Mesurer les flux de calcium dans les cardiomyocytes rapide

Summary

Nous présentons une méthode pour isoler rapidement des événements de calcium (microseconde) à partir des flux plus lent dans les cellules vivantes en utilisant microscopie confocale à balayage laser. La méthode de mesures des fluctuations d'intensité de fluorescence des indicateurs de calcium par les analyses en ligne l'enregistrement de plusieurs centaines de pixels dans une cellule. Analyse de l'histogramme nous permet d'isoler les échelles de temps des différents flux de calcium.

Abstract

Cardiomyocytes ont de multiples flux de Ca ^{2 +} d'une durée variable qui travaillent ensemble pour optimiser ^1,2 fonction. Les changements dans l'activité Ca ^{2 +} dans la réponse aux agents extracellulaire est principalement régulée par la phospholipase Cß-Ga voie _Q localisés sur la membrane plasmique qui est stimulée par des agents tels que l'acétylcholine ^3,4. Nous avons récemment constaté que les domaines plasmatique protéine membranaire appelée cavéoles ^5,6 Ga peut piéger activé _q ^7. Ce piège a pour effet de stabiliser l'état activé de Ga _q et entraînant prolongée de Ca ^{2 +} dans les cardiomyocytes des signaux et des autres types de cellules ^8. Nous avons découvert ce résultat surprenant en mesurant les réponses de calcium dynamique à l'échelle rapide dans les cardiomyocytes de vie. Brièvement, les cellules sont chargées avec une lampe fluorescente de Ca ^{2 +} indicateur. Dans nos études, nous avons utilisé Ca ^{2 +} Vert (Invitrogen, enc.) qui présente une augmentation de l'intensité d'émission de fluorescence lors de la liaison des ions calcium. L'intensité de fluorescence est ensuite enregistré pour utiliser un mode de balayage ligne d'un microscope confocal à balayage laser. Cette méthode permet l'acquisition rapide de l'évolution temporelle de l'intensité de fluorescence en pixels le long d'une ligne sélectionnée, produire plusieurs centaines de traces du temps sur l'échelle de la microseconde. Ces traces sont très vite transférés dans Excel, puis dans Sigmaplot pour l'analyse, et sont comparés à des traces obtenues pour le bruit électronique, sans colorant, et d'autres contrôles. Pour disséquer Ca ^{2 +} réponses des débits différents, nous avons effectué une analyse de l'histogramme qui binned intensités des pixels avec le temps. Binning nous permet de regrouper plus de 500 traces de scans et de visualiser les résultats compilés spatialement et temporellement sur une même parcelle. Ainsi, les ondes lentes Ca ^{+ 2} qui sont difficiles à discerner quand les scans sont superposées due au placement de pointe différentes et le bruit, peut être facilement vu dansles histogrammes binned. Flux très rapide dans l'échelle de temps de la mesure montrent une distribution étroite des intensités dans les bacs très peu de temps alors que les plus vagues Ca ^{2 +} montrent des données mis en cellule avec une large distribution au cours des bacs de temps plus long. Ces distributions de temps différentes nous permettent de disséquer le calendrier de flux de Ca ^{2 +} dans les cellules, et de déterminer leur impact sur ​​les différents événements cellulaires.

Protocol

1. Cellules de chargement avec des indicateurs de calcium

1. Cellules de la plaque en 35mm plats en verre MatTek bas (ou tout autre visionnement à fond de verre chambres).
2. Si vous utilisez primaires manteau de myocytes les chambres 1 jour avant avec 10μg/ml laminine. Myocytes cardiaques Plate (isolé de chiens adultes, les rats nouveau-nés, ou autre organisme) en Ko de tampon (buffer Tyrode K-retournement 35 mmol / L de HEPES, 140 mmol / L de KCl, 8 mmol / L de _KHCO3, 2 mmol / L de MgCl ₂ et 0,4 mmol / L de KH ₂ PO _4, pH 7,5) et le changer progressivement milieu M199 supplémenté avec 15% de sérum bovin fœtal et streptamycin 1% et la gentamicine 0,5% et incuber à 37 ° C dans 5% CO _2.
3. Incuber les cellules avec du calcium verte AM (1-5 uM; Molecular Probes) ou tout autre indicateur de calcium désirée pendant 30-45 min à température ambiante. Couvrir le plat avec du papier aluminium pour éviter de photoblanchiment du colorant.
4. Laver les cellules trois fois avec Leibovitz15 moyenne avec 14mm EGTA (Si la réalisation d'expériences en calcium faible) ou tout autre support d'affichage appropriée.
5. Incuber pendant 30-45 minutes dans une autre Leibovitz15 moyennes containing14mM EGTA.
6. Si les tests des effets des inhibiteurs (c'est à dire 10 uM U73122 PLC inhibiteur) les ajouter lors de la seconde incubation.

2. Cellules micro-injection

1. Cardiomyocytes culture dans des boîtes en verre MatTek bas (ou d'autres chambres de visualisation) pour 24h.
2. Changer le support en phénol libre Leibovitz-15 avec 14 mM d'EGTA (cardiomyocytes doivent être injectés dans le milieu sans calcium, d'autres cellules peuvent être injectées en calcium contenant du milieu).
3. Préparer une solution de micro-injection - nos études a utilisé un peptide qui élimine Ga _Q - interactions cavéoles. Gardez à l'esprit que seule une petite quantité de volume est injecté dans la cellule (~ fL) et si les stocks de concentrés raisonnable doit être utilisé. Nous avons utilisé 2 uM de ce peptide, CAV3-échafaudage, avec DAPI dans un milieu sans calcium. DAPI est un blue de teinture qui colore le noyau et permet l'identification des cellules qui ont été microinjectés. DAPI n'interfère pas avec la fluorescence des indicateurs de calcium nombreuses. Le montant de DAPI est variable et nous utilisons généralement assez pour visualiser le noyau (0,5 et 2 M)
4. Préparer la solution de contrôle contenant du DAPI - le traceur colorant seul.
5. Pour microinjections utiliser des aiguilles auto-tiré ou disponibles commercialement. Pratique avec l'injection de colorant pour déterminer les paramètres à aiguille appropriée. Nous notons que les différentes cellules peuvent exiger diamètres d'aiguilles et des pressions différentes de micro-injection.
6. Utilisez le système de microinjection automatisé, par exemple une NI2 InjectMan avec une pompe FemtoJet d'Eppendorf. Régler la pression d'injection P _i à 90 hPa et la compensation de pression P _C à 45 hPa. Réglez le temps t d'injection à 0,7 s. Réajuster les paramètres de l'injection au besoin.
7. Effectuer microinjections sur un microscope inversé (par exemple Zeiss Axiovert 200M) équipé d'objectif à long distance de contraste de phase de travail (par exemple la phase de l'air 40x objectif 2).
8. Injecter autant de cellules que possible d'une manière rapide. Examiner les cellules injectées en utilisant le contraste de phase pour sélectionner les cellules viables.

3. Co-immunofluorescence d'études

1. Laver les cellules deux fois avec du PBS et fixer avec du paraformaldéhyde à 3,7% pendant 30 minutes. Si nécessaire, les cellules peuvent être stimulées avant la fixation.
2. Laver les cellules fixes trois fois avec PBS, et incuber avec 0,2% de NP40 dans du PBS pendant 5 minutes.
3. Bloc à l'aide du PBS contenant du sérum de chèvre 4% (ou autre sérum approprié) pour 1 heure.
4. Incuber les cellules avec des anticorps primaires à la dilution appropriée avec du sérum de chèvre 1% dans du PBS pendant 1 heure.
5. Laver les cellules trois fois pendant 10 minutes avec 150 mM de NaCl, 25 mM Tris, pH 7,6 suivie par l'addition des fluorescents anticorps secondaire marqué, comme Alexa-Fluor-488 anti-lapin ou Alexa-Fluor-647 anticorps anti-souris dilué secondaires à 1: 1000 1% du sérum de chèvre dans du PBS (à noter que lors de palpage pour deux protéines différentes les anticorps primaires doivent être soulevées dans les différentes espèces et le secondaire doit être contre les espèces correspondantes).
6. Incuber à 37 ° C pendant 1 heure, laver trois fois avec le SCT.
7. Voir les cellules dans du tampon TBS ou tout autre support d'affichage appropriée.

4. Imagerie calcique rapide

1. Utilisez microscope confocal à balayage laser (par exemple Fluoview 1000 Olympus).
2. Utilisez haute objectif d'ouverture numérique.
3. Régler les paramètres d'acquisition. Pour utiliser le calcium nm d'excitation verte 488 et 515 passent à long filtres d'émission.
4. Réglez le temps de pixels - pour les mesures de calcium vitesse elle fixée à 2 ms / pixel.
5. Réglez le zoom de l'image pour atteindre la taille de pixel de 0,05 à 0,3 um.
6. Sélectionnez une ligne dans une cellule de choix dans une région particulière.
7. Dans la fenêtre du contrôleur de sélectionner le temps d'acquisition de temps d'au moins 1500 pages (pour obtenir désirée délai dela réponse - 1,3 ms / ligne rapporterait 2 secondes).
8. Enregistrement de fond la lecture avant la stimulation.
9. Stimuler les cellules avec 5 uM de carbachol et commencez immédiatement à enregistrer des données. Gardez les cellules dans 1 ml de Leibovitz15 moyen, préparer 10 uM dans le carbachol Leibovitz15 et ajouter délicatement 1 mL dans le plat

5. L'analyse des données

1. Extraire les intensités pour chaque pixel de l'image enregistrée. Sauvegarder les données d'intensité comme un tableau en utilisant le logiciel Fluoview 1000.
2. Importer des données d'intensité dans les Sigmaplot ou un programme d'analyse des données similaires et ben les données dans ~ 90-40 bacs. Comparer à des expériences de contrôle et de bruit électronique.

6. Les résultats représentatifs:

Nous imagé cellules sur microscope confocal à balayage laser LSM510 (Zeiss, Jena, Allemagne) équipé d'une excitation laser multi-ligne et un 40x/1.2 Apochromat NA objectif à immersion d'eau. Dans la Fig. 1 (rouge), nous montrent la répartition du pouvoirn des cavéoles dans les cardiomyocytes ventriculaires canins adultes qui ont été fixées et colorées avec un anticorps dirigé contre la cavéoline-3 qui est la principale protéine structurale caveolar dans ces ⁹ cellules. Cavéoline-3 a été immunomarquées avec Alexa-647 et excité à la ligne 633-nm à partir d'un He: Ne laser. Les images ont été enregistrées à l'aide LP650 filtre d'émission nm. La distribution de la cavéoline-3 a été comparé à Ga _q qui a été immunomarquées avec Alexa-488 (vert). Alexa-488 a été excité à 488nm argon-ion de ligne laser et l'image a été enregistrée en utilisant un filtre d'émission BP505-530nm. Dans ces mesures colocalisation, les deux fluorophores sont excités de façon séquentielle à l'aide d'acquisition multi-pistes. Cette procédure minimise la diaphonie de canal. L'analyse des données pour la colocalisation a été réalisée en utilisant le logiciel fourni avec AIM Zeiss LSM510-Meta. Comme on peut le constater, les deux protéines sont colocalisés.

Pour déterminer comment le couplage entre la cavéoline-3 et Ga 2 + vert. Nous excités du colorant avec un laser 488nm Argon ion et recueilli des images à travers un filtre d'émission LP515. Cadres d'image ont été prélevés à intervalles de 500 ms. Les valeurs d'intensité de chaque pixel ont été extraites à l'aide de logiciels et Olympus ImageJ. Le mode de balayage de ligne a été utilisé pour l'analyse quantitative de la plus rapide de Ca ^{2 +} transitoires et Ca ^{2 +} des étincelles. La taille du pixel utilisé dans la présente étude était de 0.1 à 0.3 um. Le taux de balayage ligne est d'environ plusieurs centaines de ms par ligne. Dans la Fig. 2, nous montrent une ligne de balayage d'une Ca ^{2 +} Green-chargés cardiomyocytes où le pixel dtemps bien est de 2 ms, le temps de la ligne était de 142 ms. L'image est composée de 1200 lignes.

Chaque ligne de l'analyse correspond à la fluctuation d'intensité de Ca ^{2 +} vert composé de 71 points pris sur une plage de 142 ms, et peut être utilisé comme une rapide lecture des réponses de calcium. Par exemple, dans la Fig. 3 nous montrons le Ca ^{2 +} activité d'une seule ligne d'un cardiomyocyte individuelles, telle que mesurée par l'intensité de Ca ^{2 +} verte fluorescence en fonction du temps en secondes avant (haut) et après (en bas) l'addition de 5 uM de carbachol qui améliore le niveau intracellulaire de Ca ^{2 +} par le biais _Ga-q PLCβ activité. Lorsque plusieurs lignes sont en moyenne, la stimulation carbachol produit une augmentation d'un facteur ~ 1,8 en Ca ^{2 +} intensité de vert. En raison de variations dans les conditions expérimentales (température ambiante, la puissance du laser, la réponse du détecteur, les distributions de teinture, etc), cette augmentation ne peut être vu dans les différentsscans en ligne. Même si les valeurs d'intensité (valeurs de l'axe Y) sont similaires, il est clair que l'intrigue carbachol stimulé sur le fond a des pics beaucoup plus large, correspondant à des niveaux de calcium plus soutenue, que les pics de fluctuation étroite vu avant la stimulation. Cette hausse élargissement et relative de l'intensité obscurcit petits, des oscillations plus lentes. Notre objectif est de mieux discriminer entre ces différents types de fluctuations apparentes de calcium.

Un autre exemple de ces variations de calcium rapide est montré dans la Fig. 4. Le graphique supérieur montre la ligne de données brutes pour les cardiomyocytes ventriculaires stimulés (rouge) et une moyenne de 3 traces de ligne est affiché en noir. Pour déterminer l'ampleur que ces fluctuations de calcium ont été médiée par Ga _Q - caveoline3 interactions, nous microinjectés un peptide qui déstabilise la cavéoline-3 - Ga interactions _q (ie CAV3 peptide) qui élimine le plus de Ca ^{2 +} en cours et ces données sont indiquées en bleu(Nous notons que nous avons soustrait 500 de la CAV3 intensités peptide sorte que les deux traces peuvent être mieux discerner).

Nous avons importé les colonnes de données brutes de nos fichiers Excel dans Sigmaplot (Jandel, Inc) et a effectué une analyse de l'histogramme. Dans cette analyse, le nombre d'événements sont regroupés en un nombre égal de cases (poubelles) pour produire un histogramme. La largeur du bin représente un intervalle de temps égaux. Les intensités sont insérés dans le temps différentes lie sorte que la hauteur d'un bac particulier représente le nombre de fois que l'intensité se produit dans la fenêtre de temps particulier. Puisque ce type d'analyse ne dépend que de la collecte de données à la vitesse de balayage la même, de nombreuses traces peuvent être analysés simultanément. De plus, cette analyse n'est pas sensible aux différences de niveaux de colorant, la puissance du laser, etc, et le bruit de fond électronique et se produit à des échelles de temps très rapide et ne sont visibles dans les 1-2 premières poubelles.

Le histogra correspondantsms des données brutes dans la Fig. 4 sont représentés sur le bas de la page. L'histogramme des cellules de contrôle sont répartis sur un grand nombre de bacs correspondant à une distribution de temps large, telle que représentée par la ligne rouge (la ligne est de guider l'œil et aucun modèle est supposé). En revanche, les bacs pour la réponse des cellules où la _Ga-q CAV3 l'interaction a été perturbé par le peptide sont confinés à une distribution étroite bin suggérant que la présence du peptide élimine les flux plus longue durée. Microinjection d'un peptide de contrôle qui ne perturbe pas _Ga-q CAV3 produit un histogramme similaire à ONU-ont injecté des cellules ^8.

Dans la Fig. 5 nous comparons les fluctuations d'intensité rapide de Ca ^{2 +} verte chez les adultes cardiomyocytes ventriculaires canins (à gauche) et frais, des cardiomyocytes de rat stimulées néonatale que le manque cavéoles (à droite). Ici, les histogrammes correspondants des intensités sur une période de trois minutes ont été supprimés à 35 pour afficher les événements de calcium lent. Notez que les cardiomyocytes néonataux d'affichage des fluctuations rapides sur une base plane montrant le manque de ralentissement de l'activité Ca ^{2 +} alors une base plus structurée est observée pour les cellules adultes. Ces différences sont plus facilement visibles dans les histogrammes.

Images Figure 1. Canines des cardiomyocytes ventriculaires adulte montrant la répartition des Ga _q immunomarquées avec Alexa-488, où Alexa-488 a été excité à 488nm argon-ion de ligne laser et l'image a été enregistrée en utilisant un filtre d'émission BP505-530nm. Le haut à droite est l'image même visualisation de la localisation des cavéoline-3 immunomarquées avec Alexa-647, excités par la ligne 633-nm à partir d'un Lui:. Ne laser et d'émissions enregistrées à l'aide LP650 nm filtre L'image fusionnée où colocalisation est vu dans l'orange est en bas à gauche avec une image élargie à la droite.

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Figure 2. Imagerie calcium d'un adulte vivant cardiomyocytes ventriculaires canins chargée de Ca ^{2 +} vert. L'image a été prise sur un système de microscope confocal à balayage laser avec un objectif 40x en utilisant un laser à ions argon 488nm et un filtre d'émission LP515. L'image est composée de 1200 lignes, le pixel est temps de maintien 2 ms, et la taille du pixel était de 0,1 um.

Figure 3. Fluctuations d'intensité TOP d'une trace de la ligne à partir d'un adulte vivant cardiomyocytes ventriculaires canins chargée de Ca ^{2 +} Green et imagé comme décrit, et BOTTOM la même cellule stimulée par l'addition de 5 uM de carbachol.

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Figure 4. TOP Un exemple de traces ligne d'un adulte vivant cardiomyocytes ventriculaires canins chargée de Ca ^{2 +} vert (rouge) pris plus de 180 ms, où la moyenne des trois traces est présenté comme une ligne noire, et comparé à une cellule qui a été microinjectés avec un peptide qui perturbe Ga _Q-cavéoline 3 association (rouge), où une moyenne de trois traces est en noir. Nous notons que nous avons soustrait 400 points d'intensité de l'ensemble inférieur de données à des fins de visualisation. Les panneaux inférieurs sont les histogrammes correspondants des données mis en cellule comme décrit dans le texte, et où le nombre est arbitraire et ben le nombre de bin (ou simplement compter) correspond à la quantité totale de l'intensité dans cette poubelle particulière. Nous notons que les lignes de la ligne rouge et bleu dessiné dans le contrôle (à gauche) et le peptide (à droite) sont des histogrammes pour permettre une identification plus facile et les comparaisons des données et pas de modèle est supposé.

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Figure 5. Fluctuations d'intensité de Ca ^{2 +} verte chez les adultes cardiomyocytes ventriculaires canins (à gauche) et frais, des cardiomyocytes de rat stimulées néonatale que le manque cavéoles (à droite) et leurs histogrammes correspondants sont présentés ci-dessous.

Discussion

Nous avons développé une méthode pour afficher et d'isoler les signaux calciques dans les cardiomyocytes rapide vivants. Alors que les conditions expérimentales de ces mesures ont déjà été appliquée à des systèmes cellulaires ¹⁰ autres ainsi que des cardiomyocytes ^11, l'utilisation d'histogrammes et de l'analyse permet bin données provenant de nombreuses Ca ^{2 +} des événements devant être acquis. Plus rapide des événements peut être facilement isolé du plus lents et des modèles adaptés pour comprendre leurs mécanismes sous-jacents. Cardiomyocytes en culture, que de nombreuses lignées cellulaires primaires, peut être difficile. Bien qu'il soit généralement admis que les mesures doivent être prises rapidement après que les cellules sont acquises, nous avons constaté que les cardiomyocytes adultes canines, nous avons utilisé dans cette étude ne commencent à perdre leurs propriétés spécifiques, après 3 jours. Ce délai plus long permet aux cellules de fixer solidement sur le substrat assurant que les cellules survivent traitements potentiellement mortelles telles que la microinjection. Ferme attachement est essentielpour le succès de la micro-injection.

Nous avons vérifié le rôle de la _Ga-q cavéoline 3 association dans les flux de calcium par micro-injection d'un peptide qui perturbe leur interaction. Nous tenons à souligner que la micro-injection doit être faite avec grand soin afin de minimiser endommager les cellules et la fuite du contenu cellulaire. Cependant, ces risques doivent être équilibrées par l'utilisation d'aiguilles de plus grand diamètre qui sont nécessaires pour fournir une quantité suffisante de matériau dans les cardiomyocytes relativement importante. L'inclusion d'un colorant tel que le DAPI qui permet de suivre les cellules ont été microinjection est important. Comme mentionné, il est important que pour les myocytes microinjection sont baignés dans un milieu sans calcium et que les solutions injectées est également libre de calcium. Afflux de calcium extracellulaire initie les contractions et la mort subséquente de cellules

Les mesures elles-mêmes peuvent être adaptés à d'autres types cellulaires, les colorants et laser confocalesystèmes pour suivre d'autres événements tels que cellulaire rapide insoitol 1,4,5 trisphospate et les flux de l'AMPc, bien que les ^deux flux de Ca ⁺ sont certainement l'un des messagers les plus complexes cellulaires. Il faut être prudent sur le choix des indicateurs fluorescents qui ne sont pas facilement photobleached et avoir une réponse solide et dynamique de fluorescence de telle sorte que des puissances laser faible peut être utilisée. Faible puissance du laser sera également éviter un échauffement local qui pourrait donner lieu à des effets indésirables cellulaire.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	ABCD1234