Summary
פיתחנו במעבדה רומן כלים ופרוטוקולים לרכישת הדמיה intravital של התימוס. הטכניקה שלנו אמור לעזור בזיהוי של "נישות" בתוך התימוס שבו התפתחות תא T מתרחשת.
Abstract
שני הפוטונים מיקרוסקופית (TPM) מספק רכישת התמונה באזורים עמוק בתוך רקמות ואיברים. בשילוב עם פיתוח כלים חדשים stereotactic ניתוחים, TPM הופך טכניקה רבת עוצמה כדי לזהות "נישות" בתוך איברים במסמך הסלולר "התנהגויות" של בעלי חיים. בעוד הדמיה intravital מספק מידע דומה בצורה הטובה ביותר את התנהגות הסלולר אמיתי בתוך איבר, זה גם מייגע יותר תובענית מבחינה טכנית מבחינת ציוד / ההליכים הנדרשים מאשר אלטרנטיבה לרכישת לשעבר הדמיה vivo. לפיכך, אנו מתארים הליך כירורגי הרומן איבר "stereotactic" בעל המאפשרת לנו לעקוב אחר תנועות Foxp3 + תאים בתוך התימוס.
Foxp3 הוא רגולטור עבור הדור של תאים T רגולטוריים (Tregs). יתר על כן, תאים אלה יכולים להיות מסווגים על פי מוצאם: כלומר. התימוס, הבדיל Tregs נקראים "טבעיים המתחוללים Tregs" (nTregs), כמו opposed אל שולי המרה Tregs (pTregs). למרות כמות משמעותית של מחקר דווחה בספרות לגבי הפנוטיפ ופיזיולוגיה של תאים אלה T, מעט מאוד ידוע על יחסי הגומלין שלהם vivo עם תאים אחרים. מחסור זה עשוי להיות בשל העדר של טכניקות שיאפשרו תצפיות כאלה. פרוטוקול המתואר במאמר זה מספק תרופה למצב זה.
פרוטוקול שלנו מורכב באמצעות עכברים בעירום כי חוסר התימוס אנדוגני מכיוון שיש להם מוטציה דייקן ברצף ה-DNA כי הפשרות הבידול של חלק מתאי האפיתל, כולל בתאי אפיתל הרתי. עכברים עירום היו גמא מוקרן ו מחדש עם קישואים העצם (BM) מעכברים Foxp3 KI-GFP / GFP. לאחר התאוששות בע"מ (6 שבועות), כל חיה קיבלה עובריים התימוס השתלת כליה בתוך הקפסולה. לאחר קבלת התימוס (6 שבועות), החיות היו מורדמים, כליות המכיל אתהתימוס המושתל נחשף, קבוע בעל איבר שלנו, וכל הזמן תחת תנאים פיסיולוגיים עבור הדמיה in vivo על ידי TPM. אנחנו משתמשים בגישה זו כדי לחקור את ההשפעה של תרופות הדור של תאים T רגולטוריים.
Protocol
1. בעלי חיים הכנה
הערות חשובות: המתלים תא רות השתלות הרתי בוצעו בתנאים aseptic. המתלים BM היו מוכנים בתוך מכסי המנוע של החדר שלנו התא התרבות, ואילו השתלת הרתי בוצע בחדר ניתוח הממוקם בתוך מתקן חיה שלנו. על מנת לשמור ולהבטיח תנאים אלו מזוהם, אסור היה להקליט וידאו שלנו במקומות האלה. עם זאת, כל החומרים כירורגית היו autoclaved ואת ספסל כירורגית נוקה בעבר עם Virkon (Pharmacal מעבדות מחקר בע"מ) ו 70% אתנול. כל הנהלים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש הוועדה (IACUC) והם היו הסכם עם הפדרציה האירופאית של המעבדה אגודות בעלי חיים מדע (FELASA) הנחיות. מספר מזהה האישור AO10/2010. כל הניסויים היו נהלים תמונה מסוף החיות היו מורדמים מיד לאחר תום תמונההרכישה.
הנוהל המפורט הוא כדלקמן:
- מקרינים (עם irradiator-γ) 8 שבוע הישן עכברים עירום עם 900 rads להרוס את מבשרי hematopoietic אנדוגני בתוך העצם קישואים (BM). לאחר ההקרנה, להחזיר את החיות בכלובים שלהם עד להכנת תאים מתורם BM להזרקה תוך ורידית והרכבתה מחדש BM נוספת. העברה זו בוצעה BM 1 שעות לאחר ההקרנה.
- הפרד את בעלי החיים תורם BM. Tibias ואת עצמות הירך של הגפיים האחוריות של החיה אחד הם בדרך כלל מספיק כדי לשחזר עד 3 חיות הנמען. לאחר המתת חסד עם CO 2, להסיר את הגפיים האחוריות ולאחר מכן להסיר את העור ואת השרירים מהעצמות.
- חותכים את הקצה הסגור של כל עצם ולשטוף אותו עם PBS (או RPMI) או לרסק את כולם במכתש, באמצעות העלי, עם 2 מ"ל של PBS (או RPMI) כדי להסיר את BM.
- לשבש את המבנה BM ההשעיה לתוך תא בודד על ידי חזרות של שאיפה נמרצת USIng פיפטה P1000. לחלופין, ניתן גם להעביר את BM ברחבי מחט מזרק 21G מספר פעמים. צנטריפוגה (400 גרם, 5 דקות, RT), מחדש תאים להשעות PBS, וכן להזריק לווריד אל הנמענים עירום מוקרן שלך. בניסויים שלנו השתמשנו BM מ Foxp3 KI-GFP / עכברים GFP שבו כל התאים T רגולטוריים (Tregs) תביע GFP 1.
- קבלה של BM התורם מתרחשת בימים הראשונים לאחר ההעברה, שכן אי - BM-מחדש חיות לא יכול לשרוד יותר מ 14 ימים. עם זאת, יש לחכות 4 עד 6 שבועות על מנת לאפשר התאוששות מלאה של כל התאים BM. Bactrim (Roche) נוספה המים (2 מ"ג / מ"ל) במהלך השבוע הראשון לאחר קרינה כדי להקטין את הסיכון לזיהומים חיידקיים.
- התימוס עובריים להשתלה תוארה כבר 2. בקיצור, להתחיל הרבייה זוגות של עכברים isogenic ולבדוק חיבור (עדות משגל) בכל יום. הפרד פקוק נקבות CO 2-להרדים אותם ביום 15 של pregnancy (תצפית של התקע יום 1 של ההריון). הסר את העוברים ואת thymuses. מניחים את thymuses עובריים בקור PBS עד ההעברה.
- כדי לבצע את השתלת thymuses, להרדים BM-הנמען עכברים עירום עם ketamin (120 מיקרוגרם / גרם של משקל העכבר) / xylazine (16 מיקרוגרם / גרם של משקל העכבר) ולשמור אותם על גבי כרית חימום על 37 מעלות צלזיוס עד שהם מקבלים מודע.
- בניתוח חושפים את הכליות לבצע את השתלת thymuses. ראשית לשפשף את העור עם ChloraPrep (Carefusion Inc) ואתנול 70%. ואז, לעשות 1 ס"מ לחתוך על העור החלק האחורי לרוחב הגוף של החיה, 2 מ"מ לשאוג הצלעות החזה שעברה.
- חותכים את חלל הצפק ולשלוף את הכליה של חלל זה. ביצוע חתך שטחי קטן הקפסולה כליות עם להב אזמל. בעזרת מלקחיים עם קצה דק מאוד לעשות כיס מתחת הקפסולה כליות של העכבר הנמען להוסיף עד 4 האונות הרתי לתוך כיס זה.
- שים את b כליה ACK למקומה, תפר את חלל הצפק עם אחד או שני תפרים, ולאחר מכן לסגור את העור עכבר בשיטת תפר אותו. לחלופין, התפרים ניתן לעשות זאת באמצעות דבק כירורגי.
- להזריק משכך כאבים (Butorphanol על 5 מ"ג / ק"ג) תת עורי מיד לאחר שסיים את הניתוח כדי למנוע כאבים בעלי חיים לשמור על בעלי החיים כרית חימום עד שהם מתחילים להתאושש מן ההרדמה. עכברים הם בכלוב בנפרד במשך 3 הימים הראשונים לאחר ההשתלה, כדי למנוע חבריהם לכלוב להסיר את התפרים. הסרת תפרים אחרי שבוע 1.
- עכברים עירום אין ותאי T. לכן, אתה יכול להעריך את קבלת שוחד התימוס ידי ניטור אחוז CD4 + או CD8 + T תאים בדם. פעם בשבוע, 2 שבועות לאחר השתלת התימוס, לדמם את החיות ואת כתם הדם עם אנטי CD4 ו - CD8 אנטי נוגדנים חד שבטיים (מבז). כאשר CD4: CD8 היחס הוא בערך 2:01, התימוס המושתל היא מתפקדת במלואה (איור 1).
הכינו את כל החומרים תצטרך מראש ולשים אותם בצד.
- להרדים חיות עם ketamin / xylazine (במינונים אותו תיאר פריט 1.5) ומניחים אותם על גבי כרית חימום על 37 ° C. להזריק 100 μl של Rhodamine isothiocyanate B-dextran (20 מ"ג / מ"ל PBS) לווריד כדי לאפשר ראיה עתידית של זרימת הדם.
- לחשוף את הכליה שמכיל את התימוס המושתל לפי הפרוטוקול שתואר לעיל ב 1.6 פריט.
- כדי למנוע את הכליה לשוב למקומו המקורי, סגור את הצדדים לרוחב החתך בעור עם תפרים.
- הנח פיסת צמר גפן ספוג PBS על החלק העליון של האיבר כדי לשמור אותו לח.
- מכניסים את כרית החימום על גבי הבמה החיה מחזיק (איור 2A).
- שים את חיה על גבי כרית חימום בעל חיים, עד איבר (תרשים 2B).
- קורט האיבר בבית הצדדים עם מלחציים מ 'ade של רדיד אלומיניום דק (איור 2C).
- סגור את מחזיק בעלי חיים במקום בדיקה החימום העליון קרוב ככל האפשר לרקמות שלכם (איור 2 ד). זו בדיקה מחמם כל הזמן מודד את הטמפרטורה איבר ושולח את המידע הזה מחמם כדי להתאים את הזרם החשמלי, שמירה על אותה ב 37 ° C.
- הסר את PBS כותנה ספוג ולהוסיף נמוכה ההיתוך agarose (2% ב PBS) בשעה 30 ° C על גבי הכנה שלך.
- מכסים את כל ההכנה עם דוד העליון (2E איור). בשנת הצמצם על תנור זה יש לבודד את coverglass agarose מן המטרה (תרשים 2F). צג ההרדמה העכבר להזריק דחיפה חצי מנה כל 40 דקות. לאחר רכישת התמונה, להרדימו עם CO 2.
הערה: התמונות של קליפ רדיד האלומיניום ואת החימום העליון מוצגים באיור 3.
3. שני פוטונים הדמיה רכישה
השתמשנו זקופה "Prairie Ultima XY" שני הפוטונים מיקרוסקופ. המערכת שלנו מצוידת טי: ספיר לייזר, ארבעה PMTs העליון עד 4 רכישות סימולטני ערוץ 20x טבילה במים אובייקטיבי.
- הפעל את טי: ספיר לייזר ומערכת מיקרוסקופ כולו.
- הוספת מראות dichroic וקובע לסנן על פי אורכי הגל הרצוי. במקרה שלנו השתמשנו בעל Olympus-BX2 Chroma המכיל מראה 565 ננומטר dichroic, אחד ננומטר 525/50 המסנן (עבור אות Foxp3-GFP), ואחד ננומטר לסנן 595/50 (עבור אות dextran-Rhodamine-B בתוך כלי הדם ). טווח אורכי גל הלייזר היה בשימוש בין 880-900 ננומטר.
- מוסיפים את בעל החי המיקרוסקופ, לחבר ולהדליק את כל התנורים, להוסיף מים על הצמצם החימום העליון, התחתון את היעד בקפידה לתוך המים, ולהתמקד כלי או GFP-Tregs.
- עם X מיקרוסקופ, y, z בקרה חיצונית, סקר במהירות את הרקמה לאתר האזור של עניין.
- התאם את הרווח על PMTs כדי לייעל את הפרדת צבעים ולהקטין את כמות לייזר הנדרש כדי להשיג אות מספיק על הרקע. נסה להשתמש בכמות מינימלית של לייזר כדי למנוע צילום של הנזק לרקמות שלך.
- לאחר באזור האינטרסים ממוקם, להתחיל זמן לשגות הדמיה. במקרה שלנו, 5D טיפוסי (x, y, z, t, וצבע) פרוטוקול הרכישה מורכבת של רכישת תמונות רציפים של נפח מיקרומטר עומק 50 רקמות, מחולק 4.0 מיקרומטר Z-צעדים, x ו-y באורך של 140 מיקרומטר כל אחד מהם. כל כרך לוקח בערך 30 שניות להירכש. לכן, 60 רכישות יבצע סביב 30 דקות הרכישה של התמונה.
- העברת הנתונים אל השרת מוסדיים להשתמש ImageJ, Imaris, או תוכנה Volocity לבצע רב מימדי עיבוד ומעקב אחר תא.
4. נציג תוצאות
g1.jpg "/>
באיור 1. . עובריים קבלה התימוס ותפקוד לאחר BM להתאושש, thymuses עובריים הושתלו לחיות מחדש BM, שבועיים לאחר השתלת התימוס, עכברים אלה היו דימם פעם בשבוע כדי לפקח על אחוזי תת תא T על ידי מכתים עם אנטי CD4 או אנטי CD8 מבז. שקלנו התימוס התקבלה בהצלחה בחיות עם CD4: CD8 יחס סביב 1.5-2.0:1 (A). כדי לאשר את הפונקציונליות שלו, הקרבנו כמה התימוס-המושתלים בחיות לעומת אחוז subpopulations thymocyte שונים עם עכברים WT (B). אחוזי פעמיים שלילי (DN; CD4 - CD8 - thymocytes) subpopulations (על ידי מכתים עם אנטי CD25 אנטי CD44 מבז), פעמיים חיובי (DP; CD4 + CD8 + thymocytes) ו יחיד חיובי (SP) CD4 + או CD8 + thymocytes היו דומים בין בעלי החיים האלה.
ig2.jpg "/>
באיור 2. בעל הרכבה בעלי חיים. בהרדמה לאחר עמוק, החיה הוא הניח על גבי כרית חימום, רכוב קודם על גבי הבמה בעל חיים (א). כליות המכיל את בלוטת התימוס המושתל הוא פונה כלפי מעלה (B). מהדק נייר אלומיניום צובט בעדינות את הכליה כולה (ג) כדי לשמור אותו במקום. איור. 1C להכניס מראה בפירוט את מהדק. החלק העליון של בעל חיים היא לשים במקום (ד '). כותנה PBS ספוג מוסר מהחלק העליון של האיבר, הוחלף על ידי חם נמוך ההיתוך agarose, ואת החימום העליון מתווסף (E). לבסוף, הרכבה כולו מועבר המיקרוסקופ, כאן מיוצג על ידי המטרה (F).
באיור 3. פרטי בעל חלקים. אלה תמונות להראות את רדיד אלומיניום מהדק (א) מחזיק את הכליה (B). שים לב גם את האזור שבו ממוקם התימוס המושתל. זה בערך מציין את האזורלחתוך את קפסולת התימוס ולעשות את כיס לשים את התימוס עובריים. Coverglass דוד העליון (C) היה קבוע עם דבק סיליקון בחלקו התחתון (ד ').
סרט 1. הדמיה Intravital של Foxp3-GFP + thymocytes בתוך התימוס שבו רמות פיזיולוגיות של חמצון וטמפרטורה (37 ° C) הוחזקו במשך כל התהליך. שים את זרימת הדם ואת תנועת Tregs. מהירויות אלו ניתן למדוד בהשוואה לנתונים שפורסמו. לחץ כאן כדי להציג את הסרט.
סרט 2. Intravital הדמיה של Tregs בתוך התימוס שם את התמונות נרכשו על 30 ° C. הערה היעדר התנועה ואת הצורה העגולה של התאים למרות לשמירה על זרימת הדם. לחץ כאן כדי להציג את הסרט.
Discussion
במאמר זה הראינו את ההליכים עבור הדמיה של שני הפוטונים thymocytes בתוך החי. אנחנו גם תיאר כמה פרמטרים שצריך לשלוט היטב, כגון המשך זרימת הדם ושמירה על טמפרטורה איבר במהלך ההליכים הדמיה. עם זאת, למרות מאמצי זהיר כדי לשמור על איבר יציב, ההצעה artifacts כגון "האיבר נסחף" יכול להתרחש. תיקון תמונה Posterior יכול להתבצע על ידי פיתוח אלגוריתמים שתוכננו במיוחד למטרה זו. ניתוח התמונה בהמשך יכול להיות גם מקור פיתוח פרוטוקולים חדשים המבקשת למזער טעויות.
התימוס הוא האיבר שבו כל ותאי T מיוצרים, ולכן הוא האיבר שבו אימונולוגים מעוניינים להבין את הדור של γδ, CD4 או CD8 ותאי T ימקדו את תשומת הלב שלהם. רוב המחקרים הנוגעים בתאי T מבוססים על הבדלים במספרים ו / או יציבות של אלה גאמות אחרי שונים במבחנה / ב המניפולציות vivo. עם זאת, רק לאחר להדמיה vivo ב יכולנו לראות את האינטראקציה בין תאים של המערכת החיסונית מעורב בשמירה על הומאוסטזיס 3-7. לכן, בהתבוננות vivo של thymocytes הוא כנראה אחד המידע החסר החשוב ביותר כדי להבין טוב יותר בביולוגיה של התא טי. Intravital TPM מספק תמונה מפורטת של התנועות והאינטראקציות תא T ואנחנו להדגים כאן כיצד ניתן להשתמש בו ללימודים thymocyte מפורט. עם זאת, כל טכניקה יש מגבלות. בעוד intravital הרכישה היא מערכת הדמיה מדויקת ביותר המשקף התנהגות תאים בתוך הגוף, זה גם נכון, כי רכישת תמונה explanted האיברים הוא מייגע פחות נעשה שימוש כדי לאסוף מידע חשוב על המערכת החיסונית 8,9. יתר על כן, אחד לא יכול להכחיש שיטות הדמיה intravital דורשים ניתוח לחשוף רקמות וכלי דם אצל בעלי חיים מרדים,אשר כשלעצמה יכולה לגרום שינוי באיבר כולו הפיזיולוגיה 10. עם זאת, ישנם הלא פולשני שיטות לבטל את החפצים הנגרמת על ידי ההליך הכירורגי 11 ושיטות חדשות מפותחים כי עדיף להכין מראש את בעלי החיים כדי לשמש 12. לפיכך, פעולות כירורגיות חדשים אגרה יהיה למזער או לעקוף מגבלות בפועל של רכישת הדמיה intravital ולהיות יותר ויותר נגיש הקהילה המדעית.
אנחנו הוכיחו כי השיטה שתיארנו אינו ריאלי והוא מדווח כל המניפולציות מערכתית vivo, והתרופות כאלה, השתמשנו. לפיכך, אנו ממליצים על שימוש בשיטה זו, יחד עם טכניקות vivo לשעבר כבר זמין על מנת להשלים ולחזק מחקרים נוספים בדבר התפתחות thymocytes.
Disclosures
אין לנו שום דבר לגלות.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לד"ר דוד Olivieri לבחינה ביקורתית של כתב היד הזה, ד"ר נונו מורנו על העזרה לוגיסטית לבנות בעל חיים שלנו כריות חימום ד"ר ויג'אי ק Kuchroo על התרומה סוג של Foxp3 KI-GFP / GFP עכברים. עבודה זו נתמכת על ידי "Fundação פסקה Ciência דואר Tecnologia" (FCT, פורטוגל), מענק # PTDC/EBB-BIO/115514/2009.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhodamine B ishothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | prepare stock at 20 mg/ml | |
| Two-photon microscope | Prairie Technologies Inc. | Prairie Ultima X-Y | ||
| Ti:Sapphire laser | Coherent, Inc. | Chameleon Ultra Family | ||
| 20x/1.00 NA immersion objective | Olympus Inc. | XLUMPLFLN 20XW | ||
| Holder (Filters/Dichroic) | Chroma Technology Corp. | 91018 BX2 (U-MF2) | ||
| 525 nm/50 filter | Chroma Technology Corp. | ET525/50m | ||
| 595 nm/50 filter | Chroma Technology Corp. | ET595/50m | ||
| 565 nm dichroic | Chroma Technology Corp. | 565dcxr | ||
| Imaris software | Bitplane AG Inc. | Imaris | ||
| Volocity | PerkinElmer Inc. | Volocity | ||
| ImageJ | NIH, USA | ImageJ |
References
- Bettelli, E. Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells. Nature. 441, 235-238 (2006).
- Ramsdell, F., Zúñiga-Pflücker, J. C., Takahama, Y. In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture. Current protocols in immunology. Coligan, J. E. , (2006).
- Tadokoro, C. E. Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo. J. Exp. Med. 203, 505-511 (2006).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Miller, M. J. Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes. J. Exp. Med. 200, 847-856 (2004).
- Shakhar, G. Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo. Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).
- Hugues, S. Distinct T cell dynamics in lymph nodes during the induction of tolerance and immunity. 5, 1235-1242 (2004).
- Tang, Q. Visualizing regulatory T cell control of autoimmune responses in nonobese diabetic mice. Nat. Immunol. 7, 83-92 (2006).
- Le Borgne, M. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nature immunology. 10, 823-830 (2009).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvascular research. 5, 384-394 (1973).
- Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo. J. Vis. Exp. (46), e2062-e2062 (2010).
- Barretto, R. P. J. Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy. Nature medicine. 17, 223-228 (2011).
