Summary
Техника для исследования разделов липидного плота флуоресцентных белков в мембране живой клетки описывается. Он использует различия в диффузии время белки, расположенные внутри или за пределами липидного плоты. Приобретение может осуществляться динамически в контрольных условиях или после наркомании.
Protocol
1. Калибровка установки FCS
- Начать конфокальной микроскопии, лазеры, компьютеры, инкубатор для температуры и CO 2 контроля.
- Убедитесь в том, SPAD (Single лавины фотонов Diode) на флуоресценцию и фильтр внутри SPAD хорошо подходит для вашего образца. Убедитесь, что SPAD синхронизированы во времени. Остерегайтесь только начать ФТС программное обеспечение только ваш SPAD настройки готовы к приобретению.
- Подготовить новое решение холерного токсина-Alexa488 разводят в PBS достичь концентрации 1 мкг / мл (17,5 нм).
- Оптимизация конфокальной микроскопии решения с использованием внутреннего обнаружения под микроскопом.
- Включите отметить режим сканирования и выбрать точку в решении образца. Убедитесь, что длительность лазерного освещения достаточно долго, чтобы выполнить свой ФТС приобретения (> 5 минут).
- Переключение в режим внешнего обнаружения SPAD и программное обеспечение ФТС. Следите за своим флуоресцентного сигнала и убедитесь, что он также специальнойТед SPAD (достаточно сигнала, но не насыщение, от 10 000 до 50 000 имп / с нормально). В случае необходимости, изменить положение г, усиление и / или мощности лазера для достижения правильного сигнала флуоресценции.
- Получите 10 комплектов 30 секунд измерений. Время сбора данных должны быть оптимизированы для вашего образца (компромисс между лучшим отбора проб и фотообесцвечивания проблем).
- Анализ данных (см. шаг 4), чтобы гарантировать, что у вас есть авто-корреляции кривой, соответствующей одному флуоресцентный вид диффузии в растворе (уравнение на рис. 2) и о том, что время диффузии, полученные после установки правильно (около 0,2 мс) (рис. . 3).
2. Окраска живых клеток с маркером липидов Плоты
- Пластина НЕК293 на 8-а Labteks покрытые поли-L-лизин (1mg/ml) за день до изображения, чтобы убедиться, что их адгезии является правильным. Используйте среде без фенола красного обеспечения нет возмущения сигнала флуоресценции.
- Промойте клетки дважды HBSS (буферизованный солевой раствор Хэнка).
- Добавить холерного токсина-Alexa488 (1 мкг / мл) / BSA (0,1%) в 500 мкл HBSS в клетки в течение 30 минут при температуре 37 ° C. Холерный токсин связывается с ганглиозида GM1, как известно, преимущественно разделы в липидных плотах.
- Промойте клетки дважды HBSS (буферизованный солевой раствор Хэнка).
3. ФТС сбора данных на живые клетки
- Поместите окрашенных клеток на предметном столике микроскопа. Убедитесь, что температура и CO2 условия являются оптимальными в противном случае это может привести к артефактов в диффузии раз.
- Оптимизация конфокальной микроскопии клетки интереса с использованием внутреннего обнаружения под микроскопом (рис. 4).
- Включите отметить режим сканирования и выбрать пункт в плазматической мембране клетки интерес. Выполните 1-2 изображения в реальном времени клетки, чтобы убедиться в клетке не двигается во время приобретения.
- Переключение в режим внешнего обнаружения SPAD и ФТС мягкийизделия. Следите за своим флуоресцентного сигнала и убедитесь, что он хорошо подходит для SPAD (достаточно сигнала, но не насыщение, от 10 000 до 50 000 имп / с это нормально). В случае необходимости, изменить положение г, усиление и / или мощности лазера для достижения правильного сигнала флуоресценции. Если этого не достаточно, вы можете рассмотреть вопрос об изменении условий окрашивания.
- Получите 10 образцов 30 секунд измерений. Как и большинство клеток самофлюоресцирующими, вы можете увидеть снижение флуоресценции в течение первых приобретений, в связи с авто-флуоресценция исчезает.
4. Анализ данных ФТС
- Установить интервал корреляции и создавать авто-корреляции кривых с помощью программного обеспечения ФТС. Интервал корреляции, как правило, варьируется от кратчайшие разрешимы задержкой до самого длинного сроки (в статистике измерений становится все более и более неадекватным, когда максимальное время корреляция приближается общее время приобретения, максимальное время задержки ограничено до 80% Приобретение время на PicoquaП программное обеспечение).
- Для каждого образца, экспорт файлов, соответствующих флуктуации флуоресценции и авто-корреляции в зависимости от времени.
- С помощью анализа данных и установки программ, таких как происхождение Pro импортировать файлы.
- Для каждого образца, убедитесь, что нет фотообесцвечивания во время приобретения, т.е. флуоресценции остается стабильной в течение 30 секунд. Отменить любые меры отображения фотообесцвечивания как это может привести к искусственной более длительное время диффузии.
- Убедитесь, что форма оставшихся ФТС кривые правильно (см. рис 5). Определение средней кривой FCS.
- Установите кривой с соответствующей математической модели (рис. 2). Это подходит даст вам время диффузии (ы), а доля молекул, диффундирующих с этим (ESE), диффузия раз (а).
5. Представитель Результаты
Пример калибровки FCS с холерного токсина-Alexa488 решение показано на рисунке 3 (рис. 3А), индивидуальные и средний ФТС кривые были рассчитаны. Средний ФТС кривые были оснащены уравнений, соответствующих различным моделям диффузии (пример на рисунке 2). Параметр классически считается определить качество подгонка коэффициент детерминации R 2. Чем ближе R 2 к 1, тем лучше подходит. В этом случае наиболее точную модель, чтобы соответствовать средней кривой FCS является одним описанием населения флуоресцентных молекул, диффундирующих свободно в трех измерениях (уравнения 1 на рисунке 2 и рис. 3б). Время диффузии происходит от нужным составляет 0,32 мс. Остатки от построения кривой (рис. 3) и R 2 фактора (0,99906) дают оценки качества подгонки.
Пример анализа ФТС для холерного токсина-Alexa488 окрашенных HEK293 клеток показано на рисунке 5. Многостадийного среднего ФТС форма кривой свидетельствует о существовании населения флуоресцентных молекул с различным временем диффузии. Наилучшим образом подходит для этой кривой соответствует модели с тремя популяциями флуоресцентных зондов: два с препятствуют диффузии (диффузия в двух измерениях, как в плоскости мембраны) и один свободно диффундирующих в трех измерениях (уравнения 2 на рисунке 2 и рис 5) . Последнее населения соответствует флуоресцентных молекул, движущихся вне плоскости мембраны, т. е. либо обязательными или отмены привязки к цели мембраны, достигая через мембраны путем секреции или утилизации, или выходе из мембраны путем эндоцитоза. Два раза в диффузионной мембраны, соответствующие холерного токсина связаны с GM1, были 2 мс (25% молекул), что соответствует диффузии вне липидного плоты, и 75 мс (50% молекул), что соответствует диффузии в липидных рафтах . Пожалуйста, обратите внимание, что любое photobleachING во время сбора приведет к искусственному увеличению времени диффузии таким образом, возможно создание уклон в сторону локализации GM1 в липидных области плот.
Рисунок 1. Схематическое изображение ФТС настройки (картинка изменилась с Marquer соавт. 12)
Рисунок 2. Пример диффузионной модели и соответствующие уравнения, используемые в соответствии автокорреляционной кривой. Структура параметра S можно записать в виде S = Z 0 / б 0, Z 0 эффективное фокусное радиус вдоль оптической оси на 1 / е 2 интенсивность и w0 эффективного лаteral координационного радиусом в 1 / е 2 интенсивности. Эти значения могут быть извлечены из классической точки распространения функции (НПФ) измерений.
Рисунок 3. Оценка времени диффузии холерного токсина-Alexa488 в раствор для калибровки FCS. А) флуоресценции колебания в зависимости от времени типичный пример приобретения 30 секунд. Б) средняя автокорреляционной кривой, полученной из 10 образцов 30 секунд приобретение оснащены уравнение 1 (см. рисунок 2). C) Остатки от кривой.
Рисунок 4. НЕК-293 клетки окрашиваются холерного токсина-Alexa488. Клетки были обследованы на микроскоп SP5 конфокальной (Leica Microsystems, Wetzlar, Германия) с внутренним 488nm лазерного луча. Флуоресценции были собраны с x60 план апохромат цель погружения нефти от 500 дои 650 нм.
Рисунок 5. Оценка времени диффузии холерного токсина-Alexa488 в плазматической мембране клеток НЕК293. А) Средние автокорреляционной кривой оснащены уравнение 2 (см. рисунок 2). Б) Остатки от кривой. (С изменениями от Marquer соавт. 12)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод ФТС представленные здесь позволяет чувствительный и быстрый анализ разделов липидного плота флуоресцентных зондов интерес в живых клетках. ФТС сочетает в себе точность локализации конфокальной микроскопии с чувствительностью одного счета фотонов. Основное различие между ФТС и стандартными биохимическими методами в том, что ФТС обеспечивает абсолютную решимость раздела липидный плоты цели и не является относительная раздел как в случае DRMs изоляции или совместного исправления.
Приобретение ФТС данных занимает около 5 минут (10 приобретений 30 секунд) для каждого образца и, таким образом, довольно быстро по сравнению с обычными биохимическими методами. Эта скорость позволяет следить во времени возмущения в липидных плотах разделов, которые могут привести с наркоманией. Тем не менее, анализ автокорреляционной кривой может быть немного сложнее, так как разные модели для установки должны быть просмотрены через определениенаиболее точным. Кроме того, при приобретении фотообесцвечивания следует избегать, так как это может привести к артефактам.
Здесь мы опишем пример, где мы можем определять липидный плот разбиение липидного: ганглиозида GM1 (рис. 5). Такое исследование не было бы возможно при стандартных биохимических процедур, которые могут быть применены только к белкам. ФТС не ограничивается липидов, хотя и может также использоваться для белков, либо помеченные флуоресцентным лигандов (например, трансферрин-Alexa555 связывается с рецептором трансферрина, как известно, расположены за пределами плоты 9) или в виде слияния с флуоресцентный белок (например APP-YFP или Bace1-GFP 9, двух ключевых игроков белка при болезни Альцгеймера). Таким образом, можно использовать для широкого спектра задач. Кроме того, ФТС может быть реализована не только в клеточных линиях, как описано здесь, но и в первичных культур 9.
Что касается холерного токсина, вы должны иметь в виду,что она имеет тенденцию к совокупности GM1 в пентамеры, создавая тем самым мембраны микро-доменов, которые могут отличаться от родной плоты липидов. Вот почему вы не можете использовать colocalisation с холерного токсина, чтобы определить, если ваш белок внутри или за пределами плотах. Тем не менее, мембранные белки, такие как APP-YFP и Bace1-GFP, диффундируют в липидных плотах с диффузией время 60-80 мс 9, очень похоже на то, что наблюдалось с холерного токсина (75 мс). Таким образом, холерный токсин может быть использован для калибровки установки и убедитесь, что вы можете различать быстрые и медленные раз диффузии.
ФТС также подходит для многих других приложений, таких как 13,14 определения состояния олигомеризации белка 15 или лиганд / рецептор фармакологических исследований 16. Она также может быть связан с другими методами микроскопии, таких как полного внутреннего отражения флуоресценции (TIRF) 17,18 или стимулированного излучения слоя (Стед) 19.Действительно, Стед-FCS позволяет еще более точное определение липидного плота разбиения 19, но до сих пор, Стед микроскопии по-прежнему дорого и поэтому не получили широкого распространения.
Основные ограничения ФТС является необходимость низких концентрациях флуорофоров (в наномолярных диапазон) и быстрая диффузия, так что не будет флуорофоров photobleach перед отъездом возбуждение объеме. Дополнительные методы оценки распространения белки включают FRAP (флуоресценция Восстановление после фотообесцвечивания) и ICS (Image корреляционной спектроскопии) методы (см. обзор 20).
В FRAP, высокая интенсивность лазерного луча используется для photobleach области клеток и восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания затем контролировать. Это восстановление происходит от диффузии флуорофоров с небеленый областей беленой области. Таким образом, время диффузии можно извлечь из восстановления кинетики. FRAP могут быть использованы с высокой концентрацией ое флуорофоров и можете получить доступ к большой диапазон диффузии раз, что делает его дополняют FCS. FRAP были использованы для оценки того флуорофора был majoritarily внутри или снаружи плоты 21,22, но это все еще довольно объемного метода количественной доли флуорофоров диффузии внутри или снаружи плотах в области интереса.
ICS является изображение аналогового ФТС, в которых пространственная корреляция рассчитывается пиксель за пикселем для данного изображения 23. Это имеет то преимущество, что поддается изучению медленно диффундирующих флуоресцентных зондов, но ограничены в 2D анализа. Этот предел был преодолен путем развития ICS называется пространственно-временной ICS (стике) 24. Стике позволяет пространственно-временные соотношения флуоресцентных зондов на стопку фотографий и, таким образом, мощная техника, хотя и требует больших вычислительных реализации и имеет более низкое разрешение, чем время FCS. На самом деле, как ICS и стике ограничены обрабатывать гораздо медленнее йПриобретение время одного кадра. Другим расширением ICS называется растровой ICS (RICS) 25,26 позволяет анализ быстрый процесс диффузии, пользуясь растровом режиме сканирования доступен на большинстве коммерческих конфокальной микроскопии. RICS является универсальным, как он может быть использован для широкого спектра диффузии (от мкс мс), но его реализация (параметры сканирования, обработки данных) может быть громоздким. Мы не обнаружили много работ, в литературе, указавших на использование ICS и его производные методы для изучения липидного плоты 27-29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом Agence Nationale-де-ла Recherche (ChoAD). Мы также благодарны Фонду ICM (институт дю Cerveau и др. де-ла-Moelle) за их финансовую поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cholera toxin subunit B-Alexa 488 | Invitrogen | C-34775 | MW (pentamer) = 57 kg/mol |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | SP5 | |
| Incubator for temperature and CO2 control | Life imaging services | The Cube and the Box | |
| SPAD (Single Photon Avalanche Diode) | MPD (Micro Photon Devices) | PDM serie (100 µm sensitive area) | |
| High pass 488 nm filter | Semrock | 488 nm blocking edge BrightLine long-pass filter Part # FF01-488/LP-25 | |
| FCS detection unit | Picoquant | Picoharp 300 module | |
| Acquisition and auto-correlation software | Picoquant | SymPhoTime | |
| Fitting software | OriginLab | OriginPro8 |
References
- Brown, D. A., London, E. Functions of lipid rafts in biological membranes. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 111-136 (1998).
- Simons, K., Gerl, M. J. Revitalizing membrane rafts: new tools and insights. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 688-699 (2010).
- Simons, K., Ehehalt, R. Cholesterol, lipid rafts, and disease. J. Clin. Invest. 110, 597-603 (2002).
- Munro, S. Lipid rafts: elusive or illusive. Cell. , 115-377 (2003).
- Shaw, A. S. Lipid rafts: now you see them, now you don't. Nat. Immunol. 7, 1139-1142 (2006).
- Pralle, A., Keller, P., Florin, E. L., Simons, K., Horber, J. K. Sphingolipid-cholesterol rafts diffuse as small entities in the plasma membrane of mammalian cells. J. Cell Biol. 148, 997-1008 (2000).
- Brown, D. A., London, E. Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts. J. Biol Chem. 275, 17221-17224 (2000).
- Sharma, P., Sabharanjak, S., Mayor, S. Endocytosis of lipid rafts: an identity crisis. Semin. Cell Dev. Biol. 13, 205-214 (2002).
- Kahya, N., Scherfeld, D., Bacia, K., Poolman, B., Schwille, P. Probing lipid mobility of raft-exhibiting model membranes by fluorescence correlation spectroscopy. J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).
- Bacia, K., Scherfeld, D., Kahya, N., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy relates rafts in model and native membranes. Biophys J. 87, 1034-1043 (2004).
- Kim, S. A., Heinze, K. G., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in living cells. Nat. Methods. 4, 963-973 (2007).
- Marquer, C. Local cholesterol increase triggers amyloid precursor protein-Bace1 clustering in lipid rafts and rapid endocytosis. FASEB J. 25, 1295-1305 (2011).
- Tian, Y., Martinez, M. M., Pappas, D. Fluorescence correlation spectroscopy: a review of biochemical and microfluidic applications. Appl. Spectrosc. 65, 115A-124A (2011).
- Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 151-169 (2007).
- Ilien, B. Pirenzepine promotes the dimerization of muscarinic M1 receptors through a three-step binding process. J. Biol. Chem. 284, 19533-19543 (2009).
- Lieto, A. M., Cush, R. C., Thompson, N. L. Ligand-receptor kinetics measured by total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy. Biophys. J. 85, 3294-3302 (2003).
- Thompson, N. L., Burghardt, T. P., Axelrod, D. Measuring surface dynamics of biomolecules by total internal reflection fluorescence with photobleaching recovery or correlation spectroscopy. Biophys. J. 33, 435-454 (1981).
- Thompson, N. L., Steele, B. L. Total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy. Nat. Protoc. 2, 878-890 (2007).
- Eggeling, C. Direct observation of the nanoscale dynamics of membrane lipids in a living cell. Nature. 457, 1159-1162 (2009).
- Kolin, D. L., Wiseman, P. W. Advances in image correlation spectroscopy: measuring number densities, aggregation states, and dynamics of fluorescently labeled macromolecules in cells. Cell Biochem. Biophys. 49, 141-164 (2007).
- Shvartsman, D. E., Kotler, M., Tall, R. D., Roth, M. G., Henis, Y. I. Differently anchored influenza hemagglutinin mutants display distinct interaction dynamics with mutual rafts. J. Cell Biol. 163, 879-888 (2003).
- White, R. Holin triggering in real time. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 798-803 (2011).
- Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophys. J. 65, 1135-1146 (1993).
- Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophys. J. 88, 3601-3614 (2005).
- Digman, M. A. Measuring fast dynamics in solutions and cells with a laser scanning microscope. Biophys. J. 89, 1317-1327 (2005).
- Digman, M. A. Fluctuation correlation spectroscopy with a laser-scanning microscope: exploiting the hidden time structure. Biophys. J. 88, L33-L36 (2005).
- Nohe, A., Keating, E., Fivaz, M., van der Goot, F. G., Petersen, N. O. Dynamics of GPI-anchored proteins on the surface of living cells. Nanomedicine. 2, 1-7 (2006).
- Semrau, S., Schmidt, T. Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data. Biophys. J. 92, 613-621 (2007).
- Bates, I. R. Membrane lateral diffusion and capture of CFTR within transient confinement zones. Biophys. J. 91, 1046-1058 (2006).
