Fluxos de medição de cálcio rápido no Cardiomyocytes

Summary

Nós apresentamos um método para isolar rápido eventos (microssegundo) cálcio dos fluxos mais lento em células vivas usando laser microscopia confocal. O método mede as flutuações de intensidade de fluorescência de indicadores de cálcio através dos exames de gravação de linha de várias centenas de pixels em uma célula. Análise de histograma nos permite isolar as escalas de tempo de fluxos de cálcio diferentes.

Abstract

Cardiomiócitos ter vários fluxos de Ca ^{2 +} de duração variável que trabalham em conjunto para otimizar ^1,2 função. Mudanças na atividade Ca ^{2 +} em resposta a agentes extracelular é normalmente regulada pela fosfolipase caminho _q Cβ-Gα localizada na membrana plasmática, que é estimulado por agentes como a acetilcolina ^3,4. Nós temos encontrado recentemente que os domínios membrana plasmática proteína chamada cavéolas ^5,6 pode prender ativado Gα _q ^7. Esta armadilha tem o efeito de estabilizar o estado de ativação de Gα _q e resultando em prolongada Ca ^{2 +} sinais em cardiomiócitos e outros tipos de células ^8. Descobrimos este resultado surpreendente, medindo as respostas dinâmicas de cálcio em uma escala rápida em cardiomiócitos vida. Resumidamente, as células são carregados com uma fluorescente indicador Ca ^{+ 2.} Em nossos estudos, utilizamos Ca ^{2 +} Verde (Invitrogen, Inc.), que apresenta um aumento na intensidade de emissão de fluorescência mediante ligação de íons de cálcio. A intensidade de fluorescência é então gravado para usar um modo de linha de varredura de um microscópio confocal de varredura a laser. Este método permite a aquisição rápida do curso de tempo da intensidade de fluorescência em pixels ao longo de uma linha selecionada, produzindo centenas de vestígios do tempo na escala de tempo de microsegundos. Esses traços muito rápidos são transferidos para excel e depois em SigmaPlot para análise, e são comparados aos vestígios obtidos para ruído eletrônico, corante livre, e outros controles. Para dissecar Ca ^{2 +} respostas das taxas de fluxo diferentes, foi realizada uma análise de histograma que binned intensidades de pixels com o tempo. Binning permite-nos agrupar mais de 500 rastros de scans e visualizar os resultados compilados espacial e temporalmente em uma única parcela. Assim, a lenta Ca ^{2 +} ondas que são difíceis de discernir quando os exames são sobrepostas, devido à colocação de pico diferente e ruído, pode ser facilmente visto emos histogramas binned. Fluxos muito rápido na escala de tempo da medição mostram uma estreita distribuição de intensidades nas caixas de tempo muito curto enquanto Ca ^{2 +} mais ondas de mostrar dados binned com uma ampla distribuição ao longo escaninhos mais tempo. Essas distribuições de tempo diferentes nos permitem dissecar o momento de Ca ^{2 +} fluxos nas células, e para determinar o seu impacto em vários eventos celulares.

Protocol

1. Células de carga com indicadores de cálcio

1. Células da placa de vidro em 35mm pratos fundo Mattek (ou qualquer outro fundo de vidro visualização câmaras).
2. Se estiver usando casaco de miócitos primário das câmaras de um dia antes com 10μg/ml laminina. Miócitos cardíacos placa (isoladas de cães adultos, ratos neonatal, ou outro organismo) em KB de buffer (K-reversão tampão Tyrode 35 mmol / L de HEPES, 140 mmol / L de KCl, 8 mmol / L de KHCO _3, 2 mmol / L de MgCl ₂ e 0,4 mmol / L de KH ₂ PO _4, pH 7,5) e alterá-lo gradualmente a M199 meio suplementado com 15% de soro fetal bovino e 1% streptamycin e gentamicina 0,5% e incubar a 37 ° C em 5% CO _2.
3. Incubar as células com cálcio verde AM (1-5 mM; Molecular Probes) ou qualquer outro indicador de cálcio desejado por 30-45 min em temperatura ambiente. Cubra o prato com papel alumínio para evitar a fotodegradação do corante.
4. Lave as células três vezes com Leibovitz15 médio com 14mm EGTA (se a realização de experimentos em cálcio) ou qualquer outra mídia de visualização apropriada.
5. Incubar por mais 30-45 minutos em média Leibovitz15 containing14mM EGTA.
6. Se o teste efeitos de inibidores (ie 10μM U73122 PLC inibidor) adicioná-los durante a segunda incubação.

2. Células Microinjecting

1. Cardiomiócitos de cultura em placas de vidro de fundo Mattek (ou outras câmaras de visualização) para 24h.
2. Mudança a médio e livre de fenol Leibovitz-15 com 14 mM EGTA (cardiomiócitos tem que ser injetado em cálcio meio livre, outras células podem ser injetadas em cálcio contendo meio).
3. Preparar a solução microinjeção - nossos estudos usaram um peptídeo que elimina Gα _q - interações cavéolas. Tenha em mente que apenas uma pequena quantidade de volume é injetado na célula (~ fL) e assim por ações razoavelmente concentrada deve ser usado. Usamos 2 mM desse peptídeo, Cav3-scaffold, com DAPI em cálcio meio livre. DAPI é um blue que tinge o núcleo e permite a identificação de células que foram microinjeção. DAPI não interfere com a fluorescência dos indicadores de cálcio muitos. A quantidade de DAPI é variável e geralmente usamos o suficiente para visualizar o núcleo (0,5 e 2 mM)
4. Preparar a solução controle contendo DAPI - o traçador corante sozinho.
5. Microinjeções de usar agulhas auto-puxado ou disponíveis comercialmente. Prática com injeção de corante para determinar parâmetros de agulha apropriada. Notamos que diferentes células pode exigir diâmetros diferentes da agulha e pressões microinjeção.
6. Usar o sistema de microinjeção automatizado, por exemplo, um NI2 InjectMan com uma bomba FemtoJet de Eppendorf. Definir a injeção de pressão P _i a 90 hPa, ea compensação de pressão P _c a 45 hPa. Defina o tempo de injeção t para 0,7 s. Reajustar os parâmetros de injeção conforme a necessidade.
7. Executar microinjeções em um microscópio invertido (Zeiss por exemplo Axiovert 200M) equipado com longa distância trabalhando objetivo de contraste de fase (por exemplo, fase do ar 40x objectivo 2).
8. Injetar as células maior número possível de forma rápida. Examine células injetadas com o contraste de fase para selecionar células viáveis.

3. Co-imunofluorescência estudos

1. Lave as células duas vezes com PBS e corrigir com paraformaldeído 3,7% por 30 minutos. Se necessário, as células podem ser estimulada antes da fixação.
2. Lave as células fixas três vezes com PBS e incubar com 0,2% NP40 em PBS por 5 minutos.
3. Bloco utilizando PBS contendo soro de cabra 4% (ou soro apropriado outros) para uma hora.
4. Incubar as células com o anticorpo primário na diluição adequada com soro de cabra 1% em PBS por 1 hora.
5. Lave as células três vezes durante 10 minutos com 150 mM NaCl, 25 mM Tris, pH 7,6 seguido por adição de anticorpo marcado fluorescente-secundários, tais como Alexa-Fluor-488 anti-coelho ou Alexa-Fluor-647 anti-rato anticorpo secundário diluído a 1: 1000 1 soro de cabra% em PBS (note que quando o teste para duas proteínas diferentes os anticorpos primários devem ser levantadas em diferentes espécies e do secundário devem ser contra a espécie correspondente).
6. Incubar a 37 ° C por 1 hora, lavar três vezes com TBS.
7. Ver células em tampão TBS ou outro meio de visualização apropriada.

4. Imagem de cálcio rápido

1. Use de varredura a laser microscópio confocal (por exemplo FluoView 1000 Olympus).
2. Use objetivo alta abertura numérica.
3. Definir os parâmetros de aquisição. Para a excitação de cálcio verde nm use 488 e 515 filtros de passar muito tempo de emissão.
4. Ajustar o tempo de pixel - para medições rápidas de cálcio configurá-lo para a 2 microsiemens / pixel.
5. Definir o zoom da imagem para obter tamanho de pixel de ,05-0,3 mM.
6. Selecione uma linha de uma célula de escolha em uma determinada região.
7. Na janela de controlador de tempo de aquisição de tempo para selecionar pelo menos 1.500 exames (para obter desejado prazo dea resposta - 1.3 ms / linha renderia 2 segundos).
8. Fundo registre a leitura antes da estimulação.
9. Estimulam as células com 5 mM carbacol e imediatamente começar a gravação de dados. Manter as células em 1 ml de Leibovitz15 médio, prepare carbacol 10 mM em Leibovitz15 e adicione delicadamente mL 1 para o prato

5. A análise dos dados

1. Extrair as intensidades para cada pixel da imagem gravada. Guardar os dados de intensidade como uma tabela utilizando software FluoView 1000.
2. Importar dados de intensidade em SigmaPlot ou um programa de análise de dados e similares bin os dados em ~ 90-40 caixas. Compare para controlar experimentos e ruídos eletrônicos.

6. Resultados representativos:

Nós imaged células em microscópio confocal de varredura a laser LSM510 (Zeiss, Jena, Alemanha) equipado com várias linhas de excitação laser e um 40x/1.2 Apochromat NA objetivo imersão em água. Na fig. 1 (vermelha), mostramos a repartição don da cavéolas em cardiomiócitos adultos canina ventricular que foram fixados e corados com um anticorpo para caveolina-3, que é a proteína estrutural importante, caveolar nestes ^nove células. Caveolina-3 foi immunolabelled com Alexa-647 e animado com a linha 633-nm de uma Ele: laser Ne. As imagens foram gravadas usando LP650 filtro de emissão nm. A distribuição de caveolina-3 foi comparada com a que foi Gα _q immunolabeled com Alexa-488 (verde). Alexa-488 estava animado com a linha 488nm do laser Argon-ion ea imagem foi gravado utilizando filtro de 530nm de emissão BP505-. Nessas medidas co-localização, os dois fluoróforos foram animado de forma seqüencial usando aquisição de várias faixas. Este procedimento minimiza o canal de cross-talk. Análise de dados para co-localização foi realizada usando o software fornecido com AIM Zeiss LSM510 Meta. Como pode ser visto, as duas proteínas são colocalized.

Para determinar como o acoplamento entre caveolina-3 e Gα 2 + Verde. Nós animado o corante com um laser de íon argônio 488nm e recolheu imagens através de um filtro de emissão LP515. Quadros de imagem foram coletadas em intervalos de 500 ms. Valores de intensidade para cada pixel foram extraídas com software Olympus e ImageJ. O modo de varredura de linha foi utilizado para análise quantitativa de mais rápido Ca ^{2 +} transientes e Ca ^{2 +} faíscas. O tamanho do pixel utilizado no presente estudo foi 0,1-0,3 mM. A taxa de linha de varredura, foi cerca de várias centenas de mS por linha. Na fig. 2, mostramos uma varredura de uma linha de Ca ^{2 +} cardiomiócitos Green-carregados onde o pixel dtempo bem foi a 2 microsiemens, o tempo foi de 142 mS line. A imagem é composta de 1200 linhas.

Cada linha do scan corresponde à flutuação de intensidade de Ca ^{2 +} Verde consistindo de 71 pontos tomados em uma faixa de 142 mS, e pode ser usado como uma rápida leitura para fora para respostas de cálcio. Por exemplo, na fig. 3 mostramos o Ca ^{2 +} atividade de uma única linha de um cardiomiócito individual, medida pelo Ca ^{2 +} intensidade de fluorescência verde em função do tempo em segundos antes (em cima) e depois (inferior) a adição de 5 mM carbacol que aumenta o nível de Ca ^{2 +} intracelular através Gα atividade _q-PLCβ. Quando muitas linhas são em média, a estimulação carbacol produz um aumento de ~ 1,8 vezes na Ca ^{2 +} intensidade Green. Devido a variações nas condições experimentais (temperatura ambiente, a energia laser, detector de resposta, as distribuições de corantes, etc), este aumento não pode ser visto em cadascans linha. Mesmo que os valores de intensidade (valores do eixo y) são semelhantes, é claro que o enredo carbacol estimulada no fundo tem picos muito mais amplo, correspondendo a níveis de cálcio mais sustentado, do que os picos de flutuação estreita visto antes estimulação. Este aumento relativo na ampliação e intensidade obscurece pequeno, oscilações mais lentas. Nosso objetivo é melhor discriminar entre estes diferentes tipos aparente de flutuações de cálcio.

Outro exemplo destas flutuações de cálcio rápido é mostrado na figura. 4. O gráfico de cima mostra os dados de linha-prima para cardiomiócitos do ventrículo estimulado (vermelho) e uma média de 3 traços linha é mostrado em preto. Para determinar a medida em que essas flutuações de cálcio foram mediadas por Gα _q - caveoline3 interações, nós microinjeção um peptídeo que desestabiliza caveolina-3 - interações Gα _q (ie peptídeos Cav3) que elimina a mais Ca ^{2 +} atual e esses dados são mostrados em azul(Nota-se que nós subtraídos 500 da Cav3 intensidades peptídeo para que os dois traços pode ser melhor percebido).

Importamos as colunas de dados brutos de nossos arquivos excel em SigmaPlot (Jandel, Inc.) e realizou uma análise de histogramas. Nesta análise, o número de eventos está agrupado em igual número de caixas (caixas) para produzir um histograma. A largura do bin representa um intervalo de tempo iguais. As intensidades são inseridos no tempo diferentes liga para que a altura de uma caixa especial representa o número de vezes que a intensidade ocorre na janela de tempo particular. Uma vez que este tipo de análise só depende de coleta de dados na velocidade de varredura mesmo, muitos vestígios podem ser analisadas simultaneamente. Além disso, esta análise não é sensível a diferenças nos níveis de corante, potência do laser, etc, e ruídos eletrônicos e de fundo ocorre em escalas de tempo muito rápido e são vistas apenas nos primeiros 1-2 bins.

O correspondente histograms dos dados brutos na fig. 4 são mostradas na parte inferior da página. O histograma para as células de controle são distribuídos por um grande número de caixas correspondente a uma ampla distribuição do tempo, conforme representado pela linha vermelha (a linha é para orientar o olho e nenhum modelo é assumido). Em contraste, as caixas para a resposta das células onde a interação Gα _q-Cav3 foi interrompido pela peptídeo estão confinados a uma distribuição bin estreita sugerindo que a presença de peptídeo elimina fluxos de maior duração. Microinjeção de um peptídeo de controle que não interrompe Gα _q-Cav3 produz um histograma semelhante a un injetaram ^células-8.

Na fig. 5 comparamos as flutuações de intensidade rápida de Ca ^{2 +} Verde em adultos cardiomiócitos do ventrículo canina (esquerda) e fresco, cardiomiócitos de ratos unstimulated neonatal que a falta cavéolas (direita). Aqui, os histogramas correspondentes da intensidade durante um período de três minutos foram binned a 35 para visualizar os eventos mais lento de cálcio. Note-se que os cardiomiócitos neonatal mostrar flutuações rápido em uma base plana mostrando a falta de Ca ^{2 +} lento atividade enquanto uma linha de base mais estruturada é visto para as células adultas. Essas diferenças são mais facilmente observadas nos histogramas.

Figura 1. Imagens de cardiomiócitos adultos canina ventricular mostrando a distribuição dos Gα _q immunolabeled com Alexa-488-488, onde Alexa foi animado com 488nm linha de laser de argônio-íon ea imagem foi gravado utilizando filtro de 530nm de emissão BP505-. No canto superior direito é a mesma imagem de visualização da localização de caveolina-3 immunolabeled com Alexa-647, animado com a linha 633-nm de uma Ele:. Ne laser e gravados utilizando LP650 nm de emissão de filtro A imagem mesclada, onde co-localização é visto em laranja é no canto inferior esquerdo com uma imagem ampliada para a direita.

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Figura 2. Cálcio imagem de um dos cardiomiócitos ventriculares caninos adultos vivendo carregado com Ca ^{2 +} Verde. A imagem foi tirada em um sistema confocal microscópio de varredura a laser com uma objetiva de 40x usando um laser de 488nm Argon ion e um filtro de emissão LP515. A imagem é composta de 1200 linhas, o pixel tempo de permanência foi a 2 microsiemens, eo tamanho do pixel foi de 0,1 mM.

Figura 3. Flutuações de intensidade TOP de um traço de uma linha de cardiomiócitos ventriculares caninos adultos vivendo carregado com Ca ^{2 +} Verde e fotografado como descrito, e BOTTOM mesma célula estimulada pela adição de 5 mM carbacol.

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Figura 4. TOP Um exemplo de traços de uma linha de cardiomiócitos ventriculares caninos adultos vivendo carregado com Ca ^{2 +} Verde (vermelho) tomadas mais de 180 ms, onde a média de 3 traços é mostrada como uma linha preta, e em comparação com uma célula que foi microinjeção com um peptídeo que perturba Gα _q-caveolina 3 associação (vermelho), onde uma média de três traços é em preto. Notamos que subtraiu 400 contagens de intensidade a partir do menor conjunto de dados para fins de visualização. Os painéis inferiores são os histogramas correspondentes dos dados binned como descrito no texto, e onde o número bin é arbitrária ea contagem bin (ou simplesmente contar) corresponde à quantidade total de intensidade em que Bin particular. Notamos que as linhas de linha vermelha e azul desenhada no controle (esquerda) e (à direita) peptídeo histogramas são para permitir uma identificação mais fácil e as comparações dos dados e nenhum modelo é assumido.

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Figura 5. Flutuações de intensidade de Ca ^{2 +} Verde em adultos cardiomiócitos do ventrículo canina (esquerda) e fresco, cardiomiócitos de ratos unstimulated neonatal que a falta cavéolas (direita) e seus histogramas correspondentes são mostrados abaixo.

Discussion

Nós desenvolvemos um método para ver e isolar sinais de cálcio em cardiomiócitos rápida vivos. Enquanto as condições experimentais dessas medidas tenham sido previamente aplicado a sistemas de células de outros ^10, assim como cardiomiócitos ^11, o uso de histogramas e análise bin permite que dados de Ca ^{2 +} muitos eventos a serem adquiridos. Eventos mais rápidos podem ser facilmente isoladas de mais lentas e modelos adaptados para compreender seus mecanismos subjacentes. Cardiomiócitos de cultura, como muitas linhas de células primárias, pode ser difícil. Embora seja geralmente que medidas devem ser tomadas logo após as células são adquiridos, nós encontramos que os cardiomiócitos adultos canina foi utilizado neste estudo só começam a perder suas propriedades específicas após 3 dias. Este prazo maior permite que as células firmemente anexar para o substrato, garantindo que as células vão sobreviver tratamentos potencialmente letais, tais como microinjeção. Firme apego é fundamentalpara o sucesso da microinjeção.

Verificou-se o papel de Gα _q-caveolina 3 associação em fluxos de cálcio por microinjecting um peptídeo que interrompe sua interação. Gostaríamos de salientar que a microinjeção deve ser feito com muito cuidado para minimizar danos à célula e vazamento de conteúdo celular. No entanto, esses riscos devem ser equilibrado pelo uso de agulhas de maior diâmetro que são necessários para fornecer uma quantidade adequada de material para os cardiomiócitos relativamente grande. A inclusão de um corante como o DAPI que permite controlar quais células foram microinjeção é importante. Como mencionado, é importante que para a microinjeção miócitos são banhadas em meio livre de cálcio e que as soluções injetadas também é livre de cálcio. Influxo de cálcio extracelular inicia contrações e posterior morte de células

As medições se pode ser adaptado para outros tipos de células, corantes e confocal a lasersistemas a seguir outros eventos, tais como celular rápida insoitol trisphospate 1,4,5 e fluxos cAMP, embora o Ca ^{2 +} fluxos são certamente um dos mensageiros mais complexos celulares. Um deve ser cauteloso sobre como escolher indicadores fluorescentes que não são facilmente Foto-descoloração e ter uma resposta robusta e dinâmica de fluorescência, para que os poderes do laser de baixa pode ser usado. Laser de baixa potência também vai evitar o aquecimento local, que poderia dar origem a efeitos indesejados celular.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	ABCD1234