió grabar nuestro video en esos lugares. Sin embargo, todo el material quirúrgico se autoclave y el banco quirúrgica fue limpiada previamente con Virkon (Pharmacal Research Laboratories, Inc.) y el 70% de etanol. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional y el empleo Comisión (IACUC) y que estaban de acuerdo con la Federación Europea de Asociaciones de Ciencia Animal de Laboratorio (FELASA) directivas. El número de identificación de aprobación es AO10/2010. Todos los experimentos de imagen fueron los procedimientos terminales y los animales fueron sacrificados inmediatamente después del final de la imagenadquisición.
El procedimiento detallado es el siguiente:
- Irradiar (con γ-irradiador) 8 semanas de edad ratones atímicos con 900 rads para destruir los precursores hematopoyéticos endógena dentro del hueso calabacines (BM). Después de la irradiación, el retorno de los animales a sus jaulas hasta que preparar las células del donante BM para inyección intravenosa y la reconstitución BM más. Esta transferencia se realizó BM 1 h después de la irradiación.
- Separar los animales donantes BM. Tibias y fémures de las patas traseras de un animal son generalmente suficientes para reconstituir hasta 3 animales receptores. Después de la eutanasia con CO 2, quite las patas traseras y luego retire la piel y los músculos de los huesos.
- Corte el extremo cerrado de cada hueso y enjuague con PBS (o RPMI) o aplastar a todos en un mortero, usando una mano de mortero, con 2 ml de PBS (o RPMI) para eliminar el BM.
- Alterar la estructura BM en una suspensión de una sola célula por la repetición de la aspiración vigorosa using una pipeta P1000. Si lo prefiere, también puede pasar el BM a través de una aguja de la jeringa 21G en varias ocasiones. Se centrifuga (400 g, 5 min, RT), volver a suspender las células en PBS, y se inyecta por vía intravenosa en el nude-irradiados destinatarios. En nuestros experimentos hemos utilizado BM de Foxp3-KI GFP / GFP ratones en todas las células T reguladoras (Tregs) se expresan GFP 1.
- La aceptación de la BM de los donantes se produce en los primeros días después de la transferencia, ya que no-BM-reconstituido animales no pueden sobrevivir más de 14 días. Sin embargo, se debe esperar de 4 a 6 semanas para permitir la recuperación plena de todos los compartimentos BM. Bactrim (Roche) fue introducido en el agua (2 mg / ml) durante la primera semana después de la irradiación para disminuir el riesgo de infecciones bacterianas.
- Timo embrionario trasplante ya ha sido descrito 2. En pocas palabras, empezar a criar pares de ratones isogénicas y comprobar para conectar (pruebas del coito) todos los días. Mujeres por separado y conectado a CO 2-eutanasia en el día 15 de pregnAncy (observación de enchufe es el día 1 de embarazo). La toma de embriones y timos de la. Coloque los timos de embriones en PBS frío hasta que la transferencia.
- Para llevar a cabo el trasplante de timo, anestesiar BM-receptor ratones desnudos con ketamina (120 mg / g de peso del ratón) / xilazina (16 mg / g de peso del ratón) y mantenerlos en la cima de una almohadilla térmica a 37 ° C hasta que se inconsciente.
- Exponer quirúrgicamente el riñón para realizar el trasplante de los timos. Primero frote la piel con ChloraPrep (CareFusion Inc.) y el 70% de etanol. Entonces, hacer un corte de 1 cm en la piel de la parte del cuerpo posterior-lateral del animal, de 2 mm por debajo de la costilla torácica anterior.
- Cortar la cavidad peritoneal y sacar el riñón de esta cavidad. Hacer un pequeño corte superficial en la cápsula renal con una hoja de bisturí. El uso de pinzas con una punta muy fina que una bolsa debajo de la cápsula del riñón del ratón receptor y añadir hasta 4 lóbulos del timo en esta bolsa.
- Coloque la b riñón acuse de recibo a su lugar, la sutura de la cavidad peritoneal con uno o dos puntos de sutura y cierre de la piel del ratón usando el método de sutura mismo. Por otra parte, las suturas se puede hacer usando pegamento quirúrgico.
- Inyectar analgésico (butorfanol a 5 mg / kg) por vía subcutánea justo después de terminar la cirugía para evitar el dolor de los animales y mantener a los animales en un cojín de la calefacción hasta que empiezan a recuperarse de la anestesia. Los ratones son alojados en jaulas individuales para los 3 primeros días después del trasplante para evitar que sus compañeros de jaula de la eliminación de los puntos de sutura. Quitar puntos de sutura después de 1 semana.
- Ratones desnudos no tienen células T. Por lo tanto, se puede evaluar la aceptación del trasplante de timo mediante el control del porcentaje de células CD4 + o linfocitos T CD8 + en la sangre. Una vez por semana, 2 semanas después de trasplante de timo, sangrar a los animales y la mancha de sangre con anticuerpos anti-CD4 y CD8 anti-anticuerpos monoclonales (MAb). Cuando los CD4: CD8 es de aproximadamente 2:1, el timo trasplantado es totalmente funcional (Figura 1).
Prepare todos los materiales que se necesitan por adelantado y puso a un lado.
- Anestesiar a los animales con ketamina / xilazina (mismas dosis descritos en el punto 1.5) y colocarlos en la parte superior de un cojín de la calefacción a 37 º C. Inyectar 100 l de rodamina B isotiocianato de dextrano (20 mg / ml en PBS) por vía intravenosa para permitir la visualización de futuro, el flujo de sangre.
- Exponer el riñón que contiene el timo trasplantados de acuerdo con el protocolo previamente descrito en el punto 1.6.
- Para evitar que los riñones vuelvan a su posición original, cerca de las caras laterales de la incisión de la piel con puntos de sutura.
- Coloque un trozo de algodón empapado de PBS en la parte superior del órgano para mantenerlo húmedo.
- Ponga la almohadilla en la parte superior de la etapa de titular de animales (Figura 2).
- El sacrificio del animal en la parte superior de la almohadilla en el soporte de los animales, por órgano (Figura 2B).
- Pellizcar el órgano en ambos lados con una abrazadera de mADE de papel de aluminio delgado (Fig. 2C).
- Cierre el soporte de los animales y el lugar de la sonda de calor superior lo más cerca posible a los tejidos (Figura 2). Esta sonda de calor mide constantemente la temperatura de órganos y envía esta información al calentador para ajustar la corriente eléctrica, manteniéndolo a 37 ° C.
- Retire el algodón empapado en PBS y añadir bajo punto de fusión de agarosa (2% en PBS) a 30 ° C en la parte superior de su preparación.
- Cubrir toda la preparación con el calentador superior (Figura 2E). En la apertura de este calentador hay un cubreobjetos aislar la agarosa del objetivo (Figura 2F). Monitor de la anestesia del ratón e inyectar un impulso a mitad de dosis cada 40 minutos. Después de la adquisición de la imagen, la eutanasia de los animales con CO 2.
Nota: las imágenes del clip de papel de aluminio y el calentador superior se presentan en la Figura 3.
3. De dos fotones de imagen de adquisición
Se utilizó un pie "Prairie Ultima XY" microscopio de dos fotones. Nuestro sistema está equipado con un Ti: Sapphire láser, cuatro PMT parte superior de traducción simultánea de hasta 4 canales de adquisiciones y un objetivo de inmersión en agua 20x.
- Encienda el Ti: Zafiro con láser y el sistema de microscopio conjunto.
- Añadir espejos dicroicos y juegos de filtros de acuerdo a las longitudes de onda deseada. En nuestro caso hemos utilizado un titular de Chroma-Olympus BX2 que contiene un espejo de 565 nm dicroicos, un 525/50 nm filtro (para la señal de Foxp3-GFP), y un 595/50 nm filtro (por Dextran-Rodamina-B de la señal dentro de los vasos sanguíneos ). El rango de longitud de onda de láser utilizado fue entre 880 a 900 nm.
- Añadir el titular de los animales al microscopio, conectar y encender todas las estufas, se añade agua en el calentador de la apertura superior, baje cuidadosamente el objetivo en el agua, y se centran en un buque o algún Tregs GFP.
- Con el microscopio de x, y, z de control externo, de forma rápida encuesta el tejido para localizar una región de interés.
- Ajustar la ganancia de la PMT para optimizar la separación de colores y minimizar la cantidad de láser necesarios para lograr suficiente señal más de fondo. Trate de usar la mínima cantidad de láser para evitar la foto-daño de los tejidos.
- Una vez que la región de interés se encuentra, hora de inicio de imágenes a intervalos. En nuestro caso, un típico 5D (x, y, z, t, y el color) protocolo de adquisición consiste en la adquisición de imágenes secuenciales de un volumen de 50 micras de tejido profundo, divididos en 4,0 m z-pasos, x y la longitud y de 140 micras cada uno. Cada volumen es de unos 30 segundos para ser adquiridos. Por lo tanto, 60 adquisiciones se realizan alrededor de 30 minutos de la adquisición de imágenes.
- Transferir los datos al servidor institucional y el uso de ImageJ, Imaris o software Volocity para llevar a cabo la representación multi-dimensional y el seguimiento de la célula.
4. Resultados representante
g1.jpg "/>
Figura 1. . Embrionarias aceptación del timo y la función BM Después de recuperarse, timos embrionarias fueron trasplantadas a animales BM reconstituido, dos semanas después del trasplante de timo, estos ratones fueron sangrados una vez por semana para supervisar los porcentajes de los subtipos de células T mediante la tinción con anti-CD4 o anti-CD8 los anticuerpos monoclonales. Se consideró que el timo fue aceptado con éxito en animales con CD4: CD8 alrededor 1.5-2.0:1 (A). Para confirmar su funcionalidad, que sacrificó algunos animales timo-trasplante y en comparación el porcentaje de las diferentes subpoblaciones de timocitos de ratones WT (B). Los porcentajes de doble negación (DN; CD4 - CD8 - timocitos) subpoblaciones (por tinción con anti-CD25 y anticuerpos monoclonales anti-CD44), haga doble positivo (DP; CD4 + CD8 + timocitos) y de un solo positivo (SP) CD4 + o CD8 + timocitos fueron similares entre estos animales.
ig2.jpg "/>
Figura 2. Conjunto de animales titular. Después profundamente anestesiados, el animal se pone encima de una almohadilla eléctrica, previamente montada en la parte superior de la etapa de titular de animales (A). El riñón trasplantado que contiene el timo es hacia arriba (B). Una pinza de papel de aluminio con delicadeza aprieta todo el riñón (C) para mantener en su lugar. Fig. 1C insertar muestra en detalle la abrazadera. La parte superior del soporte de los animales se pone en el lugar (D). El algodón empapado en PBS se retira de la parte superior del órgano, sustituido por el cálido bajo punto de fusión de agarosa, y el calentador superior se añade (E). Finalmente, toda la asamblea se transfiere al microscopio, en este caso representado por el objetivo (F).
Figura 3. Detalles de las piezas soporte. Estas imágenes muestran la abrazadera de papel de aluminio (A) la celebración de los riñones (B). Tenga en cuenta también la región donde se encuentra el timo trasplantado. Esto indica aproximadamente la regiónpara cortar la cápsula del timo y hacer que el bolsillo para poner el timo embrionario. El cubre calentador superior (C) se fija con pegamento de silicona en su parte inferior (D).
Movie 1. Intravital imagen de GFP-Foxp3 + timocitos en el interior del timo, donde los niveles fisiológicos de la oxigenación y la temperatura (37 ° C) se mantuvieron durante todo el proceso. Tenga en cuenta el flujo de sangre y el movimiento de células T reguladoras. Estas velocidades pueden ser medidos y comparados con los datos publicados. Haga clic aquí para ver la película.
Movie 2. Intravital de imágenes de células T reguladoras dentro de un timo, donde las imágenes fueron adquiridas a 30 ° C. Nótese la ausencia de movimiento y de la forma redonda de las células a pesar del mantenimiento del flujo sanguíneo. Haga clic aquí para ver la película.
Discussion
En este trabajo hemos demostrado los procedimientos de dos fotones de imágenes de los timocitos en el interior de un animal vivo. También se describen algunos de los parámetros que uno debe cuidadosamente controlar, como la continuación del flujo sanguíneo y el mantenimiento de la temperatura de órganos durante los procedimientos de imagen. Sin embargo, a pesar de los esfuerzos de cuidado de mantener el órgano estable, los artefactos de movimiento, como "órgano a la deriva" pueden ocurrir. Corrección de la imagen posterior se puede realizar por el desarrollo de algoritmos especialmente diseñados para este propósito. Análisis de las imágenes más también podrían ser el origen del desarrollo de nuevos protocolos que trata de minimizar los errores.
El timo es el órgano donde todas las células T son producidas y, por tanto, es el órgano donde inmunólogos interesados en comprender la generación de γδ, CD4, CD8 o células T se centrará su atención. La mayoría de los estudios sobre las células T se basan en las diferencias en los números y / o la estabilidad de los canas después de diferentes in vitro / in vivo manipulaciones. Sin embargo, sólo después de la visualización en vivo se pudo observar la interacción entre las células del sistema inmune involucradas en el mantenimiento de la homeostasis de 3-7. Por lo tanto, la observación en vivo de los timocitos es probablemente uno de la información más importante que falta para entender mejor la biología de las células T. Intravital TPM proporciona una imagen detallada de los movimientos de las células T y las interacciones y demostramos aquí cómo puede ser utilizado para estudios detallados de los timocitos. Sin embargo, cada técnica tiene sus limitaciones. Mientras intravital adquisición de imágenes es el sistema más preciso para reflejar el comportamiento de las células dentro del cuerpo, también es cierto que la adquisición explantados imagen de los órganos es menos laborioso y ha sido utilizado para recopilar información importante sobre el sistema inmunológico 8,9. Por otra parte, no se puede negar métodos intravital de imágenes requieren cirugía para exponer los tejidos y los vasos sanguíneos en los animales anestesiados,que de por sí puede causar una alteración en la totalidad del órgano fisiología 10. Sin embargo, existen métodos no invasiva que la abolición de los artefactos causados por la intervención quirúrgica 11 y los nuevos métodos están siendo desarrollados para mejor prepararse con anticipación a los animales que se utilizarán 12. Por lo tanto, los nuevos procedimientos quirúrgicos y los peajes reducirá al mínimo o evitar las limitaciones reales de adquisición de imágenes intravital y cada vez más accesibles a la comunidad científica.
Hemos demostrado que el método que hemos descrito es factible y que los informes de todas las manipulaciones in vivo sistémico, la administración de estos fármacos, que hemos utilizado. Por lo tanto, se sugiere el uso de este método, junto con técnicas ex vivo ya están disponibles con el fin de complementar y fortalecer aún más los estudios sobre el desarrollo de los timocitos.
Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer al Dr. David Olivieri para la revisión crítica de este manuscrito, el Dr. Nuno Moreno por la ayuda logística para construir nuestro titular de los animales y las almohadillas térmicas y el Dr. Vijay K. Kuchroo para la donación tipo de Foxp3-KI GFP / GFP ratones. Este trabajo es apoyado por la "Fundação párrafo Ciência e Tecnologia" (FCT, Portugal), subvención # PTDC/EBB-BIO/115514/2009.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhodamine B ishothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | prepare stock at 20 mg/ml | |
| Two-photon microscope | Prairie Technologies Inc. | Prairie Ultima X-Y | ||
| Ti:Sapphire laser | Coherent, Inc. | Chameleon Ultra Family | ||
| 20x/1.00 NA immersion objective | Olympus Inc. | XLUMPLFLN 20XW | ||
| Holder (Filters/Dichroic) | Chroma Technology Corp. | 91018 BX2 (U-MF2) | ||
| 525 nm/50 filter | Chroma Technology Corp. | ET525/50m | ||
| 595 nm/50 filter | Chroma Technology Corp. | ET595/50m | ||
| 565 nm dichroic | Chroma Technology Corp. | 565dcxr | ||
| Imaris software | Bitplane AG Inc. | Imaris | ||
| Volocity | PerkinElmer Inc. | Volocity | ||
| ImageJ | NIH, USA | ImageJ |
References
- Bettelli, E. Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells. Nature. 441, 235-238 (2006).
- Ramsdell, F., Zúñiga-Pflücker, J. C., Takahama, Y. In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture. Current protocols in immunology. Coligan, J. E. , (2006).
- Tadokoro, C. E. Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo. J. Exp. Med. 203, 505-511 (2006).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Miller, M. J. Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes. J. Exp. Med. 200, 847-856 (2004).
- Shakhar, G. Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo. Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).
- Hugues, S. Distinct T cell dynamics in lymph nodes during the induction of tolerance and immunity. 5, 1235-1242 (2004).
- Tang, Q. Visualizing regulatory T cell control of autoimmune responses in nonobese diabetic mice. Nat. Immunol. 7, 83-92 (2006).
- Le Borgne, M. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nature immunology. 10, 823-830 (2009).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvascular research. 5, 384-394 (1973).
- Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo. J. Vis. Exp. (46), e2062-e2062 (2010).
- Barretto, R. P. J. Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy. Nature medicine. 17, 223-228 (2011).
