Summary
内皮のCa2 +シグナリングのパラクリン由来ROSの誘導を可視化についての洞察を得るために効率的な方法が記載されている。このメソッドは、共培養モデルにおける血管内皮細胞におけるCa 2 +の動員を引き起こしたパラクリン由来ROSを測定を利用しています。
Abstract
酸化ストレスは、虚血/再灌流損傷、敗血症を含む病理学的条件の数に関与している。 、H 2 O 2、及びヒドロキシルラジカル-酸化ストレスの概念は、O 2•を含むROSの異常形成（活性酸素種）を指します。活性酸素種は、シグナル伝達、細胞増殖と細胞死1から6を含む細胞プロセスの多数に影響を与えます。 ROSは直接、血管や臓器の細胞を損傷する可能性を持って、そして最終的に最初のROSを介する組織損傷の増幅につながる二次化学反応と遺伝的変化を開始することができます。不可逆的な組織損傷を悪化させる増幅カスケードの主要なコンポーネントは、炎症細胞を循環の動員および活性化です。炎症時に、炎症性細胞は、腫瘍壊死因子-α（TNFα）とIL - 1そのようなサイトカインを産内皮細胞（EC）および上皮細胞を活性化し、さらに炎症反応7を増大させる。血管内皮機能障害は、急性炎症の確立された機能です。マクロファージは不明のままメカニズムによって炎症時に血管内皮機能障害に寄与する。 O 2の細胞外放出におけるマクロファージの結果のアクティベーション• -隣接セル内の病理学的シグナル8をトリガすると、様々な炎症性サイトカイン、。 NADPHオキシダーゼは、細胞型のほとんどにROSのメジャーと主な情報源です。最近では、NADPHオキシダーゼによって生成されたROSは、多くの病態生理学的状態の間にミトコンドリアROS産生を誘導することを私達と他の9,10によって示されています。したがって、ミトコンドリアROS産生を測定することは細胞質ROSの測定に加えて、同様に重要です。マクロファージは、炎症の主要な役割を果たしているフラビン酵素のNADPHオキシダーゼによるROSを生成する。一度活性化、宿主の防御機構11,12で重要である-食細胞NADPHオキシダーゼは、O 2大量の•を生成します。 •パラクリン由来のO 2がは- +動員はまだ仮説であるCa 2を含むパラクリンROS誘発性細胞内シグナルの可視化、血管疾患の病因に重要な役割を果たしている。隣接する内皮細胞へシグナルを伝達するために-私たちは、活性化マクロファージがO 2•のソースとして使用されているモデルを開発した。隣接する内皮細胞のシグナル伝達カルシウムにつながる-このモデルを使用して我々は、O 2•はマクロファージ由来を示しています。
Protocol
活性酸素種が酸化感受性色素（1＆2）を使用するか、共焦点顕微鏡によるプラスミドセンサー（3＆4）を用いて生細胞で測定することができます。
1。 J774細胞における細胞質ROSの可視化
- 48時間、35 - mmディッシュ（ハーバード装置）ガラスの底にJ774.1マウス単球由来マクロファージを（10 6細胞/ ml）を成長する
- 37℃6時間℃：TLRアゴニスト（1μg/ mlのLPS - TLR4アゴニスト; C）- TLR3アゴニスト10μg/ml、ポリ（I 2μg/ mlを、リポ - テイコ酸- TLR2アゴニスト）とチャレンジの細胞
注：同様の条件下で処理したマクロファージが共存培養モデルのCa 2 +動員のために使用された。 - 追加染料H 2 DCF - DA（Invitrogen社）がECMで、10μMの最終濃度を（細胞外培地与えるために酸化感受性：121 mMのNaCl、5mMの飽和NaHCO 3、10mMののNa - HEPES、4.7 mMの塩化カリウム、1.2 mMのKH 2 PO 4、1.2 mMのMgSO 4を 、2mMのCaCl 2を 、10mMグルコース、2.0％デキストラン、pH7.4の、Sigma社から入手したすべての）共焦点顕微鏡下で可視化する前に20分間料理とインキュベート細胞に2％BSAを含む。
- 染料ロード後に、適切なイメージングシステムの温度制御されたステージ上に置か細胞を可視化する。我々は40倍油浸対物13（図1AおよびD）を使用してDCF蛍光用488nmの励起にアルゴンイオンレーザ光 源と組み合わせることカールツァイスLSM 510のメタ共焦点イメージングシステムを使用してください。
- ImageJのソフトウェア（1.44）、国立衛生研究所から自由に入手可能なソフトウェアを（Rasband、WS、ImageJは、米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、米国、使用して画像を分析http://rsb.info.nih.gov/ij / 、1997〜2009）。
2。 J774細胞におけるmROSの可視化
- 48時間、35 - mmディッシュ（ハーバード装置）ガラスの底にJ774.1マウス単球由来マクロファージを（10 6細胞/ ml）を成長する
- mROSの生産誘導するTLRリガンドで細胞に挑戦（2μg/ mlを、リポ - テイコ酸- TLR2を、10μg/ml、ポリ（I：C）- TLR3、1μg/ mlのLPS - TLR4）37 6時間℃ですC.
- ° CのMitoSOXレッドのロードを許可するために37℃で30分間料理とインキュベート細胞に2％BSAを含むECMの5μMの最終濃度を得たミトコンドリアスーパーオキシドインジケーターMitoSOXレッド（Invitrogen社）を追加します。
- 染料ロード後に、40倍油浸対物（図1BおよびE）を使用してMitoSOX赤蛍光のための561 nmの励起でのアルゴンイオンレーザー光源を持つカールツァイスLSM 510メタ共焦点イメージングシステムの夫婦の温度制御されたステージ上で細胞を可視化する。
- 対照実験のため、色素ローディング追加PBSまたはDMSO（ネガティブコントロール）または2μmののアンチマイシン後（ミトコンドリアのスーパーオキシドのような発電機陽性対照）細胞への事前の画像サンプルを2.4（図1C）で説明したように。
- ImageJのソフトウェア（1.44）を使って画像を分析する。
3。 Visualizati安定したハイパーCYTO MPMVECsにおける細胞質ROSの上
- 我々はpHyPer - CYTO（Evrogen）哺乳動物発現ベクターのエンコーディング細胞質およびH 2 O 2 14の特に感覚マイクロモル以下の濃度に局在する蛍光センサーのハイパーを使用してください。
- エレクトロポレーションまたはトランスフェクション試薬のいずれかを使用してpHyPer - CYTOベクターでトランスフェマウス肺微小血管内皮細胞（MPMVECs）。我々は、バイオラッドジーンパルサーエレクトロ系（、500μF250V）を用いてエレクトロを経由してpHyPer - CYTOの10μgの10 × 10 6個の細胞とトランスフェを使用してください。 DMEM培地で培養MPMVECsは、10％FBS、非必須アミノ酸、内皮細胞増殖サプリメントと抗生物質を補充した。
注：以下のトランスフェクション、コロニーの成長を促進するために低密度でプレートの細胞。 - 500μg/ mlのG418、トランスフェクション後48時間を添加した完全培地で培地を交換してください。 Hの割合が最も高いを持つクローンの画面ハイパー陽性細胞（図2）の数を増やすことyPer陽性細胞と継代ハイパー陽性クローン。
注：私たちは、非常にハイパーを発現する安定細胞の単一細胞とスクリーンのクローン選択のために細胞の希釈系列を使用する。 - 0.2パーセントゼラチンコートしたカバースリップ（80％コンフルエント）で安定したハイパーCYTO MPMVECsを成長する。 TLRのリガンドと翌日のチャレンジ細胞（2μg/ mlを、リポテイコ酸- TLR2、10μg/ml、ポリ（I：C）- TLR3、1μg/ mlのLPS - TLR4）6時間37℃未処理の細胞は、対照として役立つ。
- 治療後、Attofluorセル室（Invitrogen社）にカバースリップをマウントします。チャンバーへのハンクス平衡塩溶液（HBSS）を暖め、事前の1mlを追加し、カールツァイスLSM 510メタ共焦点イメージングシステムの温度制御されたステージ上のチャンバーを配置。視覚化し、40倍油浸対物（図3AおよびD）を用いて488nmの励起での画像の蛍光の変化。
- ImageJのソフトウェアを（1.44）（セクション6を参照）を使用して画像を分析する。
- 我々はpHyPer - dMito（Evrogen）H 2 O 2の、特にミトコンドリアと感覚マイクロモル以下の濃度に局在する哺乳動物発現ベクターのエンコーディングミトコンドリアを標的としたハイパーを使用してください。
- トランスフェクションのpHyPer - dMitoとMPMVECsとは、セクション3.2から3.3で説明されている手順に従って、安定したハイパーdMitoのMPMVECsを生成します。
- 0.2パーセントゼラチンコートしたカバースリップ（80％コンフルエント）で安定したハイパーdMito MPMVECsを成長する。
- TLRのリガンドと翌日のチャレンジ細胞（2μg/ mlを、リポテイコ酸- TLR2、10μg/ml、ポリ（I：C）- TLR3、1μg/ mlのLPS - TLR4）6時間37℃未処理の細胞は、ネガティブコントロールとして機能します。 2μmのアンチマイシン（ミトコンドリアスーパーオキシド誘導物質陽性対照は）前に視覚化するためにサンプルを追加。
- 治療後、Attofluorセル室（Invitrogen社）にカバースリップをマウントします。チャンバーに予め温めておいたハンクス平衡塩溶液（HBSS）1mlのを追加します。とカールツァイスLSM 510メタ共焦点イメージングシステムの温度制御ステージにチャンバーを配置。視覚化し、40倍油浸対物（図3B、CとE）を用いて488nmの励起での画像の蛍光の変化。
- ImageJのソフトウェアを（1.44）（セクション6を参照）を使用して画像を分析する。
5。のCa 2をトリガパラクリン由来ROSの可視化のための共培養モデル+内皮細胞のシグナル伝達
我々は、Ca 2を使用する [Ca 2 +] iの変化+感受性蛍光色素フルオレセイン- 4 AM（Invitrogen社）の可視化と計測のための。
- 0.2パーセントゼラチンコートした25ミリメートルのガラスのカバースリップ（80％コンフルエント）にMPMVECsを成長する。
- ECMの30分が2％BSAと5μMであるFluo - 4 AM（Invitrogen）を蛍光- 4 AMをロードできるように、最終濃度0.003％のプルロニック酸を含むため、室温でカバースリップ上で培養した細胞をインキュベートする。ロード後に、実験的なイメージングソリューション（ECM、0を含むで細胞を洗浄する。色素の損失を最小限に抑えるためにスルフィンピラゾンを含む25％BSA）。
- Attofluorセル室（Invitrogen社）にみたFluo - 4、マウントカバースリップをロードした後。チャンバーに予め温めておいた実験的なイメージングソリューションの800μlを追加し、カールツァイスLSM 510メタ共焦点イメージングシステムの温度制御されたステージの上に置きます。
- 2％BSAを含むECMでセルトラッカー赤CMTPX（500ng/ml）（Invitrogen社）を有するマウス（6時間LPSで処理） -別々のチューブのラベルに非活性化または活性化マクロファージは、野生型またはgp91 phoxの- /のどちらかから分離と0.003％プルロニック酸。実験的なイメージングソリューションの200μlので細胞を洗浄し、懸濁します。
- チャンバー内のアセンブリの蛍光- 4がロード午前MPMVECsへのラベル付けマクロファージを追加。
- 蛍光- 4 AMと細胞トラッカー赤色蛍光respectivelのための488および561 nmで励起によるアルゴンイオンレーザーを光源とカールツァイスLSM510メタ共焦点イメージングシステムを用いて10〜20分間、緑色と赤色の蛍光ごとに3秒を記録Y（図4 AC）。
注：別の方法として、J774.1細胞株がMPMVECsのCa 2 +動員を誘発するために使用することができる。 - ImageJのソフトウェアを（1.44）（セクション6を参照）を用いて蛍光- 4蛍光強度の変化を分析。
6。 ImageJのソフトウェアを使用してデータ分析
データ分析のため。LSMのフォーマットのファイルとして共焦点システムから取得した画像を転送。 ZEN 2009年とLSM 510メタ共焦点顕微鏡またはLSM 710多光子共焦点顕微鏡に付属のZEN 2010ソフトウェアは、それぞれ。LSMの形式でファイルを保存します。我々は、このネイティブを使用することをお勧めします。LSMファイルを画像解析のために元の品質が保持される。このファイル形式は、直接J.以下の手順では、単一のイメージの例定量分析を提供する画像解析プログラムのイメージで開くことができます。追加のプラグインは、このデータ解析は必要ありません。
- FILE> OPENを使用して画像Jのプログラムで開いている。LSMまたは。TIFFファイル
- タブの画像をクリック> COLOR> SPLITチャンネルと緑とDICのチャンネルを分割。その後の分析のための緑のチャンネルから画像を使用してください。
- ダブルクリックすると"楕円形ブラシの選択"タブを選択して、20ピクセルの値を設定します。
- ハイパーCYTO画像では、測定の円形の領域を定義する単一のセルをクリックしてください。その後、選択した領域の強度を測定する"M"キーを押してください。値は、新しい結果ウィンドウに保持されます。
- "M"キーを押すことによって、続いて別の領域を、選択するために別のセルには"Shift"キークリックを保持することによって、次の。強度は、結果ウィンドウに記録されます。 50種類のセル4-5の手順を繰り返します。
- ハイパーD -水戸の画像では、楕円ブラシの選択の10のピクセル値を設定します。関心領域（ROI）は、手動で特定の細胞のミトコンドリアを含むトレースする必要があります。
- フリーハンドを使用して、"M"を押してミトコンドリアの周りの領域をトレースして。 50種類のセル上で6から7の手順を繰り返します。
- 私をコピーします。 Excelシートや結果をプロットするために、任意のソフトウェアで結果ウィンドウと貼り付けの値。我々は、グラフなどのデータをプロットするSigmaPlotのかグラフパッドPRISMのいずれかを使用。
7。代表的な結果
図1は、TLRのリガンドとの挑戦に応じて細胞質とミトコンドリアROS産生を示しています。代表的な共焦点画像は、DCF（細胞質）とMitoSOX赤（ミトコンドリア）刺激の6時間後の蛍光の増加を示す。蛍光の変化は、倍の変化として正規化し、発現させた。
図2は、安定したハイパーCYTOおよびHyper - dMito内皮細胞の生成を示しています。マウス内皮細胞をエレクトロポレーションを介したpHyPer - CYTOまたはpHyPer - dMitoプラスミド構築物でトランスフェクションした。安定してプラスミドを発現する細胞は、2週間のG418で選択した。選択後、希釈した細胞を96ウェルプレートに播種した。個々のコロニーを単離し、均一な発現のために画像化した。
e_content">図3は、内皮細胞質とミトコンドリアのH 2 O 2レベルの測定を示しています。代表的な共焦点画像は、Hyper - CYTO（細胞質）およびHyper - dMito（ミトコンドリア）刺激の6時間後の蛍光の増加を示す。蛍光強度の変化が正規化されたと倍の変化として表現。図4は、マクロファージ由来ROS誘発内皮細胞質ゾルのCa 2 +動員の評価を示しています。 LPS刺激マクロファージは、以前は+（[Ca 2 +] iの）インジケーター色素であるFluo - 4細胞内Ca 2でロードされていた肺微小血管内皮細胞（PMVEC）に追加されました。野生型のアプリケーションがLPS活性化マクロファージは、〔Ca 2 +] iは機能的なNADPHオキシダーゼ（gp91 phoxの- / - ）のノックアウトによって減衰したPMVECsに上昇誘発。
図1。 Visualizatiマクロファージのに携帯ROSとミトコンドリアのスーパーオキシドを生成する。 J774.1細胞はTLR2、3と4配位でチャレンジした。（2μg/ mlを、リポテイコ酸- TLR2、10μg/ml、ポリ（I：C）- TLR3、1μg/ mlのLPS - TLR4）を6時間で37℃または（B）ミトコンドリアスーパーオキシドインジケーター（MitoSOXレッド、赤色蛍光）、治療の細胞は、（A）携帯ROSインジケータ（緑色蛍光H 2 DCF - DA）を充填した後。 （C）アンチマイシンAは、ミトコンドリアROS産生のためのポジティブコントロールとして使用した。蛍光強度の変化は、共焦点顕微鏡を用いて評価した。 （D）および平均蛍光変化の（E）定量。
図2。内皮細胞の細胞質とミトコンドリアROSの指標の安定した発現を生成するの模式図。
図3。 V。内皮細胞質とミトコンドリアのH 2 O 2レベルのisualization安定ハイパーCYTO（）を発現または（B）のHyper - dMitoがTLR2とチャレンジしたMPMVECs、3と4配位子（2μg/ mlを、リポテイコ酸- TLR2、10μgの/ mlのポリ（I：C）- TLR3、1μg/ mlのLPS - TLR4）6時間37℃ （C）アンチマイシンAは、ミトコンドリアROS産生のためのポジティブコントロールとして使用した。治療後、蛍光強度の変化は、共焦点顕微鏡を用いて評価した。 （D）および平均蛍光変化の（E）定量。
図4。 ROSは、障害内皮細胞のCa 2 +動員を誘導するマクロファージ由来。 （A）内皮細胞/マクロファージの共培養モデルの研究の模式図。WTとgp91phox欠損マウス（ジャクソン研究所）の両方から（B）新しく単離したマウスマクロファージは6時間に1μg/ mlのLPSによって活性化したMacrophagesが細胞トラッカーレッド（赤）で標識し、パラクリンO 2•評価するためであるFluo - 4ロードPMVECs（緑）の上に追加された- 。シグナリング（C）WTマウスから単離したLPS活性化マクロファージは、大規模で急速なCa 2 +の動員を誘発したPMVECsでgp91phox欠損マウス由来のマクロファージと比較。マクロファージ活性化の検証は、以前は実証されています。
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Discussion
方法は、細胞を生きたどちら酸化感受性色素やプラスミドセンサーを使用して活性酸素種の迅速かつ定量的な測定を可能にするここで説明する。 TLRのアゴニスト（Toll様受容体）は細胞表面上に存在するTLRを介して細胞を刺激し、下流のシグナル伝達経路15を引き起こす化合物である。我々のプロトコルでは、我々は、3つの異なるTLRアゴニストのVIZを使用し、リポ - テイコ酸- TLR2アゴニスト、ポリ（I：C）。- TLR3アゴニスト、ROSの測定を実証するためのモデル系としてROSを誘導することが報告されているLPS - TLR4アゴニスト。酸化剤感受性色素を用いたROSの測定が迅速であり、ROSの種の様々な測定に使用することができます。プラスミドベースのセンサーハイパーの使用は、選択的にH 2 O 2濃度を検出します。 H 2 O 2は、より安定な酸化剤であり、また安定したセル設定でハイパーCYTOとHyper - dMitoの使用は、ROS感受性蛍光色素の光自己酸化よりも有利に追加されます。ハイパーは、人為的ROS生成が発生することはありませんし、様々な生理学的および病理学的条件下で異なる細胞区画におけるH 2 O 2濃度の急激な変化の検出に用いることができる。安定的にハイパーセンサーを発現する細胞は、H 2 O 2のレベルの方が信頼性と正確な測定を提供して人口のクローン選択のために使用されています。重要なのは、このメソッドは、Ca 2 +の検出と定量測定+などの自然免疫細胞のような隣接セルからパラクリン由来のROSによって引き起こされる、生細胞の動員を説明します。共焦点顕微鏡と組み合わせたこの実験的な手順は、特に二つの異なる種類の細胞が関与しているインスタンスにおける細胞シグナル伝達イベントに重要な時空間変化を明らかにするために非常に便利かもしれません。しかし、この論文に詳述代表実験は研究の相互作用のタイプの一例であり、この手法は簡単にできます。複数のライブの細胞型との間の細胞間相互作用を研究するdapted。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、MMに健康補助金（R01 HL086699、HL086699 - 01A2S1、1S10RR027327 - 01）の国立研究所によってサポートされていました。私たちの記事は、部分的にカールツァイスマイクロイメージングLLCによってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| DMEM low glucose medium | Invitrogen | 10567-014 | |
| Endothelial growth factor supplement (ECGS) | Upstate, Millipore | 02-102 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 12662011 | |
| G418 | Invitrogen | 10131-027 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1393 | |
| H2DCFDA | Invitrogen | D-399 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L4516 | |
| LTA | Sigma-Aldrich | L2515 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen | 51985091 | |
| Pen/Strep (10x) | Invitrogen | 15140163 | |
| pHyPer-cyto | Evrogen | FP941 | |
| pHyPer-dMito | Evrogen | FP942 | |
| Poly(I:C) | Sigma-Aldrich | P0913 | |
| Prism software 5.0 | GraphPad Software Inc. | ||
| SigmaPlot 11.0 | Systat software, Inc. | ||
| Trypsin-EDTA (10x) | Invitrogen | 15400054 | |
| T-25 Flasks | Corning | 430639 | |
| T-75 Flasks | BD Biosciences | 353136 | |
| 96-well TC micro well plate | BD Biosciences | 353072 | |
| Zen 2009 software | Carl Zeiss, Inc. |
References
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