Summary
Nous avons développé des outils de laboratoire roman et de protocoles pour l'acquisition d'imagerie intravitale du thymus. Notre technique devrait aider à l'identification de «niches» dans le thymus où le développement des cellules T se produit.
Abstract
Microscopie à deux photons (TPM) offre d'acquisition d'image dans les zones profondément à l'intérieur des tissus et des organes. En combinaison avec le développement d'outils et de nouvelles procédures stéréotaxique chirurgicale, TPM devient une technique performante pour identifier des «niches» à l'intérieur des organes et de documenter cellulaire "comportements" des animaux vivants. Alors que l'imagerie intravitale fournit des informations qui ressemble le mieux le comportement réel cellulaire à l'intérieur de l'orgue, il est à la fois plus laborieux et techniquement exigeants en termes d'équipement requis / procédures d'acquisition de l'ex alternatives imagerie in vivo. Ainsi, nous décrivons une nouvelle procédure chirurgicale et titulaire »stéréotaxique" organe qui nous permet de suivre les mouvements des cellules Foxp3 + dans le thymus.
Foxp3 est le régulateur maître pour la génération de cellules T régulatrices (Treg). Par ailleurs, ces cellules peuvent être classés selon leur origine: c'est à dire. thymus différenciés Tregs sont appelés «naturels Tregs" (nTregs), que l'opposed au périphérique convertis Tregs (pTregs). Bien que beaucoup de recherches ont été rapportés dans la littérature concernant le phénotype et la physiologie de ces cellules T, on sait très peu sur leurs interactions in vivo avec d'autres cellules. Cette carence peut être due à l'absence de techniques qui permettraient de telles observations. Le protocole décrit dans ce document fournit un remède à cette situation.
Notre protocole consiste à utiliser des souris nude qui n'ont pas d'thymus endogènes car ils ont une mutation ponctuelle dans la séquence d'ADN qui compromet la différenciation de certaines cellules épithéliales, y compris les cellules épithéliales thymiques. Souris Nude ont été irradiés par rayons gamma et reconstituées avec des courges osseuse (MO) de Foxp3-KI GFP / GFP souris. Après la récupération BM (6 semaines), chaque animal a reçu la transplantation embryonnaire du thymus à l'intérieur de la capsule rénale. Après l'acceptation du thymus (6 semaines), les animaux ont été anesthésiés; le rein contenant lesthymus transplanté a été exposé, fixée dans notre porte-orgue, et maintenu dans des conditions physiologiques pour l'imagerie in vivo par TPM. Nous avons utilisé cette approche pour étudier l'influence de drogues dans la génération de cellules T régulatrices.
Protocol
1. La préparation des animaux
Notes importantes: suspensions cellulaires BM et les transplantations du thymus ont été réalisées dans des conditions aseptiques. Les suspensions ont été préparées BM à l'intérieur du hottes de notre salle de culture cellulaire, tandis que la transplantation thymique a été réalisée dans la salle de chirurgie situés dans notre animalerie. Afin de maintenir et de garantir ces conditions aseptiques, nous n'étions pas autorisés à enregistrer notre vidéo dans ces endroits. Cependant, tous les matériaux chirurgicaux ont été autoclavés et le banc chirurgicale a été préalablement nettoyé avec Virkon (Pharmacal Research Laboratories Inc) et 70% d'éthanol. Toutes les procédures ont été approuvées par les soins des animaux et utilisation institutionnelle Comité (IACUC) et ils étaient en accord avec la Fédération européenne des associations de science de laboratoire animale (FELASA) des directives. Le numéro d'identification d'approbation est AO10/2010. Toutes les expériences ont été l'image des procédures terminales et les animaux ont été euthanasiés immédiatement après la fin de l'imaged'acquisition.
La procédure détaillée est la suivante:
- Irradier (avec un irradiateur γ-) 8 semaines vieilles souris Nude avec 900 rads pour détruire les précurseurs hématopoïétiques endogènes intérieur de l'os courges (BM). Après irradiation, le retour des animaux dans leur cage jusqu'à ce que vous préparent les cellules du donneur BM pour injection intraveineuse et la reconstitution d'autres BM. Ce transfert a été effectué BM 1 h après l'irradiation.
- Séparer les animaux donneurs BM. Les tibias et les fémurs des pattes postérieures d'un animal sont généralement suffisantes pour reconstituer jusqu'à 3 animaux receveurs. Après l'euthanasie avec le CO 2, retirez les pattes arrière, puis retirez la peau et le muscle de l'os.
- Couper l'extrémité fermée de chaque os et le rincer avec du PBS (ou RPMI) ou les écraser tous les dans un mortier, avec un pilon, avec 2 ml de PBS (ou RPMI) pour supprimer le BM.
- Perturber la structure BM en une suspension mono-cellulaires par des répétitions de l'aspiration vigoureuse USIng d'une pipette P1000. Alternativement, vous pouvez également passer le BM à travers une aiguille de seringue 21G plusieurs fois. Centrifuger (400 g, 5 min, RT), rétablir la suspension des cellules dans du PBS, et à injecter par voie intraveineuse dans votre nu-irradiés destinataires. Dans nos expériences, nous avons utilisé BM à partir Foxp3-GFP KI / souris GFP où toutes les cellules T régulatrices (Treg) va exprimer la GFP 1.
- L'acceptation de la BM donateurs se produit dans les premiers jours après le transfert, puisque les non-BM-reconstitué animaux ne peuvent pas survivre plus de 14 jours. Cependant, il faut attendre 4 à 6 semaines pour permettre la récupération complète de tous les compartiments BM. Bactrim (Roche) a été ajouté à l'eau (2 mg / ml) pendant la première semaine après l'irradiation pour diminuer le risque d'infections bactériennes.
- Embryonnaire du thymus de transplantation a déjà été décrit 2. En bref, commencer couples reproducteurs de souris isogéniques et vérifiez le branchement (preuves du coït) chaque jour. Séparés des femelles branchés et CO 2-les euthanasier le jour 15 de pregnAncy (observation de la fiche est le jour 1 de la grossesse). Retirez les embryons et le thymus. Placez le thymus embryonnaire dans PBS froid jusqu'au transfert.
- Pour effectuer la transplantation thymus, anesthésier BM-receveur souris Nude avec la kétamine (120 mg / g de poids de la souris) / xylazine (16 mg / g de poids de la souris) et de les garder sur le dessus d'un coussin chauffant à 37 ° C jusqu'à ce qu'ils obtiennent inconscient.
- Chirurgicalement exposer le rein pour effectuer la greffe de thymus de l'. D'abord frotter la peau avec ChloraPrep (CareFusion Inc) et 70% d'éthanol. Ensuite, faire un 1 cm coupure sur la peau de la partie du corps en arrière-latéral de l'animal, de 2 mm dessous de la dernière côte thoracique.
- Couper la cavité péritonéale et sortir le rein de cette cavité. Faire une petite entaille superficielle dans la capsule du rein avec une lame de bistouri. En utilisant une pince avec une pointe très fine faire une pochette sous la capsule rénale de souris destinataire et ajoutez jusqu'à 4 lobes thymiques dans cette pochette.
- Mettez le b du rein ack à sa place, la suture de la cavité péritonéale avec un ou deux points de suture, puis fermez la peau de souris en utilisant la méthode de suture même. Alternativement, les sutures peuvent être fait en utilisant de la colle chirurgicale.
- Injecter analgésique (butorphanol à 5 mg / kg) par voie sous cutanée dès la fin de la chirurgie pour éviter la douleur animale et de garder les animaux dans un coussin chauffant jusqu'à ce qu'ils commencent à se remettre de l'anesthésie. Les souris sont en cage individuelle pour les 3 premiers jours après la transplantation pour éviter compagnons de cage d'enlever les points de suture. Enlever points de suture après 1 semaine.
- Souris Nude n'ont pas les cellules T. Par conséquent, vous pouvez évaluer l'acceptation du greffon par le thymus contrôle le pourcentage de CD4 + ou cellules T CD8 + dans le sang. Une fois par semaine, 2 semaines après la transplantation du thymus, qui saignent les animaux et les taches de sang avec l'anti-CD4 et anti-CD8 anticorps monoclonaux (AcM). Lorsque les CD4: CD8 ratio est d'environ 2h01, le thymus greffé est parfaitement fonctionnel (figure 1).
Préparer tous les matériaux dont vous aurez besoin à l'avance et les mettre de côté.
- Anesthetize animaux avec la kétamine / xylazine (mêmes doses décrite au point 1.5) et les placer sur le dessus d'un coussin chauffant à 37 ° C. Injecter 100 ml de rhodamine B isothiocyanate-dextran (20 mg / ml dans du PBS) par voie intraveineuse pour permettre la visualisation avenir de la circulation sanguine.
- Exposer le rein transplanté contenant du thymus selon le protocole précédemment décrit dans le point 1.6.
- Afin d'éviter le rein de revenir à sa position initiale, près des côtés latéraux de l'incision cutanée avec des points de suture.
- Placez un morceau de coton imbibé de PBS sur le dessus de l'orgue pour le garder humide.
- Mettez le coussin chauffant au-dessus de la scène détenteur des animaux (figure 2A).
- Mettez l'animal sur le dessus du coussin chauffant dans le support d'animaux, jusqu'à l'organe (figure 2B).
- Pincez l'orgue à deux faces avec une pince made de feuille mince d'aluminium (figure 2C).
- Fermez le porte-animal et placer la sonde radiateur dessus aussi près que possible de votre tissu (figure 2D). Cette sonde radiateur mesure en permanence la température de l'organe et envoie cette information à l'appareil de chauffage à ajuster le courant électrique, le garder à 37 ° C.
- Retirer le coton imbibé de PBS et ajouter bas point de fusion d'agarose (2% dans PBS) à 30 ° C sur le dessus de votre préparation.
- Couvrir toute la préparation avec le chauffe-dessus (figure 2E). Dans l'ouverture de ce chauffe il ya une lamelle d'isoler l'agarose de l'objectif (figure 2F). Surveiller l'anesthésie de la souris et d'injecter un coup de pouce demi-dose toutes les 40 minutes. Après l'acquisition de l'image, euthanasier l'animal avec du CO 2.
Remarque: les images du clip du papier d'aluminium et le chauffe-dessus sont présentés dans la figure 3.
3. Deux photons d'acquisition d'imagerie
Nous avons utilisé un modèle upright "Prairie Ultima XY" à deux photons microscope. Notre système est équipé d'un Ti: saphir au laser, quatre PMT supérieure pour une utilisation simultanée de 4 canaux d'acquisitions et d'un objectif 20x immersion dans l'eau.
- Allumez le Ti: saphir laser et le système de microscope entier.
- Ajouter des miroirs dichroïques et des jeux de filtres en fonction de la longueur d'onde désirée. Dans notre cas nous avons utilisé un porte-Olympus-BX2 Chroma contenant un miroir dichroïque 565 nm, un 525/50 nm (pour Foxp3-GFP du signal) du filtre, et un 595/50 nm filtre (dextran-rhodamine-B signal à l'intérieur des vaisseaux sanguins ). La gamme de longueur d'onde laser utilisé était entre 880 à 900 nm.
- Ajouter le détenteur des animaux au microscope, se connecter et allumer tous les appareils de chauffage, ajouter de l'eau sur le radiateur de l'ouverture supérieure, soigneusement inférieure à l'objectif dans l'eau, et se concentrer sur un navire ou une GFP-Tregs.
- Avec le microscope à x, y, z de contrôle externe, rapide enquête sur le tissu pour localiser une région d'intérêt.
- Réglez le gain sur la PMT pour optimiser la séparation des couleurs et minimiser la quantité de laser requise pour obtenir un signal suffisamment sur fond. Essayez d'utiliser la quantité minimale de laser pour éviter la photo-dommages de votre tissu.
- Une fois la région d'intérêt est située, commencent imagerie time-lapse. Dans notre cas, un type 5D (x, y, z, t, et la couleur) protocole d'acquisition consiste à acquérir des images séquentielles d'un volume de 50 um profondeur des tissus, divisé en 4,0 um z-étapes, x et y de longueur de 140 um chacun d'eux. Chaque volume est d'environ 30 secondes pour être acquis. Par conséquent, 60 acquisitions se produiront environ 30 min d'acquisition des images.
- Transférer les données vers le serveur institutionnel et l'utilisation ImageJ, Imaris, ou un logiciel pour effectuer Volocity multi-dimensionnelle de rendu et de suivi des cellules.
4. Les résultats représentatifs
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Figure 1. . Embryonnaire du thymus acceptation et la fonction Après BM récupérer, thymus embryonnaires ont été transplantés à BM animaux reconstitués; deux semaines après la transplantation de thymus, ces souris ont été saignées une fois par semaine pour surveiller les pourcentages de sous-types de lymphocytes T par coloration avec des anti-CD4 ou anti-CD8 MAbs. Nous avons considéré le thymus a été accepté chez les animaux avec un taux de CD4: CD8 Ratio autour 1.5-2.0:1 (A). Pour confirmer sa fonctionnalité, nous avons sacrifié quelques animaux thymus transplantés et comparé le pourcentage de différentes sous-populations thymocytes des souris WT (B). Les pourcentages de double négatif (DN; CD4 - CD8 - thymocytes) sous-populations (par coloration avec des anti-CD25 et anti-CD44 anticorps monoclonaux), double-positifs (DP; CD4 + CD8 + thymocytes) et simple positif (SP) CD4 + ou CD8 + thymocytes ont été similaires entre ces animaux.
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Figure 2. Ensemble porte-animaux. Après profondément anesthésiés, l'animal est mis sur le dessus d'un coussin chauffant, précédemment monté sur le dessus de la scène détenteur des animaux (A). Le rein transplanté contenant du thymus est vers le haut (B). Une pince aluminium pincées délicatement le rein entier (C) pour maintenir en place. Fig. 1C insert montre en détail la pince. La partie supérieure du porte-animal est mis en place (D). Le coton imbibé de PBS est retiré de la partie supérieure de l'organe, remplacé par chaleureuse bas point de fusion d'agarose, et le chauffe-dessus est ajouté (e). Enfin, l'ensemble est transféré à la loupe, représenté ici par l'objectif (F).
Figure 3. Détails des pièces de titulaire. Ces images montrent la pince feuille d'aluminium (A) la tenue du rein (B). Notez également la région où le thymus est situé transplantés. Cela indique approximativement la régionpour couper la capsule du thymus et de faire la poche pour mettre le thymus embryonnaire. La lamelle chauffe supérieure (C) a été fixée avec de la colle silicone pour sa partie inférieure (D).
Vidéo 1. Imagerie intravitale de Foxp3-GFP + thymocytes à l'intérieur du thymus où les niveaux physiologiques de l'oxygénation et la température (37 ° C) ont été maintenues durant tout le processus. Notez le flux sanguin et la circulation des Treg. Ces vitesses peuvent être mesurés et comparés avec les données publiées. Cliquez ici pour voir le film.
Movie 2. Intravitale imagerie des Treg dans un thymus où les images ont été acquises à 30 ° C. Notez l'absence de mouvement et la forme ronde des cellules malgré le maintien du flux sanguin. Cliquez ici pour voir le film.
Discussion
Dans ce papier, nous avons démontré les procédures d'imagerie à deux photons de thymocytes dans un animal vivant. Nous avons également décrit certains paramètres que l'on doit contrôler soigneusement, comme la continuation du flux sanguin et le maintien de la température de l'organe pendant les procédures d'imagerie. Néanmoins, malgré les efforts de soin de garder l'orgue stable, les artefacts de mouvement tels que «l'organe à la dérive» peut se produire. Correction d'image postérieure peut être effectuée par le développement d'algorithmes spécialement conçu à cet effet. L'analyse d'images supplémentaires pourraient également être la source du développement de nouveaux protocoles qui cherche à minimiser les erreurs.
Le thymus est l'organe où toutes les cellules T sont produites et, par conséquent, il est l'organe où immunologistes intéressés à comprendre la génération de γδ, lymphocytes CD4 ou lymphocytes T CD8 se concentreront leur attention. La plupart des études concernant les cellules T sont basées sur des différences dans le nombre et / ou la stabilité de ces caunes, après différents in vitro / in vivo des manipulations. Cependant, seulement après la visualisation in vivo nous avons pu observer l'interaction entre les cellules du système immunitaire impliquées dans le maintien de l'homéostasie 3-7. Par conséquent, l'observation in vivo des thymocytes est probablement l'une des informations les plus importantes manquent pour mieux comprendre la biologie des cellules T. Intravitale TPM fournit une image détaillée des mouvements des cellules T et les interactions, et nous démontrons ici comment il peut être utilisé pour des études détaillées thymocytes. Cependant, chaque technique a ses limites. Alors que l'acquisition d'imagerie intravitale est le système le plus précis pour refléter le comportement des cellules à l'intérieur du corps, il est vrai aussi que l'acquisition d'images explantées d'organes est moins laborieuse et a été utilisé pour recueillir des informations importantes sur le système immunitaire 8,9. Par ailleurs, on ne peut nier les méthodes d'imagerie intravitale nécessiter une intervention chirurgicale afin d'exposer les tissus et les vaisseaux sanguins chez les animaux anesthésiés,qui en soi pourrait entraîner une altération de l'organe entier la physiologie 10. Néanmoins, il existe des méthodes non-invasive qui abolissent les artefacts causés par l'intervention chirurgicale 11 et de nouvelles méthodes sont en cours de développement à mieux se préparer à l'avance les animaux devant être utilisés 12. Par conséquent, de nouvelles procédures chirurgicales et des péages sera de minimiser ou de contourner les limitations réelles de l'acquisition d'imagerie intravitale et deviennent de plus en plus accessible à la communauté scientifique.
Nous avons démontré que la méthode que nous avons décrit est faisable et ce tous les rapports des manipulations in vivo systémique, l'administration de médicaments tels, que nous avons utilisés. Ainsi, nous suggérons l'utilisation de cette méthode ainsi que des techniques ex vivo déjà disponibles afin de compléter et renforcer d'autres études concernant le développement des thymocytes.
Disclosures
Nous n'avons rien à révéler.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le Dr David Olivieri pour un examen critique de ce manuscrit, le Dr Nuno Moreno pour l'aide logistique pour construire notre porte-animal et les coussins chauffants et Dr. Vijay K. Kuchroo pour le don en nature de Foxp3-KI GFP / GFP souris. Ce travail est soutenu par «Fundação para Ciência Tecnologia e" (CFPI, Portugal), subvention no PTDC/EBB-BIO/115514/2009.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhodamine B ishothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | prepare stock at 20 mg/ml | |
| Two-photon microscope | Prairie Technologies Inc. | Prairie Ultima X-Y | ||
| Ti:Sapphire laser | Coherent, Inc. | Chameleon Ultra Family | ||
| 20x/1.00 NA immersion objective | Olympus Inc. | XLUMPLFLN 20XW | ||
| Holder (Filters/Dichroic) | Chroma Technology Corp. | 91018 BX2 (U-MF2) | ||
| 525 nm/50 filter | Chroma Technology Corp. | ET525/50m | ||
| 595 nm/50 filter | Chroma Technology Corp. | ET595/50m | ||
| 565 nm dichroic | Chroma Technology Corp. | 565dcxr | ||
| Imaris software | Bitplane AG Inc. | Imaris | ||
| Volocity | PerkinElmer Inc. | Volocity | ||
| ImageJ | NIH, USA | ImageJ |
References
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