Abstract
Zwei-Photonen-Mikroskopie (TPM) bietet Bildaufnahme in tiefe Bereiche innerhalb Geweben und Organen. In Kombination mit der Entwicklung neuer Werkzeuge und stereotaktische Eingriffe, wird TPM eine leistungsfähige Technik, die auf "Nischen" im Inneren Organe zu identifizieren und zellulären "Verhaltensweisen" in lebenden Tieren zu dokumentieren. Während intravital Bildgebung liefert Informationen, die am ehesten der realen zellulären Verhalten innerhalb des Organs, ist es sowohl aufwändiger und technisch anspruchsvoll im Hinblick auf erforderliche Ausrüstung / Verfahren als alternative ex-vivo-Bildgebung Akquisition. So beschreiben wir ein chirurgischer Eingriff und Roman "stereotaktische" Organ Halter, die uns an die Bewegungen des Foxp3 + Zellen innerhalb des Thymus verfolgen können.
Foxp3 ist der Master-Regler für die Generierung von regulatorischen T-Zellen (Tregs). Dh: Darüber hinaus können diese Zellen nach ihrer Herkunft klassifiziert werden. Thymus-differenzierten Tregs sind "natürlich vorkommenden Tregs" (nTregs) genannt, als opposed zu peripher umgewandelt Tregs (pTregs). Obwohl erhebliche Menge an Forschung hat in der Literatur über den Phänotyp und die Physiologie dieser T-Zellen berichtet wurde, ist sehr wenig über ihre in-vivo-Wechselwirkungen mit anderen Zellen bekannt. Dieser Mangel kann durch das Fehlen von Techniken, die solche Beobachtungen ermöglichen würde. Das Protokoll in diesem Dokument beschriebenen Abhilfe schafft eine für diese Situation.
Unser Protokoll besteht in der Verwendung Nacktmäusen, dass eine endogene Thymus fehlen, da sie eine pünktliche Mutation in der DNA-Sequenz, die die Differenzierung von einigen epithelialen Zellen, einschließlich Thymus Epithelzellen Kompromisse. Nacktmäuse wurden gamma-bestrahlt und rekonstituiert mit Knochen Zucchini (BM) aus Foxp3-KI gfp / GFP-Mäusen. Nach BM Erholung (6 Wochen), erhielt jedes Tier embryonalen Thymus-Transplantation in die Nierenkapsel. Nach Thymus Akzeptanz (6 Wochen) wurden die Tiere narkotisiert, der Niere, die dietransplantierten Thymus ausgesetzt war, fest in unsere Orgel Inhaber und hielt unter physiologischen Bedingungen in vivo Bildgebung von TPM. Wir haben mit diesem Ansatz auf dem Einfluss von Drogen in die Generierung von regulatorischen T-Zellen zu studieren.
Protocol
1. Tierische Vorbereitung
Wichtige Hinweise: BM Zellsuspensionen und Thymus-Transplantationen wurden unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Die BM-Suspensionen wurden in die Hauben unserer Zellkultur Zimmer vorbereitet, während die Thymus-Transplantation in den Operationssaal in unserer Tier-Einrichtung befindet, durchgeführt wurde. Um zu halten und Gewährleistung dieser aseptischen Bedingungen, durften wir nicht zu unserem Video in diesen Orten aufzunehmen. Allerdings wurden alle chirurgischen Materialien autoklaviert und der chirurgischen Bank war zuvor mit Virkon (Pharmacal Research Laboratories Inc.) und 70% Ethanol gereinigt. Alle Verfahren wurden von der Institutional Animal Care genehmigt und Verwenden Committee (IACUC) und sie wurden im Einvernehmen mit der Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA) Richtlinien. Die Zulassung ID-Nummer ist AO10/2010. Alle Bild-Experimente wurden Klemme Verfahren und die Tiere wurden unmittelbar nach dem Ende des Bildes eingeschläfertErwerb.
Die detaillierte Vorgehensweise ist wie folgt:
- Bestrahlen (mit einem γ-Strahler) 8 Wochen alte Nacktmäuse mit 900 rad auf die endogenen hämatopoetischen Vorläufer innerhalb des Knochens Zucchini (BM) zu zerstören. Nach der Bestrahlung Rückkehr der Tiere in ihre Käfige, bis Sie den Spender BM-Zellen für die intravenöse Injektion und weitere BM Rekonstitution vorzubereiten. Das BM übertragen wurde 1 h nach der Bestrahlung durchgeführt.
- Trennen Sie die BM Spendertiere. Schienbeine und Oberschenkel der Hinterbeine von einem Tier sind in der Regel genug zu rekonstruieren bis zu 3 Empfänger Tiere. Nach Euthanasie mit CO 2, entfernen Sie den hinteren Gliedmaßen und entfernen Sie dann die Haut und Muskeln von den Knochen.
- Cut am geschlossenen Ende eines jeden Knochen und spülen Sie es mit PBS (oder RPMI) oder quetschen sie alle in einem Mörser mit einem Stößel, mit 2 ml PBS (oder RPMI), um den BM zu entfernen.
- Stören des BM-Struktur in ein Single-Cell-Suspension durch Wiederholungen der kräftige Aspiration using einer P1000 Pipette. Alternativ können Sie auch den BM während einer 21G Kanüle mehrmals. Zentrifuge (400g, 5 min, RT), resuspendieren Zellen in PBS und intravenös in Ihre nude-bestrahlten Empfänger. In unseren Experimenten verwendeten wir BM von Foxp3-KI gfp / GFP-Mäuse, wo alle regulatorischen T-Zellen (Tregs) GFP 1 Schnellzugwagen wird.
- Die Akzeptanz des Spenders BM tritt in den ersten Tagen nach der Übertragung, da Nicht-BM-rekonstituierte Tiere nicht überleben können mehr als 14 Tage. Allerdings sollte man für 4 bis 6 Wochen warten, um in vollem Umfang der Einziehung aller BM Fächer zu ermöglichen. Bactrim (Roche) wurde auf dem Wasser (2 mg / ml) während der ersten Woche nach der Bestrahlung hinzugefügt, um das Risiko von bakteriellen Infektionen zu verringern.
- Embryonale Thymus-Transplantation wurde bereits 2 beschrieben. Kurz gesagt, beginnen Brutpaare isogenen Mäusen und prüfen zum Einstecken (Nachweis des Koitus) jeden Tag. Separate gesteckt Weibchen und CO 2-euthanize sie am Tag 15 der pregnancy (Beobachtung der Stecker ist Tag 1 der Schwangerschaft). Entfernen Sie die Embryonen und die Thymusdrüse. Legen Sie die embryonale Thymus in kaltem PBS bis zum Transfer.
- Zur Durchführung des Thymus Transplantation betäuben BM-Empfänger Nude Mäuse mit Ketamin (120 ug / g Maus Gewicht) / Xylazin (16 pg / g Maus Gewicht) und bewahren Sie sie auf einem Heizkissen bei 37 ° C, bis sie sich bewusstlos.
- Chirurgisch Setzen der Niere zur Transplantation des Thymus durchzuführen. Zuerst reiben Sie die Haut mit ChloraPrep (CareFusion Inc.) und 70% Ethanol. Dann eine 1 cm auf der Haut des Rückens-lateral Körperteil des Tieres, 2 mm unterhalb des letzten Brust-Rippe geschnitten.
- Cut der Bauchhöhle und ziehen Sie die Niere von diesem Hohlraum. Machen Sie einen kleinen oberflächlichen Schnitt in der Nierenkapsel mit einem Skalpell. Mit einer Pinzette mit einer sehr dünnen Spitze einen Beutel unter die Nierenkapsel des Empfängers Maus und bis zu 4 Thymus Lappen in diese Tasche.
- Legen Sie die Niere b ack an seinen Platz, Naht der Bauchhöhle mit einem oder zwei Stiche, und schließen Sie die Haut von Mäusen mit der gleichen Naht-Methode. Alternativ können Nähte erfolgt über chirurgische Kleber werden.
- Inject analgetische (Butorphanol bei 5 mg / kg) subkutan direkt nach Beendigung der Operation zu Tier Schmerzen zu vermeiden und halten die Tiere in einem Heizkissen, bis sie aus der Narkose zu erholen beginnen. Mäuse sind individuell für die ersten 3 Tage nach der Transplantation zu Käfig Kumpels aus dem Entfernen der Fäden zu verhindern Käfig. Entfernen Stiche nach 1 Woche.
- Nacktmäusen keine T-Zellen. Daher können Sie die Thymusdrüse Transplantat Akzeptanz durch die Überwachung der Anteil der CD4 + oder CD8 + T-Zellen im Blut zu bewerten. Einmal pro Woche, 2 Wochen nach Thymus-Transplantation, bluten die Tiere und Flecken des Blutes mit anti-CD4 und anti-CD8 monoklonalen Antikörpern (MAbs). Wenn die CD4: CD8-Verhältnis von etwa 2:1 ist, ist die transplantierten Thymus voll funktionsfähig (Abbildung 1).
Bereiten Sie alle Materialien, die Sie im Voraus müssen und legte sie beiseite wird.
- Anesthetize Tiere mit Ketamin / Xylazin (gleiche Dosen in Punkt 1.5 beschrieben) und platzieren Sie sie auf einem Heizkissen bei 37 ° C. Inject 100 ul von Rhodamin B-Isothiocyanat-Dextran (20 mg / ml in PBS) intravenös Zukunft Visualisierung des Blutflusses erlaubt.
- Expose der Niere mit der transplantierten Thymus nach dem Protokoll bereits in Punkt 1.6 beschrieben.
- Um zu verhindern, die Niere von der Rückkehr in seine ursprüngliche Position, in der Nähe der seitlichen Seiten der Hautschnitt mit Stichen.
- Legen Sie ein Stück PBS-getränkte Baumwolle auf der Oberseite des Organs zu halten sie feucht.
- Legen Sie die Heizkissen auf den Tierhalter Stufe (Abbildung 2A).
- Legen Sie das Tier auf dem Heizkissen in der Tierhalter, Orgel up (Abbildung 2B).
- Pinch das Organ an beiden Seiten mit einer Klemme made von dünnen Aluminiumfolie (Abbildung 2C).
- Schließen Sie die Tierhalter und Ort der Oberheizung Sonde so nahe wie möglich zu Ihrem Gewebe (Abb. 2D). Diese Heizung Sonde misst ständig die Orgel Temperatur und sendet diese Informationen an die Heizung, die elektrischen Strom einzustellen, halten sie bei 37 ° C.
- Entfernen Sie die PBS-getränkte Baumwolle und fügen niedrig schmelzende Agarose (2% in PBS) bei 30 ° C am Anfang Ihrer Vorbereitung.
- Decken die gesamte Vorbereitung mit der Oberheizung (Abbildung 2E). In die Öffnung an dieser Heizung gibt es ein Deckglas Isolierung der Agarose von den objektiven (Abbildung 2f). Überwachen Sie die Maus Anästhesie und injizieren eine halbe Dosis erhöhen alle 40 min. Nach der Bildaufnahme, einschläfern des Tieres mit CO 2.
Hinweis: Bilder von der Aluminiumfolie Clip und der Oberheizung sind in Abbildung 3 dargestellt.
3. Zwei-Photonen-Imaging-Übernahme
Wir haben eine aufrechte "Prairie Ultima XY" Zwei-Photonen-Mikroskop. Unser System ist mit einem Ti ausgestattet: Saphir-Laser, vier Top-PMTs zur gleichzeitigen bis zu 4-Kanal-Akquisitionen und einem 20x Wasser Immersionsobjektiv.
- Schalten Sie den Ti: Saphir-Laser und die ganze Mikroskop-System.
- Add dichroitische Spiegel und Filter-Sets nach den Wellenlängen gewünscht. In unserem Fall haben wir eine Olympus-BX2 Chroma Halter mit einem 565 nm dichroitischen Spiegel, ein 525/50 nm Filter (für Foxp3-GFP-Signal), und ein 595/50 nm Filter (für Dextran-Rhodamin-B-Signal in die Blutgefäße ). Die Laser-Wellenlängenbereich verwendet wurde zwischen 880 bis 900 nm liegt.
- Fügen Sie den Tierhalter an das Mikroskop, anschließen und einschalten alle Heizungen, Wasser hinzufügen, auf der Oberheizung Blende, vorsichtig das Ziel ins Wasser, und konzentrieren sich auf ein Schiff oder ein GFP-Tregs.
- Mit dem Mikroskop x, y, z externe Steuerung, schnell Umfrage des Gewebes zu einer Region finden von Interesse.
- Stellen Sie den Gewinn aus dem PMTs zu Farbseparation optimieren und die Höhe der Laser benötigt, um ein ausreichendes Signal gegenüber dem Hintergrund zu erreichen. Versuchen Sie, die minimale Menge von Laser verwenden, um Foto-Schaden von Gewebe zu vermeiden.
- Sobald der Region Interesse liegt, beginnen Zeitraffer-Bildgebung. In unserem Fall ein typisches 5D (x, y, z, t und Farbe) besteht Übernahme-Protokoll für den Erwerb aufeinander folgenden Bildern einer 50 mu m-Tiefe Gewebe Volumen, in 4,0 um z-Schritten, x-und y-Länge von 140 um geteilt jeder. Jeder Band dauert etwa 30 Sekunden erfasst werden. Daher werden 60 Akquisitionen durchführen rund 30 min von der Bildaufnahme.
- Übertragen Sie die Daten zu den institutionellen Server und verwenden ImageJ, Imaris oder Volocity Software, multi-dimensionale Darstellung und Zell-Tracking durchzuführen.
4. Repräsentative Ergebnisse
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Abbildung 1. . Embryonale Thymus Akzeptanz und Funktion Nach BM erholen, wurden embryonale Thymus zu BM rekonstituierten Tieren transplantiert, zwei Wochen nach Thymus Transplantation dieser Mäuse wurden einmal pro Woche ausgeblutet der Anteil der T-Zell-Subtypen durch Färbung mit anti-CD4 oder anti-CD8-Monitor MAbs. Wir haben überlegt, den Thymus wurde erfolgreich bei Tieren mit einer CD4 akzeptiert: CD8-Verhältnis um 1.5-2.0:1 (A). Um zu bestätigen, seine Funktionalität, wir einigen Thymus-transplantierten Tiere getötet und gegenüber der Prozentsatz der verschiedenen Thymozyten-Subpopulationen mit WT-Mäusen (B). Der Anteil der Doppel-negative (DN; CD4 - CD8 - Thymozyten) Subpopulationen (durch Färbung mit anti-CD25 und anti-CD44 mAk), Doppel-positive (DP; CD4 + CD8 + Thymozyten) und Single-positive (SP) CD4 + oder CD8 + Thymozyten waren ähnlich zwischen diesen Tieren.
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Abbildung 2. Tierische Inhaber Montage. Nach tief narkotisiert, das Tier auf einem Heizkissen gelegt wird, die zuvor auf der Oberseite des Tieres Inhaber Stufe (A) montiert. Die Niere, die die transplantierten Thymus ist nach oben (B). Eine Aluminiumfolie Klemme zart kneift die ganze Niere (C) zu halten, statt. Abb.. 1C einfügen zeigt im Detail die Klemme. Der obere Teil des tierischen Halter ist in Ort (D) gestellt. Die PBS-getränkte Baumwolle ist von der Spitze des Organs, durch warme niedrig schmelzende Agarose ersetzt entfernt, und die Oberheizung hinzugefügt wird (E). Schließlich ist die ganze Versammlung an das Mikroskop übertragen, hier vertreten durch das Objektiv (F).
Abbildung 3. Details der Inhaber Teile. Diese Bilder zeigen die Aluminiumfolie Klammer (A) hält die Niere (B). Beachten Sie auch die Region, in der die transplantierten Thymus befindet. Diese etwa zeigt die Regionin den Thymus Kapsel geschnitten und machen die Tasche, um die embryonale Thymus setzen. Die Oberheizung Deckglas (C) wurde mit Silikonkleber an ihrem unteren Teil (D) fest.
Movie 1. Intravital Bildgebung von Foxp3-GFP + Thymozyten im Thymus, wo die physiologischen Ebenen der Sauerstoffversorgung und Temperatur (37 ° C) während des gesamten Prozesses gehalten wurden. Beachten Sie die Durchblutung und die Bewegung der Tregs. Diese Geschwindigkeiten können gemessen und verglichen werden mit den veröffentlichten Daten. Klicken Sie hier, um sich den Film anzusehen.
Movie 2. Intravital Bildgebung von Tregs in einem Thymus, wo die Bilder bei 30 erworben wurden ° C. Beachten Sie das Fehlen von Bewegung und die runde Form der Zellen trotz der Aufrechterhaltung der Durchblutung. Klicken Sie hier um den Film anzusehen.
Discussion
In diesem Papier haben wir gezeigt, die Verfahren für die Zwei-Photonen-Imaging von Thymozyten im Inneren eines lebenden Tieres. Wir haben auch beschrieben, einige Parameter, die man sorgfältig kontrollieren sollten, wie die Fortsetzung des Blutflusses und der Aufrechterhaltung der Orgel Temperatur während der bildgebenden Verfahren. Dennoch, trotz sorgfältiger Anstrengungen, um die Orgel stabil ist, kann Bewegungsartefakte wie "Organ driften" auftreten. Posterior Bildkorrektur kann durch die Entwicklung von Algorithmen speziell für diesen Zweck konzipiert durchgeführt werden. Weitere Bildanalyse könnte auch die Quelle für neue Protokolle Entwicklung, die Fehler zu minimieren sucht.
Der Thymus ist das Organ, wo alle T-Zellen produziert und sind daher es das Organ, in dem Immunologen in das Verständnis der Generation von γδ interessiert ist, wird CD4 oder CD8 T-Zellen ihre Aufmerksamkeit. Die meisten Studien über T-Zellen sind auf Unterschiede in den Zahlen und / oder Stabilität dieser Basis cEllen nach verschiedenen in vitro / in vivo Manipulationen. Allerdings erst nach der in vivo-Visualisierung konnten wir beobachten die Interaktion zwischen Zellen des Immunsystems in der Aufrechterhaltung der Homöostase 3-7 beteiligt. Daher ist die in vivo Beobachtung von Thymozyten wahrscheinlich eine der wichtigsten fehlenden Informationen besser zu verstehen, T-Zell-Biologie. Intravital TPM bietet ein detailliertes Bild der T-Zell-Bewegungen und Interaktionen, und wir zeigen hier, wie es für detaillierte Thymozyten Studien eingesetzt werden kann. Allerdings hat jede Technik ihre Grenzen. Während intravital Imaging Acquisition ist die genaueste System zur reflektierenden Zellen Verhalten im Inneren des Körpers, es ist auch wahr, dass explantierten Bildaufnahme von Organen weniger aufwändig ist und verwendet wurde, um wichtige Informationen über das Immunsystem 8,9 sammeln. Darüber hinaus kann man nicht leugnen intravital bildgebenden Verfahren eine Operation erforderlich, um Gewebe und Blutgefäße in narkotisierten Tiere auszusetzen,die per se könnte eine Veränderung in der gesamten Organs Physiologie 10. Dennoch gibt es nicht-invasiv Methoden, die die Artefakte, die durch den chirurgischen Eingriff 11 und neue Methoden verursacht abschaffen werden entwickelt, die besser im Voraus vorbereiten zu verwendenden Tiere 12 sein. Daher werden neue chirurgische Verfahren und Gebühren zu minimieren oder zu umgehen tatsächlichen Grenzen der intravitalen Imaging Erwerb und sich mehr und mehr zugänglich für die wissenschaftliche Gemeinschaft.
Wir haben gezeigt, dass die Methode, die wir beschrieben haben, machbar ist und es meldet alle in vivo systemische Manipulationen, wie Medikamentengabe, die wir verwendet haben. Daher empfehlen wir den Einsatz dieser Methode in Verbindung mit ex vivo Techniken bereits zur Verfügung, um die Ergänzung und Verstärkung weitere Studien über die Thymozyten Entwicklung.
Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir möchten Dr. David Olivieri für die kritische Durchsicht des Manuskripts, Dr. Nuno Moreno danken für die logistische Hilfe für unsere Tier-Halter und Heizkissen und Dr. Vijay K. Kuchroo für die Sachspende von Foxp3-KI gfp / GFP bauen Mäusen. Diese Arbeit wird durch "Fundação para Ciência e Tecnologia" (FCT, Portugal), Grant # PTDC/EBB-BIO/115514/2009 unterstützt.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhodamine B ishothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | prepare stock at 20 mg/ml | |
| Two-photon microscope | Prairie Technologies Inc. | Prairie Ultima X-Y | ||
| Ti:Sapphire laser | Coherent, Inc. | Chameleon Ultra Family | ||
| 20x/1.00 NA immersion objective | Olympus Inc. | XLUMPLFLN 20XW | ||
| Holder (Filters/Dichroic) | Chroma Technology Corp. | 91018 BX2 (U-MF2) | ||
| 525 nm/50 filter | Chroma Technology Corp. | ET525/50m | ||
| 595 nm/50 filter | Chroma Technology Corp. | ET595/50m | ||
| 565 nm dichroic | Chroma Technology Corp. | 565dcxr | ||
| Imaris software | Bitplane AG Inc. | Imaris | ||
| Volocity | PerkinElmer Inc. | Volocity | ||
| ImageJ | NIH, USA | ImageJ |
References
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