قياس الكالسيوم السريع في تدفقاتها العضلية

Summary

نقدم طريقة سريعة لعزل الأحداث الكالسيوم (ميكروثانية) أبطأ من الدفقات في الخلايا الحية باستخدام ليزر متحد البؤر المجهر. الأسلوب التدابير تقلبات كثافة مضان من المؤشرات التي تفحص الكالسيوم خط بكسل تسجيل عدة مئات في الخلية. تحليل الرسم البياني يسمح لنا عزل جداول زمنية لتدفقات الكالسيوم مختلفة.

Abstract

العضلية لديك عدة كا ^{2 +} تدفقات متفاوتة المدة التي تعمل معا لتحسين ^1،2 وظيفة. تغييرات في كا ^{2 +} ينظم النشاط في الغالب استجابة لعوامل خارج الخلية التي مسار فسفوليباز _ف Cβ - Gα المترجمة على غشاء البلازما التي تحفزها عوامل مثل أستيل ^3،4. لقد وجدنا في الآونة الأخيرة يمكن أن اصطاد تنشيط مجالات البلازما بروتين يسمى الغشاء caveolae ^5،6 Gα _ف ^7. هذا فخ له تأثير في تحقيق استقرار الدولة في تنشيط _ف Gα وما ينتج عنها من مدة طويلة في كاليفورنيا في ^{2 +} إشارات العضلية وغيرها من أنواع الخلايا ^8. وكشف لنا هذه النتيجة مفاجئة من خلال قياس ردود الكالسيوم الحيوية على نطاق والعضلية السريعة في الحي. لفترة وجيزة ، يتم تحميل خلايا مع مؤشر كا الفلورسنت ^{+ 2.} في دراساتنا ، استخدمنا كا ^{2 +} الخضراء (Invitrogen ، وفيج) الذي يسلك زيادة في كثافة الانبعاثات مضان على ربط أيونات الكالسيوم. ثم يتم تسجيل كثافة مضان لاستخدام وضع خط مسح ليزر متحد البؤر المسح المجهر. هذا الأسلوب يسمح اقتناء السريع للدوام من كثافة مضان بالبكسل على طول الخط المحدد ، وإنتاج عدة مئات من آثار الزمن على مقياس الوقت ميكروثانية. يتم نقل هذه الآثار سريع جدا في التفوق ومن ثم الى Sigmaplot للتحليل ، ومقارنة آثار حصل للضوضاء الإلكترونية ، وصبغ الحرة ، وضوابط أخرى. تشريح كا ^{2 +} ردود معدلات تدفق مختلفة ، وأجرينا تحليلا الرسم البياني ان اهمال كثافة بكسل مع مرور الوقت. Binning يسمح لنا أكثر من 500 مجموعة آثار بمسح ووضع تصور لنتائج المترجمة مكانيا وزمانيا على قطعة واحدة. وبالتالي ، يمكن للموجات بطيئة الكالسيوم ^{+ 2} التي يصعب تمييز عندما يتم مضافين التفحص بسبب التنسيب الذروة المختلفة ، والضوضاء ، وينظر بسهولة فيرسوم بيانية للاهمال. تدفقات سريع جدا في النطاق الزمني لقياس توزيع تظهر ضيقة من شدة في صناديق وقت قصير جدا بينما تعد كا ^{2 +} الموجات تظهر البيانات اهمال مع توزيع واسعة في صناديق لوقت أطول. هذه التوزيعات زمنية مختلفة تسمح لنا بتحليل توقيت كا ^{2 +} الدفقات في الخلايا ، وتحديد تأثيرها على الأحداث الخلوية المختلفة.

Protocol

1. تحميل الخلايا مع مؤشرات الكالسيوم

1. لوحة الخلايا في 35mm الزجاج أسفل أطباق ماتيك (أو أي أسفل الزجاج الآخرين الذين يشاهدون غرف).
2. إذا باستخدام الابتدائي myocytes معطف قبل يوم 1 غرف مع 10μg/ml laminin. myocytes وحة القلب (معزولة من الكلاب الكبار ، والفئران حديثي الولادة ، أو كائن آخر) في المخزن المؤقت كيلو بايت (K - انعكاس العازلة Tyrode 35 ملمول / لتر من HEPES ، 140 ملمول / لتر من بوكل ، 8 ملمول / لتر من KHCO ₃ ، 2 ملمول / L من MgCl ₂ ، و 0.4 ملمول / لتر من KH ₂ PO ₄ ، ودرجة الحموضة 7.5) وتغييره تدريجيا إلى M199 المتوسطة تستكمل مع 15 ٪ مصل بقري جنيني وstreptamycin 1 ٪ و 0.5 ٪ جنتاميسين واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5 ٪ CO _2.
3. احتضان خلايا خضراء مع الكالسيوم صباحا (1-5 ميكرومتر ؛ المسابر الجزيئية) أو أي مؤشر الكالسيوم المطلوب ل30-45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تغطية الطبق بورق الألمنيوم لتجنب photobleaching للصباغة.
4. غسل الخلايا ثلاث مرات مع Leibovitz15 المتوسطة مع EGTA 14mM (إذا كان إجراء التجارب في الكالسيوم منخفض) أو أي وسائط عرض مناسب.
5. احتضان لمدة دقيقتين 30-45 في Leibovitz15 المتوسطة containing14mM EGTA.
6. إذا كان اختبار آثار مثبطات (أي 10μM U73122 PLC المانع) إضافتها خلال الحضانة الثانية.

2. Microinjecting الخلايا

1. العضلية الثقافة في أسفل الزجاج أطباق ماتيك (أو غيرها من غرف المشاهدة) عن 24H.
2. تغيير على المديين المتوسط ​​وخالية من الفينول يبوفيتش - 15 مع EGTA ملي 14 (العضلية يجب أن تكون في حقن الكالسيوم المتوسطة مجانا ، ويمكن حقن الخلايا الأخرى التي تحتوي على الكالسيوم في المتوسط).
3. يعد حل microinjection -- دراساتنا استخدام الببتيد الذي يلغي Gα _ف -- التفاعلات caveolae. نضع في اعتبارنا أن يتم حقن كمية صغيرة فقط من حجم في الخلية (~ فلوريدا) وهكذا يجب أن تستخدم مخزونات تتركز بشكل معقول. استخدمنا 2 ميكرومتر هذا الببتيد ، Cav3 - سقالة ، مع دابي في متوسطة الكالسيوم الحرة. دابي هو بلوه الصبغة التي البقع النواة ويسمح تحديد الخلايا التي تم microinjected. دابي لا تتداخل مع الكالسيوم مضان مؤشرات كثيرة. كمية دابي هو متغير ، ونحن عموما استخدام ما يكفي لتصور النواة (0.5 و 2 ميكرومتر)
4. يعد حل التحكم التي تحتوي على دابي -- التتبع وصباغة وحدها.
5. لاستخدام الإبر microinjections الذاتي أو سحبها متاحة تجاريا. الممارسة مع حقن الصبغة لتحديد معالم الإبرة المناسبة. نلاحظ أن خلايا مختلفة قد تتطلب بأقطار مختلفة والضغوط إبرة microinjection.
6. استخدام النظام الآلي microinjection ، مثالا للNI2 InjectMan بمضخة FemtoJet من إيبندورف. ضبط ضغط الحقن ف _ط إلى 90 HPA ، وتعويض الضغط ف _ج إلى 45 هكتوبسكال. ضبط طن الوقت الحقن إلى 0.7 ثانية. تعدل المعلمات الحقن حسب الحاجة.
7. أداء microinjections على مجهر مقلوب (مثل زايس Axioveغ 200M) مجهزة مسافة طويلة الهدف النقيض مرحلة العمل (على سبيل المثال المرحلة الهواء 40X 2 هدف).
8. كما ضخ أكبر عدد ممكن من الخلايا بطريقة سريعة. فحص خلايا باستخدام حقن النقيض المرحلة لتحديد خلايا قابلة للحياة.

3. شارك في دراسات المناعي

1. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني والإصلاح مع بارافورمالدهيد 3.7 ٪ لمدة 30 دقيقة. إذا لزم الأمر ، يمكن أن تحفز الخلايا قبل التثبيت.
2. غسل الخلايا الثابتة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني ، واحتضان مع 0.2 ٪ في برنامج تلفزيوني عن NP40 5minutes.
3. كتلة باستخدام برنامج تلفزيوني يحتوي على 4 ٪ مصل الماعز (أو مصل مناسبة أخرى) ل1hour.
4. احتضان خلايا الجسم المضاد مع الابتدائي في التخفيف المناسبة مع مصل الماعز 1 ٪ في برنامج تلفزيوني عن 1hour.
5. غسل الخلايا ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة مع كلوريد الصوديوم 150 مم ، 25 مم تريس ، ودرجة الحموضة 7.6 تليها إضافة الفلورسنت ذات العلامات الضد الثانوية ، مثل اليكسا - فلور - 488 المضادة للأرنب أو فلور اليكسا - 647 المضادة للجسم الفأر الثانوية المخفف إلى 1: 1000 الماعز 1 ٪ مصل في برنامج تلفزيوني (لاحظ أنه عند التحقيق لاثنين من البروتينات المختلفة يجب أن تثار الأضداد الابتدائي في أنواع مختلفة والثانوية يجب أن يكون ضد الأنواع المماثلة).
6. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1hour ، ويغسل ثلاث مرات مع TBS.
7. عرض الخلايا في TBS العازلة أو وسيلة أخرى عرض مناسب.

4. الكالسيوم التصوير السريع

1. استخدام ليزر متحد البؤر المسح المجهر (على سبيل المثال Fluoview أوليمبوس 1000).
2. ارتفاع استخدام الهدف الفتحة العددية.
3. تعيين المعلمات الاستحواذ. لاستخدام الإثارة الكالسيوم الخضراء نانومتر 488 و تمريرة طويلة من الانبعاثات المرشحات 515.
4. تعيين سريع لقياس الكالسيوم لشحد 2 / بكسل -- ضبط الوقت بكسل.
5. تعيين تكبير الصورة لتحقيق حجم بكسل ،05-0،3 ميكرون.
6. حدد خط من خلية الاختيار في منطقة معينة.
7. في الوقت الذي حدد إطار وحدة تحكم اكتساب الوقت ما لا يقل عن 1500 بمسح (للحصول على الإطار الزمني المطلوباستجابة -- أن 1.3 مللي / خط الغلة 2 ثانية).
8. خلفية السجل القراءة قبل التحفيز.
9. تحفيز الخلايا مع كرباكول ميكرومتر (5) والبدء فورا في تسجيل البيانات. إبقاء الخلايا في 1 مل من Leibovitz15 المتوسطة ، وإعداد 10 ميكرومتر في كرباكول Leibovitz15 بلطف وإضافة 1 مل في طبق

5. تحليل البيانات

1. استخراج شدة لكل بكسل من الصورة المسجلة. حفظ البيانات كثافة كجدول Fluoview 1000 باستخدام البرمجيات.
2. بيانات كثافة Sigmaplot استيراد أو تحليل البيانات وبرنامج مماثل بن البيانات في صناديق 90-40 ~. مقارنة للسيطرة على التجارب والضجيج الإلكترونية.

6. ممثل النتائج :

نحن تصوير الخلايا على المسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهر LSM510 (زايس ، جينا ، ألمانيا) مجهزة الإثارة ليزر متعدد الخطوط والمياه لامزيغ NA 40x/1.2 الهدف الغمر. في الشكل. 1 (الحمراء) نعرض distributioن من caveolae في البطين الكبار الكلاب العضلية التي تم إصلاحها وملطخة أجسام مضادة لcaveolin - 3 الذي هو كبيرة من البروتين caveolar الهيكلية في هذه الخلايا ^9. وكان immunolabelled Caveolin - 3 - 647 مع اليكسا ومتحمس مع خط 633 نانومتر من قال : ليزر ني. وسجلت الصور باستخدام فلتر LP650 الانبعاثات نانومتر. وتمت مقارنة توزيع caveolin - 3 إلى _ف Gα أن immunolabeled مع اليكسا - 488 (أخضر). لقد كان امرا مثيرا اليكسا - 488 مع خط 488nm الليزر أيون الأرجون وسجلت الصورة باستخدام BP505 - 530nm تصفية الانبعاثات. في هذه القياسات colocalization ، كانت متحمسة للfluorophores الاثنين بطريقة متسلسلة باستخدام موضوع اقتناء المسار. هذا الإجراء يقلل من القناة عبر الحديث. تم إجراء تحليل البيانات باستخدام برنامج لcolocalization خاصة مزودة زايس LSM510 التلوي. كما يمكن أن يرى ، وcolocalized البروتينات اثنين.

لتحديد كيفية اقتران بين caveolin - 3 وGα 2 + الخضراء. نحن متحمسون للصباغة مع ليزر أيون الأرجون 488nm وجمعت الصور من خلال تصفية الانبعاثات LP515. جمعت إطارات الصور على فترات مللي 500. تم استخراج قيم الكثافة لكل بكسل باستخدام البرمجيات وImageJ أوليمبوس. تم استخدام الخط لوضع الفحص التحليل الكمي من أسرع العابرين كا كا ² و ^{+ 2 +} الشرر. وكان حجم بكسل المستخدمة في الدراسة الحالية 0،1-0،3 ميكرون. كان معدل خط مسح حول عدة مئات من ميكروثانية في كل سطر. في الشكل. 2 نظهر مسح سطر من الكالسيوم ^{2 +} الخضراء محملة cardiomyocyte حيث د بكسلكان الوقت الزمني جيدا كان 2 ميكروثانية ، 142 ميكروثانية. وتتألف من 1200 صورة خطوط.

كل سطر من التفحص يتوافق مع تذبذب كثافة الكالسيوم ^{2 +} الخضراء تتكون من 71 نقطة استولت مجموعة ميكروثانية 142 ، ويمكن استخدامها بوصفها قراءة سريعة للرد على الكالسيوم. على سبيل المثال ، في الشكل. 3 نظهر كا ^{2 +} نشاط خط واحد من cardiomyocyte الفردية ، مقاسا كا ^{2 +} كثافة مضان الخضراء بوصفها وظيفة من الوقت في ثانية قبل (أعلى) وبعد (أسفل) إضافة كرباكول ميكرومتر (5) الذي يعزز مستوى الكالسيوم داخل الخلايا من خلال النشاط ^{2 +} _Q - PLCβ Gα. عندما بلغ متوسط ​​خطوط كثيرة ، والتحفيز كرباكول ينتج ~ 1،8 أضعاف الزيادة في كثافة الكالسيوم ^{2 +} الخضراء. نظرا لاختلاف الظروف التجريبية (درجة حرارة الغرفة ، وقوة الليزر ، والاستجابة للكشف عن والتوزيعات الصبغة ، الخ) ، لا يجوز أن ينظر إلى هذه الزيادة في الفرديخط بالاشعة. على الرغم من كثافة القيم (قيم محور ذ) متشابهة ، فمن الواضح أن المؤامرة كرباكول - حفزت على الجزء السفلي وقمم أوسع نطاقا بكثير ، المقابلة لمستويات الكالسيوم أكثر استدامة ، من قمم تقلبات ضيقة مثيلا من قبل التحفيز. هذا الارتفاع النسبي في توسيع وحدتها يحجب الصغيرة ، وأبطأ التذبذبات. هدفنا هو أفضل تميز بين أنواع مختلفة من هذه الظاهر تقلبات الكالسيوم.

ويرد مثال آخر على هذه التقلبات السريعة في الشكل الكالسيوم. 4. ويبين الرسم البياني أعلى خط البيانات الخام لالعضلية حفز البطين (الحمراء) ، ويظهر ما متوسطه 3 آثار خط باللون الأسود. لتحديد المدى الذي تم بوساطة هذه التقلبات الكالسيوم _ف Gα -- caveoline3 التفاعلات ، ونحن microinjected الببتيد أن يزعزع caveolin - 3 -- Gα التفاعلات _ف (أي Cav3 الببتيد) الذي يلغي يعد كا ^{2 +} الحالية ، وهذه البيانات تظهر باللون الأزرق(نلاحظ أننا طرح 500 من شدة الببتيد Cav3 بحيث يمكن لهما أن يتتبع يكون من الأفضل تمييزها).

استوردنا أعمدة البيانات الخام من ملفاتنا التفوق في Sigmaplot (Jandel ، وشركة) ، وأجرت تحليل الرسم البياني. في هذا التحليل ، يتم تجميع عدد من الأحداث في عدد متساو من الصناديق (صناديق) لإنتاج رسم بياني. عرض بن ليمثل الفاصل متساوية من الزمن. تندس في شدة زمنية مختلفة بحيث يربط ذروة بن معين يمثل عدد المرات التي يحدث كثافة في إطار وقت معين. لأن هذا النوع من التحليل يعتمد فقط على جمع البيانات على نفس معدل المسح ، يمكن تحليل آثار كثيرة في وقت واحد. بالإضافة إلى ذلك ، فإن هذا التحليل لا تراعي الاختلافات في مستويات صباغة ، الليزر السلطة ، وما إلى ذلك ، والضوضاء الإلكترونية والخلفية يحدث في فترات زمنية سريعة للغاية ، وتعتبر الوحيدة في صناديق 1-2 الأولى.

في المقابل histograمللي من البيانات الخام في الشكل. 4 تظهر في أسفل الصفحة. وتنتشر على الرسم البياني للخلايا السيطرة على عدد كبير من صناديق المقابلة لتوزيع الوقت واسع ، كما هو مبين من قبل الخط الأحمر (الخط هو لتوجيه العين ويفترض يوجد نموذج). في المقابل ، تنحصر في صناديق لاستجابة الخلايا حيث تعطلت _Q - Cav3 Gα التفاعل الببتيد إلى توزيع بن ضيقة مما يشير إلى أن وجود تدفقات الببتيد يلغي مدة أطول. Microinjection من الببتيد الرقابة التي لا تخل Gα _Q - Cav3 تنتج رسم بياني مشابه لبرنامج الأمم المتحدة للحقن الخلايا ^8.

في الشكل. 5 قارنا شدة التقلبات السريعة للكا ^{2 +} الخضراء في البالغين العضلية البطين الكلبي (يسار) والعذبة ، والعضلية الفئران التي تفتقر unstimulated الولدان caveolae (يمين). هنا ، واهمال للرسوم بيانية المقابلة من شدة لمدة 3 دقائق في 35 لعرض الأحداث أبطأ الكالسيوم. علما بأن حديثي الولادة العضلية عرض تقلبات سريعة على خط مستو تبين عدم وجود تباطؤ النشاط كا ^{2 +} في حين يعتبر خط أساس أكثر تنظيما للخلايا البالغين. هي الأكثر بسهولة ينظر إلى هذه الاختلافات في رسوم بيانية.

وقد سجلت الرقم 1. صور الكلاب العضلية البطين الكبار تبين توزيع _ف Gα immunolabeled مع اليكسا - 488 حيث كان متحمس اليكسا - 488 مع خط 488nm الليزر أيون الأرجون وصورة باستخدام BP505 - 530nm تصفية الانبعاثات. في أعلى يمين الصورة هو نفسه عرض توطين caveolin - 3 - immunolabeled مع اليكسا 647 ، متحمس مع خط 633 نانومتر وهو من : ني الليزر وتسجيلها باستخدام LP650 نانومتر تصفية الانبعاثات صورة المدمجة حيث ينظر في colocalization البرتقالي هو في أسفل يسار مع صورة موسعة لهذا الحق.

"pdflinebreak">

الشكل 2. التصوير الكالسيوم من الكلاب الكبار الذين يعيشون cardiomyocyte البطين محملة كا ^{2 +} الخضراء. لقد التقطت الصورة على نظام المسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهر مع الهدف 40X باستخدام أيون الأرجون 488nm الليزر وتصفية الانبعاثات LP515. وتتألف من 1200 صورة خطوط البكسل يسكن الوقت كان 2 ميكروثانية ، وكان حجم بكسل 0.1 ميكرون.

الشكل 3. التقلبات كثافة أعلى تتبع الخط من لقمة العيش الكلاب الكبار cardiomyocyte البطين محملة كا ^{2 +} الخضراء والتقط كما وصفها ، وأسفل الخلية نفسها التي حفزت إضافة كرباكول 5 ميكرومتر.

/ 3505fig4.jpg "/>
الشكل 4. TOP مثال خط من آثار العيش الكلاب الكبار cardiomyocyte البطين محملة كا ^{2 +} الخضراء (الحمراء) التي اتخذت أكثر من 180 مللي حيث يظهر متوسط ​​3 اثار كخط أسود ، وبالمقارنة مع الخلية التي تم microinjected مع الببتيد الذي يعطل Gα _Q - 3 caveolin الجمعيات (الحمراء) ، حيث ما معدله ثلاثة آثار في الأسود. ونحن نلاحظ أن تطرح تهم كثافة أقل من 400 مجموعة من البيانات لأغراض العرض. انخفاض رسوم بيانية لوحات هي المقابلة من اهمال البيانات كما هو موضح في النص ، وفيها عدد بن تعسفي والعد بن (أو الاعتماد ببساطة) يناظر المبلغ الإجمالي للكثافة في أن بن معين. نلاحظ أن خط خطوط حمراء وزرقاء رسمها في عنصر التحكم (يسار) ورسوم بيانية الببتيد (اليمين) للسماح لتسهيل تحديد والمقارنات للبيانات ويفترض أي نموذج.

files/ftp_upload/3505/3505fig5.jpg "/>
الشكل 5. التقلبات كثافة الكالسيوم ^{2 +} الخضراء تظهر في البالغين العضلية البطين الكلبي (يسار) والعذبة ، والعضلية الفئران التي تفتقر unstimulated الولدان caveolae (يمين) ورسوم بيانية يناظرها أدناه.

Discussion

طورنا طريقة لعرض وعزل إشارات الكالسيوم العضلية السريعة في الحي. بينما سبق لظروف تجريبية لهذه القياسات المطبقة على نظم خلية أخرى ¹⁰ فضلا عن ¹¹ العضلية ، واستخدام رسوم بيانية وتحليل البيانات من بن يسمح كا كثير من ² إلى الحصول عليها ⁺ الأحداث. يمكن أن يكون أسرع أحداث معزولة بسهولة من أبطأ تلك النماذج وتكييفها لفهم الآليات الكامنة وراءها. زراعة العضلية ، وكثير من خطوط الخلايا الأولية ، يمكن أن يكون صعبا. في حين يعتقد عموما أنه ينبغي أن تؤخذ القياسات بعد فترة وجيزة يتم الحصول على الخلايا ، وجدنا أن العضلية نحن الكبار الكلاب المستخدمة في هذه الدراسة تبدأ فقط لانقاص وخصائصها محددة بعد 3 أيام. هذا الإطار يعد الوقت يسمح لخلايا نعلق بحزم إلى الركيزة تأمين أن الخلايا قادرة على البقاء العلاجات يمكن أن تكون مميتة مثل microinjection. شركة مرفق أمر بالغ الأهميةلنجاح microinjection.

علينا التحقق من دور الجمعيات Gα 3 _Q - caveolin في تدفقات الكالسيوم microinjecting الببتيد الذي يعطل تفاعلها. نود أن نؤكد أنه يجب القيام microinjection مع عناية كبيرة للحد من الاضرار الخلية وتسرب محتويات الخلوية. ومع ذلك ، يجب أن يكون متوازنا هذه المخاطر عن طريق استخدام الإبر قطرها أكبر أن هناك حاجة لتوفير كمية كافية من المواد الى العضلية كبيرة نسبيا. إدراج صبغة مثل دابي ان يسمح احد لتتبع الخلايا التي تم microinjection هو المهم. كما ذكرنا ، من المهم أن لmyocytes microinjection واستحم في الكالسيوم الحرة والمتوسطة أن الحلول حقن أيضا خالية من الكالسيوم. تدفق الكالسيوم خارج الخلية يبدأ تقلصات والموت اللاحقة من الخلايا

القياسات ويمكن تكييف أنفسهم لأنواع الخلايا الأخرى ، والأصباغ والليزر مبائرنظم لمتابعة أحداث أخرى مثل خلية السريع trisphospate 1،4،5 insoitol وتدفقات cAMP ، وعلى الرغم من أن الكالسيوم ^{2 +} التدفقات هي بالتأكيد واحدة من أعقد رسل الخلوية. وينبغي للمرء أن يكون حذرا في اختيار المؤشرات الفلورسنت التي لا photobleached بسهولة والحصول على رد قوي وديناميكي مضان بحيث يمكن استخدام الليزر منخفض ان القوى. وانخفاض قوة الليزر أيضا تجنب التدفئة المحلية التي يمكن أن تؤدي إلى آثار الخلوية غير المرغوب فيها.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	ABCD1234