Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

تصور كا الأوعية الدموية 2 + اشارة سببها ريوس المشتقة نظير الصماوي

doi: 10.3791/3511 Published: December 21, 2011

Summary

وصفت وسيلة فعالة للحصول على نظرة ثاقبة الرؤية والاستقراء ريوس نظير الصماوي المستمدة من البطانية إشارة + CA2. هذا الأسلوب يستفيد من قياس نظير الصماوي ريوس المستمدة أثار CA2 + تعبئة الخلايا البطانية في الأوعية الدموية في نموذج شارك في الثقافة.

Abstract

وقد تورط الاكسدة في عدد من الظروف المرضية بما في ذلك نقص التروية / ضخه الأضرار والتسمم. مفهوم الاكسدة يشير إلى تشكيل الشاذة من ريوس (أنواع الاكسجين التفاعلية) ، والتي تشمل O 2 -- ، H 2 O 2 ، وجذور الهيدروكسيل. أنواع الاكسجين التفاعلية التأثيرات العديد من العمليات الخلوية بما في ذلك نقل الإشارة ، وانتشار الخلايا وموت الخلايا 1-6. ROS لديها القدرة على الأوعية الدموية وتلف خلايا الجهاز مباشرة ، ويمكن الشروع في التفاعلات الكيميائية الثانوية والتعديلات الوراثية التي تؤدي في نهاية المطاف في التضخيم من الأضرار الأولية بوساطة نسيج ريوس. ومن المكونات الرئيسية لتتالي التضخيم الذي لا رجعة فيه تفاقم تلف الأنسجة هو توظيف وتفعيل تعميم الخلايا الالتهابية. أثناء الالتهاب ، وإنتاج السيتوكينات الالتهابية الخلايا مثل نخر الورم عامل α (TNFα) ، وأنه IL - 1تنشيط الخلايا البطانية (EC) والخلايا الظهارية ، وكذلك زيادة 7 الاستجابة الالتهابية. خلل بطانة الأوعية الدموية هي ميزة أنشئت من التهاب حاد. الضامة تساهم في اختلال وظيفي التهاب بطانة خلال الآليات التي لا تزال غامضة. تفعيل نتائج الضامة خارج الخلايا في الإفراج عن O 2 • -- والعديد من السيتوكينات الموالية للالتهابات ، والتي يطلق إشارات مرضية في الخلايا المجاورة 8. oxidases NADPH هي المصدر الرئيسي والأساسي للروس في معظم أنواع الخلايا. في الآونة الأخيرة ، فإنه يظهر من قبلنا وغيرها 9،10 ريوس أن تنتجها oxidases NADPH تحفز إنتاج ريوس الميتوكوندريا خلال ظروف الفيزيولوجية المرضية كثيرة. وبالتالي قياس إنتاج ريوس الميتوكوندريا هي نفس القدر من الأهمية ، بالإضافة إلى قياس عصاري خلوي ريوس. الضامة تنتج ريوس من NADPH أوكسيديز انزيم بروتين فلافيني الذي يلعب دورا رئيسيا في التهاب. تنشيط مرة واحدة ،NADPH أوكسيديز أكلة تنتج كميات وفيرة من O 2 • -- التي تعتبر مهمة في الآلية الدفاعية للمضيف 11،12. على الرغم من نظير الصماوي المستمدة من O 2 • -- يلعب دورا هاما في التسبب في أمراض الأوعية الدموية ، والتصور من الإشارات التي يسببها ريوس نظير الصماوي الخلايا بما في ذلك تعبئة كا 2 + لا تزال الفرضية. وقد طورنا نموذجا والتي تستخدم في تنشيط البلاعم كمصدر لل• O 2 -- لتنبيغ إشارة إلى الخلايا البطانية المجاورة. باستخدام هذا النموذج الذي يثبت أن بلعم المستمدة من O 2 • -- أن يؤدي إلى إشارات الكالسيوم في الخلايا البطانية المجاورة.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويمكن قياس أنواع الاكسجين التفاعلية في الخلايا الحية باستخدام الأصباغ الأكسدة الحساسة (1 و 2) أو باستخدام أجهزة استشعار البلازميد (3 و 4) من جانب المجهري متحد البؤر.

1. تصور ريوس عصاري خلوي في الخلايا J774

  1. تنمو J774.1 الماوس الوحيدات المستمدة الضامة (10 6 خلية / مل) على أسفل الزجاج 35 ملم الأطباق (جهاز هارفارد) لمدة 48 ساعة.
  2. التحدي مع خلايا TLR منبهات (2 ميكروغرام / لتر ، ليبو - teichoic حمض TLR2 ناهض ؛ 10μg/ml ، بولي (I : C) - TLR3 ناهض ؛ 1 ميكروغرام / مل LPS - TLR4 ناهض) لمدة 6 ساعات إلى 37 درجة مئوية.
    ملاحظة : استخدمت تقوم البلاعم المعالجة تحت ظروف مماثلة للنموذج التعاون كا 2 + ثقافة التعبئة.
  3. إضافة الصبغة الحساسة للأكسدة H 2 DCF - DA (Invitrogen) لإعطاء تركيز النهائي من 10 ميكرومتر في ECM (المتوسط ​​خارج الخلية : 121 مم كلوريد الصوديوم ، 5 مم NaHCO 3 و 10 ملي نا HEPES و 4.7 ملي بوكل ، 1.2 ملي KH 2 ص 4 و 1.2 ملي MgSO 4 ، 2 مم CaCl 2 ، 10الجلوكوز و 2.0 ملي ديكستران ٪ ، ودرجة الحموضة 7.4 ؛ تم الحصول عليها من جميع سيغما) التي تحتوي على 2 ٪ لجيش صرب البوسنة الأطباق والخلايا احتضان لمدة 20 دقيقة قبل التصور مبائر تحت المجهر.
  4. بعد تحميل صباغة ، وضعت على خلايا تصور مرحلة حرارة يتم التحكم فيها نظام التصوير المناسبة. نستخدم كارل زايس ميتا 510 LSM مبائر نظام التصوير مقرونا الأرجون ليزر ايون مصدر في جامعة النجاح الإثارة من 488 نانومتر لمضان DCF 40X الهدف باستخدام النفط 13 (الشكل 1A و D).
  5. تحليل الصور باستخدام برنامج ImageJ (1.44) ، والبرمجيات المتاحة مجانا من المعاهد الوطنية للصحة (Rasband ، وكان ، ImageJ الأميركية ، والمعاهد الوطنية للصحة في بيثيسدا بولاية ميريلاند ، الولايات المتحدة الأمريكية ، http://rsb.info.nih.gov/ij / ، 1997-2009).

2. تصور mROS في الخلايا J774

  1. تنمو J774.1 الماوس الوحيدات المستمدة الضامة (10 6 خلية / مل) على أسفل الزجاج 35 ملم الأطباق (جهاز هارفارد) لمدة 48 ساعة.
  2. التحدي الخلايا مع يغاندس TLR mROS للحث على إنتاج (2 ميكروغرام / لتر ، ليبو - teichoic حمض TLR2 ؛ 10μg/ml ، بولي (I : C) - TLR3 ؛ 1 ميكروغرام / مل LPS - TLR4) لمدة 6 ساعات في 37 ° جيم
  3. إضافة الميتوكوندريا الفائق مؤشر MitoSOX الأحمر (Invitrogen) لإعطاء تركيز النهائي من 5 ميكرومتر في ECM التي تحتوي على 2 ٪ لجيش صرب البوسنة الأطباق والخلايا احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية للسماح للتحميل MitoSOX الأحمر.
  4. بعد تحميل الصبغة ، تصور الخلايا في مرحلة حرارة يتم التحكم فيها من كارل زايس LSM 510 الزوجين مبائر ميتا نظام التصوير مع ليزر أيون الأرجون مصدر في جامعة النجاح الإثارة من 561 نانومتر لMitoSOX الأحمر مضان 40X الهدف باستخدام النفط (الشكل 1B و E).
  5. لمراقبة التجارب ، وبعد إضافة الصبغة تحميل برنامج تلفزيوني أو DMSO (مراقبة سلبية) أو Antimycin 2μM ألف (كما الفائق الميتوكوندريا مولد إيجابية السيطرة) إلى الخلايا السابقة لصورة العينة كما هو موضح في 2.4 (الشكل 1C)
  6. تحليل الصور باستخدام برنامج ImageJ (1.44).

3. Visualizatiعلى من ROS عصاري خلوي في MPMVECs فرط خلوي مستقرة

  1. نستخدم pHyPer - خلوي (Evrogen) متجه التعبير الثدييات ترميز فرط استشعار الفلورسنت التي يموضع في السيتوبلازم وتحديدا تركيز الحواس submicromolar من H 2 O 2 14.
  2. Transfect الرئوي الاوعية الدموية الدقيقة الفئران الخلايا البطانية (MPMVECs) مع pHyPer - خلوي النواقل باستخدام إما electroporation أو الكواشف ترنسفكأيشن. نحن نستخدم 10 × 10 6 خلايا وtransfect مع 10μg من pHyPer - خلوي عبر electroporation باستخدام الجينات BioRad نظام electroporator بولسير (250V ؛ 500 μF). تستكمل MPMVECs الثقافة في المتوسط ​​10 ٪ مع DMEM FBS والأحماض الأمينية غير الأساسية ، البطانية تكملة النمو والمضادات الحيوية.
    ملاحظة : ترنسفكأيشن بعد ، وخلايا في طبق منخفض الكثافة لتسهيل نمو المستعمرة.
  3. استبدال المتوسطة مع مستنبت كاملة تستكمل مع 500 ميكروغرام / مل G418 ، بعد 48 ساعة من ترنسفكأيشن. الشاشة للاستنساخ التي أعلى نسبة من H خلايا yPer ايجابية وايجابية فرط مرور الحيوانات المستنسخة لزيادة عدد الخلايا الإيجابية المفرطة (الشكل 2).
    ملاحظة : نحن نستخدم المسلسل تخفيف من الخلايا لاختيار واحد من الخلايا نسيلي والشاشة لخلايا مستقرة للغاية معربا عن فرط.
  4. نمو مستقر فرط خلوي MPMVECs على coverslips 0.2 ٪ المغلفة الجيلاتين (80 نقطة التقاء ٪). التحدي القادم خلايا اليوم مع يغاندس TLR (2 ميكروغرام / لتر ، حمض TLR2 Lipoteichoic ؛ 10μg/ml ، بولي (I : C) - TLR3 ؛ 1 ميكروغرام / مل LPS - TLR4) لمدة 6 ساعات إلى 37 درجة مئوية. الخلايا غير المعالجة بمثابة السيطرة.
  5. بعد العلاج ، وتركيب الخلية Attofluor coverslips على الغرفة (Invitrogen). إضافة 1ml من قبل هانكس حرارة محلول ملحي متوازن (HBSS) الى الغرفة ووضع الغرفة في مرحلة حرارة يتم التحكم فيها من LSM كارل زايس النظام ميتا 510 مبائر التصوير. وتصور صورة مضان التغيير في جامعة النجاح الإثارة من 488 نانومتر باستخدام 40X الهدف النفط (الشكل 3A و D).
  6. تحليل الصور باستخدام برنامج ImageJ (1.44) (انظر القسم 6).
itle "> 4. ريوس من التصور في الميتوكوندريا MPMVECs فرط dMito مستقرة

  1. نستخدم pHyPer - dMito (Evrogen) متجه التعبير الترميز الميتوكوندريا الثدييات التي تستهدف المفرط الذي يموضع في تركيز الحواس الميتوكوندريا وتحديدا submicromolar من H 2 O 2.
  2. MPMVECs Transfect مع pHyPer - dMito وتوليد مستقرة فرط dMito MPMVECs التالية الخطوات المذكورة في المقطع 3،2-3،3.
  3. نمو مستقر فرط dMito MPMVECs على coverslips 0.2 ٪ المغلفة الجيلاتين (80 نقطة التقاء ٪).
  4. التحدي القادم خلايا اليوم مع يغاندس TLR (2 ميكروغرام / لتر ، حمض TLR2 Lipoteichoic ؛ 10μg/ml ، بولي (I : C) - TLR3 ؛ 1 ميكروغرام / مل LPS - TLR4) لمدة 6 ساعات إلى 37 درجة مئوية. الخلايا غير المعالجة تكون بمثابة الشاهد السلبي. إضافة Antimycin 2μM عينة (الميتوكوندريا الفائق محفز إيجابي التحكم) قبل تصور.
  5. بعد العلاج ، وتركيب الخلية Attofluor coverslips على الغرفة (Invitrogen). إضافة 1ml من قبل هانكس حرارة محلول ملحي متوازن (HBSS) الى الغرفةوتضع الغرفة في مرحلة حرارة يتم التحكم فيها من LSM كارل زايس النظام ميتا 510 مبائر التصوير. تصور وتغيير صورة مضان في جامعة النجاح الإثارة من 488 نانومتر باستخدام 40X الهدف النفط (الشكل 3B ، C و E).
  6. تحليل الصور باستخدام برنامج ImageJ (1.44) (انظر القسم 6).

5. شارك في ثقافة نموذج للتصور نظير الصماوي المستمدة ريوس أثار كا 2 + الاشارات في الخلايا البطانية

لتصور وقياس [كا 2 +] ط التغييرات نستخدم كا 2 + الحساسة صبغة الفلورسنت fluo - 4 صباحا (Invitrogen).

  1. تنمو MPMVECs على الجيلاتين المغلفة 0.2 ٪ coverslips 25mm الزجاج (80 ٪ التقاء).
  2. احتضان الخلايا المزروعة في coverslips في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في ECM التي تحتوي على 2 ٪ BSA 0.003 ٪ وحمض pluronic مع 5 ميكرومتر fluo - 4 صباحا (Invitrogen) التركيز النهائي للسماح للتحميل - fluo 04:00. بعد تحميل وغسل الخلايا بمحلول التصوير التجريبي (ECM التي تحتوي على 0.جيش صرب البوسنة 25 ٪) التي تحتوي على سلفينبيرازون لتقليل فقدان الصبغة.
  3. بعد تحميل fluo - 4 ، على جبل coverslips Attofluor الخلية الغرفة (Invitrogen). إضافة 800μl من قبل تحسنت التجريبية حل التصوير لغرفة ووضعه في مرحلة حرارة يتم التحكم فيها من LSM كارل زايس النظام ميتا 510 مبائر التصوير.
  4. في تسمية أنبوب فصل الضامة nonactivated أو تنشيط معزولة من أي نوع أو البرية gp91 phox / -- الفئران (LPS معاملته لمدة 6 ساعة) مع الخلية الحمراء CMTPX تعقب (500ng/ml) (Invitrogen) في ECM التي تحتوي على 2 ٪ BSA وحمض pluronic 0.003 ٪. غسل وresuspend الخلايا مع 200μl الحل التصوير التجريبية.
  5. إضافة إلى الضامة المسمى fluo ، 04:00 تحميل MPMVECs في الجمعية الغرفة.
  6. سجل مضان الخضراء والحمراء كل لمدة 10-20 دقيقة 3S به كارل زايس LSM510 التصوير مبائر ميتا مع نظام ليزر الأرجون مصدر ايون مع الإثارة في 488 و 561 نانومتر لfluo - 4 صباحا وتعقب الخلايا الحمراء respectivel مضانص (Fig.4 AC).
    ملاحظة : بدلا من ذلك ، يمكن أن تستخدم J774.1 خط الخلية لانتزاع MPMVECs كا 2 + التعبئة.
  7. تحليل fluo - 4 تغييرات كثافة مضان باستخدام البرمجيات ImageJ (1.44) (انظر القسم 6).

6. تحليل البيانات باستخدام برنامج ImageJ

نقل الصور التي تم الحصول عليها من النظام مبائر كملف تنسيق. LSM لتحليل البيانات. ZEN 2009 و 2010 ZEN البرامج المقدمة مع المجهر LSM ميتا مبائر 510 أو 710 LSM المجهر multiphoton مبائر يحفظ الملفات على التوالي في شكل LSM. نوصي باستخدام هذه الأم. الملفات LSM لتحليل الصورة كما يتم الاحتفاظ نوعية الأصلي. هذا يمكن أن يكون تنسيق ملف فتحه مباشرة في تحليل الصور برنامج J. صورة الخطوات التالية مثالا التحليل الكمي من صورة واحدة. ويلزم أي ملحقات إضافية لهذا تحليل البيانات.

  1. مفتوحة. LSM أو ملف TIFF في برنامج J صورة باستخدام ملف> فتح
  2. انقر فوق علامة التبويب IMAGE> COالقنوات LOR الانشقاق> وتقسيم قنوات خضراء ومدينة دبي للإنترنت. استخدام صورة من قناة خضراء لتحليلها لاحقا.
  3. انقر مرتين وحدد "اختيار فرشاة البيضاوي" علامة التبويب وتعيين القيمة إلى 20 بكسل.
  4. لفرط خلوي الصور ، انقر على خلية واحدة لتحديد مساحة دائرية من القياس. ثم اضغط على "M" المفتاح لقياس شدة المجال المحدد. يتم الاحتفاظ القيم في إطار نتائج جديدة.
  5. القادم من خلال عقد انقر على "التحول" مفتاح في خلية مختلفة لتحديد منطقة أخرى ، ثم عن طريق الضغط على "M" مفتاح. وسجلت كثافة في إطار النتيجة. كرر الخطوات 4-5 على 50 خلايا مختلفة.
  6. لوحات د ميتو هايبر ، تعيين القيمة إلى 10 بكسل في اختيار فرشاة البيضاوي. المنطقة ذات الاهتمام (ROI) لابد من تتبع يدويا بما في ذلك خلايا الميتوكوندريا معينة.
  7. باستخدام يدوية ، تتبع منطقة حول الميتوكوندريا ثم اضغط على "M". كرر الخطوات 6-7 على 50 خلايا مختلفة.
  8. نسخ لي an القيم من النافذة ولصق النتائج في ورقة Excel أو أي برنامج لمؤامرة النتائج. نستخدم إما SigmaPlot أو PRISM Graphpad لرسم البيانات والرسم البياني.

7. ممثل النتائج

ويوضح الشكل 1 عصاري خلوي والميتوكوندريا ريوس على إنتاج التحدي مع يغاندس TLR. صور مبائر ممثل تظهر زيادة التدفقات النقدية المخصومة (عصاري خلوي) وMitoSOX الأحمر (الميتوكوندريا) مضان بعد 6 ساعات من التحفيز. تم تطبيع التغييرات مضان ، وأعربت عن مثل تغير أضعاف.

الشكل 2 يوضح توليد مستقرة فرط خلوي وفرط dMito الخلايا البطانية. وكانت transfected الخلايا البطانية مع الماوس pHyPer - خلوي أو pHyPer - dMito يبني البلازميد عبر electroporation. وقد تم اختيار الخلايا البلازميدات معربا عن ستابلي مع G418 لمدة أسبوعين. بعد التحديد ، وكان المصنف خلايا مخففة في 96 لوحات جيدا. وقد تم عزل المستعمرات الفردية وتصويرها للتعبير متجانسة.

e_content "> ويبين الشكل 3 قياس البطانية عصاري خلوي ومستويات الميتوكوندريا H 2 O 2. مبائر الممثل الصور تظهر زيادة شديدة خلوي (عصاري خلوي) ، وفرط dMito (الميتوكوندريا) مضان بعد 6 ساعات من التحفيز. تم تطبيع تغييرات شدة الإسفار وكما أعرب عنه تغيير أضعاف.

الشكل 4 يوضح تقييم البلاعم المستمدة ريوس بفعل كا 2 + عصاري خلوي البطانية التعبئة. أضيفت LPS - حفز الخلايا الرئوية الضامة على البطانية الاوعية الدموية الدقيقة (PMVEC) كان قد تم تحميلها مسبقا مع الكالسيوم بين الخلايا 2 + ([كا 2 +] ط) مؤشر صبغة Fluo - 4. أثار تطبيق البرية الضامة LPS تنشيط اكتب [كا 2 +] ط ارتفاع PMVECs أن الموهن بالضربة القاضية من NADPH أوكسيديز وظيفية (gp91 phox / --).

الشكل 1
الشكل 1. Visualizatiيوم ولدت من البلاعم الخلوية ريوس والفائق الميتوكوندريا. وقد تم الطعن J774.1 الخلايا مع يغاندس TLR2 و 3 و 4 (2 ميكروغرام / لتر ، حمض TLR2 Lipoteichoic ؛ 10μg/ml ، بولي (I : C) - TLR3 ؛ 1 ميكروغرام / مل LPS - TLR4). لمدة 6 ساعات في 37 درجة مئوية. بعد أن تم تحميلها الخلايا المعاملة مع (A) الخلوية ريوس مؤشر (H 2 - DA DCF ؛ مخضر) أو (B) مؤشر الفائق الميتوكوندريا (MitoSOX الأحمر ؛ مضان أحمر). (C) وكانت تستخدم Antimycin كعنصر تحكم إيجابية لإنتاج ريوس الميتوكوندريا. تم تقييم التغيرات كثافة مضان مبائر باستخدام المجهر. (د) و (E) الكميات التغيير يعني مضان.

الشكل 2
الشكل 2. التمثيل التخطيطي لتوليد التعبير المستقرة للعصاري خلوي الخلية البطانية والميتوكوندريا المؤشرات ريوس.

الشكل 3
الشكل 3. V. isualization عصاري خلوي من البطانية والميتوكوندريا H 2 O 2 MPMVECs المستويات معربا عن ستابلي (أ) فرط خلوي أو (B) وقد تم الطعن فرط dMito مع يغاندس TLR2 و 3 و 4 (2 ميكروغرام / لتر ، حمض TLR2 Lipoteichoic ؛ 10μg / مل ، بولي (I : C) - TLR3 ؛ 1 ميكروغرام / مل LPS - TLR4) لمدة 6 ساعات إلى 37 درجة مئوية. (C) وكانت تستخدم Antimycin كعنصر تحكم إيجابية لإنتاج ريوس الميتوكوندريا. بعد العلاج ، وجرى تقييم التغيرات كثافة مضان مبائر باستخدام المجهر. (د) و (E) الكميات التغيير يعني مضان.

الشكل 4
الشكل 4. بلعم المستمدة ريوس انتزاع ضعف الخلية البطانية كا تعبئة + 2. (أ) تم تنشيط التمثيل التخطيطي من الخلايا البطانية / بلعم دراسة نموذج التعاون ثقافة (B) الضامة الفئران المعزولة طازجة من كلا WT وgp91phox الفئران الخالية (مختبر جاكسون) التي LPS ميكروغرام / 1 مل لمدة 6 ساعة. Macropوصفت hages مع تعقب الخلايا الحمراء (الحمراء) ، وأضاف على Fluo - 4 PMVECs تحميل (الخضراء) لتقييم يا نظير الصماوي 2 • -- يشير (C) أثار LPS تنشيط البلاعم الفئران المعزولة من وزن كبير وسريع تعبئة + كا 2 في PMVECs مقارنة الضامة من الفئران gp91phox فارغة. وقد تبين من التحقق من صحة التنشيط بلعم سابقا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وصف طريقة القياس هنا يسمح السريع وكمية من أنواع الاكسجين التفاعلية في الخلايا الحية إما باستخدام الأصباغ الأكسدة حساسة أو أجهزة الاستشعار البلازميد. منبهات من TLRs (مثل مستقبلات تول) هي المركبات التي تحفز الخلايا من خلال TLRs موجودة على سطح الخلية وتحريك مسارات إشارات المصب 15. في البروتوكول ، كنا ثلاثة مختلفة بمعنى ناهضات TLR ، يبو - teichoic حمض TLR2 ناهض ؛ بولي (I : C). - TLR3 ناهض ؛ LPS - TLR4 ناهض التي ذكرت للحث على ROS كنظام نموذج للتدليل على قياس ROS . قياس العائد على المبيعات باستخدام صبغة حساسة للتأكسد سريعا ، ويمكن استخدامها لقياس مجموعة متنوعة من الأنواع ريوس. استخدام البلازميد فرط استشعار تقوم بالكشف انتقائي H 2 O 2 المستويات. H 2 O 2 هي أكسدة أكثر استقرارا ، وكذلك استخدام المفرط وفرط خلوي dMito في إعداد الخلية مستقرة يضيف ميزة على autooxidation - صورة من الأصباغ الفلورية ريوس الحساسة.لا يسبب فرط مصطنعة ريوس جيل ، ويمكن استخدامها للكشف عن التغيرات السريعة للتركيز 2 H 2 O في مقصورات مختلفة من الخلايا تحت مختلف الظروف الفسيولوجية والمرضية. وتستخدم الخلايا معربا عن ستابلي أجهزة الاستشعار المفرط للاختيار نسيلي من سكان أن يقدم قياسات دقيقة وموثوق بها أكثر من 2 مستويات H 2 O. الأهم من ذلك ، كما يصف هذا الأسلوب في الكشف والقياس الكمي للكا 2 + التعبئة في الخلايا الحية الناجمة عن نظير الصماوي ريوس المستمدة من الخلايا المجاورة مثل الخلايا المناعية الفطرية. قد يكون هذا الإجراء جنبا إلى جنب مع التجارب المجهري مبائر تكون مفيدة جدا للكشف عن أهمية المكانية والزمانية لأحداث تغيرات في الخلية نقل الإشارة وبخاصة في الحالات التي تشترك فيها نوعين مختلفة من الخلايا. على الرغم من التجارب ممثل مفصلة في هذه الورقة هي مجرد مثال واحد من هذا النوع من التفاعل المدروسة ، يمكن أن تكون هذه التقنية بسهولةdapted لدراسة التفاعلات الخلوية بين عدة أنواع الخلايا الحية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح (R01 HL086699 ، HL086699 - 01A2S1 ، 1S10RR027327 - 01) إلى MM. معتمد جزئيا مقالتنا التي Microimaging كارل زايس م.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Attofluor cell chamber Invitrogen A7816
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674
DMEM low glucose medium Invitrogen 10567-014
Endothelial growth factor supplement (ECGS) Upstate, Millipore 02-102
Fetal Bovine Serum Invitrogen 12662011
G418 Invitrogen 10131-027
Gelatin Sigma-Aldrich G1393
H2DCFDA Invitrogen D-399
LPS Sigma-Aldrich L4516
LTA Sigma-Aldrich L2515
MitoSOX Red Invitrogen M36008
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Invitrogen 51985091
Pen/Strep (10x) Invitrogen 15140163
pHyPer-cyto Evrogen FP941
pHyPer-dMito Evrogen FP942
Poly(I:C) Sigma-Aldrich P0913
Prism software 5.0 GraphPad Software Inc.
SigmaPlot 11.0 Systat software, Inc.
Trypsin-EDTA (10x) Invitrogen 15400054
T-25 Flasks Corning 430639
T-75 Flasks BD Biosciences 353136
96-well TC micro well plate BD Biosciences 353072
Zen 2009 software Carl Zeiss, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Madesh, M. Selective role for superoxide in InsP3 receptor-mediated mitochondrial dysfunction and endothelial apoptosis. J. Cell. Biol. 170, 1079-1090 (2005).
  2. Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol. Rev. 82, 47-95 (2002).
  3. Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes. Trends Biochem. Sci. 35, 505-513 Forthcoming.
  4. Hawkins, B. J. S-glutathionylation activates STIM1 and alters mitochondrial homeostasis. J. Cell. Biol. 190, 391-405 (2010).
  5. Madesh, M., Hajnoczky, G. VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release. J. Cell Biol. 155, 1003-1015 (2001).
  6. Finkel, T., Holbrook, N. J. Oxidants oxidative stress and the biology of ageing. Nature. 408, 239-247 (2000).
  7. Rittirsch, D., Flierl, M. A., Ward, P. A. Harmful molecular mechanisms in sepsis. Nat. Rev. Immunol. 8, 776-787 (2008).
  8. Sanlioglu, S. Lipopolysaccharide induces Rac1-dependent reactive oxygen species formation and coordinates tumor necrosis factor-alpha secretion through IKK regulation of NF-kappa. 276, 30188-30198 (2001).
  9. Hawkins, B. J., Madesh, M., Kirkpatrick, C. J., Fisher, A. B. Superoxide flux in endothelial cells via the chloride channel-3 mediates intracellular signaling. Mol. Biol. Cell. 18, 2002-2012 (2007).
  10. Vliet, A. vander NADPH oxidases in lung biology and pathology: host defense enzymes and more. Free Radic. Biol. Med. 44, 938-955 (2008).
  11. Babior, B. M., Kipnes, R. S., Curnutte, J. T. Biological defense mechanisms. The production by leukocytes of superoxide, a potential bactericidal agent. J. Clin. Invest. 52, 741-744 (1973).
  12. Lambeth, J. D. NOX enzymes and the biology of reactive oxygen. Nat. Rev. Immunol. 4, 181-189 (2004).
  13. Mukhopadhyay, P. Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy. Nat. Protoc. 2, 2295-2301 (2007).
  14. Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459, 996-999 (2009).
  15. Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nat. Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).
تصور كا الأوعية الدموية<sup> 2 +</sup> اشارة سببها ريوس المشتقة نظير الصماوي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mallilankaraman, K., Gandhirajan, R. K., Hawkins, B. J., Madesh, M. Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS. J. Vis. Exp. (58), e3511, doi:10.3791/3511 (2011).More

Mallilankaraman, K., Gandhirajan, R. K., Hawkins, B. J., Madesh, M. Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS. J. Vis. Exp. (58), e3511, doi:10.3791/3511 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter