Summary
描述一种技术来探测荧光蛋白在活细胞的细胞膜脂筏分区。它发生在位于内部或外部的脂筏蛋白的扩散时间的悬殊优势。收购可以进行动态控制条件或吸毒后。
Abstract
在过去15年中，细胞膜是不是均匀的，并依赖于微，以发挥其职能的概念已成为被广泛接受。脂筏中富含胆固醇和鞘脂膜微。他们发挥的作用，在细胞的生理过程，例如信号和贩运1,2，但也被认为是几种疾病，包括病毒或细菌感染和神经退行性疾病中的关键球员。
然而，它们的存在仍是一个争论的问题4,5。事实上，脂筏的大小已估计为20纳米左右6，远低于传统的显微镜（约200纳米）的分辨率极限，从而解除了他们的直接成像。到现在为止，用于评估蛋白质脂筏内的利益分割的主要技术洗涤剂耐膜（DRMS）抗体的分离与合作修补。尽管广泛使用贝科使用他们比较容易实现的，这些技术容易文物，从而批评7,8。因此，有必要克服这些文物，能够探测活细胞中的脂筏分区技术改进。
在这里，我们提出了一个敏感的荧光标记的蛋白质在活细胞的细胞膜脂质的脂筏分区分析方法。这种方法，被称为荧光相关光谱（FCS），依赖于在位于内部或外部的脂筏的荧光探针的扩散时间的差距。事实上，在人工膜和细胞培养证明，探测器将扩散速度比内致密的脂质筏9,10外。分钟的荧光波动来确定扩散时间，测量的时间在一个焦点量（约1 femtoliter）的功能，用共聚焦显微镜在位于细胞质膜（ 图1）。自相关曲线，然后从这些波动，并安装适当的数学扩散模型11。
FCS可以用来确定分割的各种探针，只要他们有荧光标记的脂质筏。荧光融合蛋白的表达或荧光配体的结合，可以实现荧光标记。此外，FCS可以使用不仅在人工膜和细胞系，而且在小学文化，描述最近12。它也可以用来追踪脂筏的动态分区后，除了药物或膜脂组成的变化12。
Protocol
1。 FCS的安装校准
- 启动共聚焦显微镜，激光，计算机，孵化温度和CO 2控制。
- 确保SPAD值（单光子雪崩二极管）和荧光过滤器内的SPAD非常适合你的样品。检查的SPAD时间同步。小心才开始您的FCS的软件，一旦你的SPAD设置为收购准备。
- 准备一个新鲜的霍乱毒素-Alexa488解决方案，在PBS稀释至浓度达到1微克/毫升（17.5海里）。
- 优化解决方案的使用显微镜的内部检测的共焦成像。
- 切换点扫描模式，选择一个解决方案中的样本点。确保激光照射的持续时间足够长的时间来执行您的FCS的收购（> 5分钟）。
- 切换到外部检测的SPAD和FCS的软件。监视你的荧光信号，并确保它是很好穗特德的SPAD（足够的信号，但没有饱和，10 000 50 000计数/ s是罚款）。如有必要，修改z位置，增益和/或激光功率，以达到正确的荧光信号。
- 购买10套30秒的测量。采集时间应为您的样品进行了优化（最好的采样和漂白问题之间的妥协）。
- 分析数据（见第4步），以确保您有相应的自相关曲线在溶液中扩散的荧光物种（ 图2中方程）拟合后得到的扩散时间是正确的（约0.2毫秒）（ 图3）。
2。脂筏标记的活细胞染色
- 板聚-L-赖氨酸（1mg/ml的）成像前一天，以确保他们的附着力是正确的涂8 Labteks HEK293细胞。使用无酚红的培养基，以确保没有荧光信号的扰动。
- 洗涤细胞的HBSS（汉克的缓冲盐溶液）的两倍。
- 加入500μL的HBSS霍乱毒素Alexa488（1微克/毫升）/ BSA（0.1％）在37到30分钟的细胞°C。霍乱毒素绑定到神经节苷脂，要优先脂筏分区。
- 洗涤细胞的HBSS（汉克的缓冲盐溶液）的两倍。
3。 FCS数据采集活细胞
- 放在显微镜舞台上染细胞。确保温度和CO 2条件是最优的，否则这可能会导致文物扩散倍。
- 优化使用内部显微镜检测（ 图4）利息细胞共聚焦成像。
- 切换点扫描模式，并选择一个点在的利息细胞的细胞膜。执行1-2细胞，以确保细胞是不移动在收购过程中的实况图像。
- 切换到外部检测的SPAD和FCS的软洁具。监视您的荧光信号，并确保它非常适合的SPAD（足够的信号，但没有饱和，10 000 50 000计数/ s的罚款）。如有必要，修改z位置，增益和/或激光功率，以达到正确的荧光信号。如果这是不够的，你可能会考虑改变染色条件。
- 获得10样品30秒的测量。由于大多数细胞是自体荧光的，你可以看到在第一次收购，在荧光减少，由于自体荧光的衰落。
4。 FCS数据分析
- 设置相关的时间间隔，并与FCS软件生成的自相关曲线。相关间隔通常会解析滞后时间最短的时间最长（测量统计变得越来越不足时，最大的相关时间接近总采集时间，最大延迟时间被限制到80％不等收购时间上PicoquaNT软件）。
- 对于每个样本，导出相应的荧光波动和时间的函数自相关的文件。
- 使用数据分析和拟合软件，如原产地临导入文件。
- 每个样品，确保收购期间没有漂白，即荧光保持稳定在30秒。丢弃任何措施，显示漂白，因为这可能会造成人为的扩散时间较长。
- 检查其余的FCS曲线的形状是正确的（ 见图5）。确定平均FCS曲线。
- 适合用适当的数学模型（ 图2）曲线。这适合会给你的扩散时间（s）和分子扩散（ESE）扩散时间（s）的比例。
5。代表结果
与FCS的校准霍乱毒素Alexa488解决方案的一个例子如图3所示图3A），个人平均FCS的曲线进行了计算。意味着FCS的曲线拟合方程相应的各种扩散模型（ 图2中的例子）。经典考虑来确定一个合适的质量参数的测定系数R 2。越接近R 2为1，更好的契合。在这种情况下，最准确的模型，以适应平均FCS曲线是一个人口扩散的荧光分子在三个层面（ 方程1）在图2和图3B自由。适合的扩散时间为0.32毫秒。曲线拟合（ 图3C）和R 2系数（0.99906）的残值给予适当的质量估计。
例如霍乱毒素Alexa488染色HEK2 FCS的分析93细胞在图5所示。具有不同扩散时间的的多相平均FCS的曲线的形状揭示存在的荧光分子的数量。这条曲线的最合适的对应模型与荧光探针三个群体：两个阻碍扩散（扩散在膜平面的两维）和一个在三维空间中的自由扩散（ 图2和图5中的方程2） 。人口后者对应于膜面，即绑定或解除绑定膜目标外移动的荧光分子，达到通过分泌或回收通路的膜，或离开内吞膜。两膜扩散倍，相应的霍乱毒素绑定到神经节苷脂，2毫秒的分子（25％），对应于脂筏之外的扩散，75毫秒分子（50％），相应的脂筏的扩散。请注意，任何光漂白ING在采集过程中，会导致人工扩散时间较长，因此可能造成的偏见，对脂筏域GM1本地化。
FCS的设置（修改从Marquer等的图片12）的示意图如图1。
图2。扩散模型和相应的使用，以适应自相关曲线的方程的例子。结构参数S可以写为= Z 0与z / W 0 0有效焦距半径沿光轴的1 / e 2强度和w0有效LA或双侧的焦半径的1 / e 2强度。从传统的点扩散函数（PSF）的测量，可以提取这些值。
图3。扩散的霍乱毒素溶液中Alexa488 FCS的校准时间的评估。一）荧光波动功能的时间为30秒的采集有代表性的例子。乙）平均获得装有式（1）30秒采集10个样品（见图2）C）曲线拟合残差自相关曲线。
图4。的HEK-293细胞染色霍乱毒素-Alexa488。细胞成像SP5的共聚焦显微镜内部488nm激光线（徕卡公司，韦茨拉尔，德国）。荧光收集与X60计划复消色差透镜油浸物镜之间500和650 nm。
图5。在HEK293细胞的细胞膜的扩散时间霍乱毒素Alexa488的评估。 a）平均自相关曲线拟合方程2（ 见图2）。乙）从曲线拟合残差。 （修改从Marquer等 12。）
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
这里介绍FCS的方法，使脂筏的荧光探针在活细胞中的利益分割的敏感和快速分析。 FCS结合共聚焦显微镜，单光子计数的灵敏度的定位精度。 FCS和标准的生化技术之间的主要区别是，FCS使脂筏的目标，而不是相对分区的分区DRMS隔离或合作修补的情况下是绝对测定。
FCS的数据采集每个样品约5分钟（30秒10的收购），因此是相当迅速，比一般的生化技术。这个速度让时间有可能在脂质筏分区的按照扰动，可能导致药品加成。然而，自相关曲线的分析可以是一个有点棘手拟合不同型号都必须通过确定浏览最准确的。此外，在收购过程中的漂白有要避免的，因为这可能会导致文物。
在这里，我们描述了一个例子，我们可以划定脂筏的一种脂质分区：神经节苷脂（ 图5）。不会有这样的研究可能只能应用于蛋白质的生化程序与标准。 FCS是不局限于虽然血脂和蛋白质也可以使用，无论是用荧光配体（如转Alexa555结合转铁蛋白受体，已知位于外排上9），或作为荧光蛋白的融合表达标签（如APP的YFP的或9 BACE1-GFP，在阿尔茨海默氏病的两个关键蛋白球员）。因此，它可以被用于广泛的目标。此外，FCS可以实现不仅在细胞株，这里描述的，而且在9个小学文化。
关于霍乱毒素，你应该牢记它有五聚体总神经节苷脂的倾向，从而造成膜微域可以是从本地的脂筏。这就是你为什么不能用霍乱毒素colocalisation来确定，如果你感兴趣的蛋白质是内部或外部的筏。然而，膜蛋白，如APP-YFP的BACE1-GFP，弥漫脂筏在9毫秒，非常类似霍乱毒素（75毫秒）的观察与扩散的60-80倍。因此，霍乱毒素可以用来校准的设置和检查，你可以区分快速和慢速扩散倍。
FCS是也适用于许多其他应用13,14，如oligomerisation状态的一种蛋白质15或16配体/受体药理研究测定。它也可以加上其他显微镜技术，如全内反射荧光（TIRF）17,18或受激发射损耗（受激发射损耗）19。事实上，受激发射损耗FCS允许更准确测定脂筏分区19，但到现在为止，受激发射损耗显微镜仍然是昂贵的，因此并不普遍。
FCS的主要限制是低浓度的荧光（在纳摩尔范围内）和快速扩散时间的需要，所以，荧光不会离开前激发量的光漂白。评估扩散的蛋白质的互补技术，包括FRAP还原（荧光漂白后恢复）和ICS（图像相关光谱）技术（20审查）。
FRAP还原力，高强度的激光束光漂白的一个单元格，然后监测漂白是荧光恢复后的地区。这次经济复苏来自从非漂白地区荧光漂白面积扩散。因此可以提取从恢复动力学的扩散时间。与邻高浓度可用于FRAP还原f荧光，并且可以访问大范围扩散倍，从而使补充到FCS的。 FRAP还原已经被用来评估是否有荧光是majoritarily内部或外部筏21,22，但它仍然是一个相当大容量的方法，量化荧光扩散的内部或外部筏在感兴趣的领域中所占的比例。
ICS是一个FCS的，像素空间相关性的计算方法是在一个给定的图像23像素的成像模拟。它的优点是适合慢慢扩散的荧光探针的研究，但仅限于二维分析。这个限制被克服被称为时空ICS（STICS）24 ICS的发展。 STICS使堆栈的图像时空相关荧光探针，因而是一个强大的技术，虽然它需要大量的计算实施，并具有较低的时间分辨率比FCS。事实上，无论是ICS和STICS是有限的，以处理慢得多次一帧图像的采集时间。 ICS的另一个扩展称为ICS的栅格（英国皇家特许测量师学会），25,26可以快速扩散过程的分析，通过利用光栅扫描模式，在大多数商业共聚焦显微镜。英国皇家特许测量师学会是多才多艺的，因为它可以使用一个大型的扩散范围（微秒到毫秒），但其实施（扫描参数，数据处理），可以很累赘。我们没有发现在文献中的许多论文，报告使用ICS和其派生技术研究脂筏27-29。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作得到了从法新社德拉国民RECHERCHE（ChoAD“）的资助。我们也感谢基金会的财政支持ICM（研究所杜Cerveau ET DE LA Moelle）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cholera toxin subunit B-Alexa 488 | Invitrogen | C-34775 | MW (pentamer) = 57 kg/mol |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | SP5 | |
| Incubator for temperature and CO2 control | Life imaging services | The Cube and the Box | |
| SPAD (Single Photon Avalanche Diode) | MPD (Micro Photon Devices) | PDM serie (100 µm sensitive area) | |
| High pass 488 nm filter | Semrock | 488 nm blocking edge BrightLine long-pass filter Part # FF01-488/LP-25 | |
| FCS detection unit | Picoquant | Picoharp 300 module | |
| Acquisition and auto-correlation software | Picoquant | SymPhoTime | |
| Fitting software | OriginLab | OriginPro8 |
References
- Brown, D. A., London, E. Functions of lipid rafts in biological membranes. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 111-136 (1998).
- Simons, K., Gerl, M. J. Revitalizing membrane rafts: new tools and insights. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 688-699 (2010).
- Simons, K., Ehehalt, R. Cholesterol, lipid rafts, and disease. J. Clin. Invest. 110, 597-603 (2002).
- Munro, S. Lipid rafts: elusive or illusive. Cell. , 115-377 (2003).
- Shaw, A. S. Lipid rafts: now you see them, now you don't. Nat. Immunol. 7, 1139-1142 (2006).
- Pralle, A., Keller, P., Florin, E. L., Simons, K., Horber, J. K. Sphingolipid-cholesterol rafts diffuse as small entities in the plasma membrane of mammalian cells. J. Cell Biol. 148, 997-1008 (2000).
- Brown, D. A., London, E. Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts. J. Biol Chem. 275, 17221-17224 (2000).
- Sharma, P., Sabharanjak, S., Mayor, S. Endocytosis of lipid rafts: an identity crisis. Semin. Cell Dev. Biol. 13, 205-214 (2002).
- Kahya, N., Scherfeld, D., Bacia, K., Poolman, B., Schwille, P. Probing lipid mobility of raft-exhibiting model membranes by fluorescence correlation spectroscopy. J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).
- Bacia, K., Scherfeld, D., Kahya, N., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy relates rafts in model and native membranes. Biophys J. 87, 1034-1043 (2004).
- Kim, S. A., Heinze, K. G., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in living cells. Nat. Methods. 4, 963-973 (2007).
- Marquer, C. Local cholesterol increase triggers amyloid precursor protein-Bace1 clustering in lipid rafts and rapid endocytosis. FASEB J. 25, 1295-1305 (2011).
- Tian, Y., Martinez, M. M., Pappas, D. Fluorescence correlation spectroscopy: a review of biochemical and microfluidic applications. Appl. Spectrosc. 65, 115A-124A (2011).
- Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 151-169 (2007).
- Ilien, B. Pirenzepine promotes the dimerization of muscarinic M1 receptors through a three-step binding process. J. Biol. Chem. 284, 19533-19543 (2009).
- Lieto, A. M., Cush, R. C., Thompson, N. L. Ligand-receptor kinetics measured by total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy. Biophys. J. 85, 3294-3302 (2003).
- Thompson, N. L., Burghardt, T. P., Axelrod, D. Measuring surface dynamics of biomolecules by total internal reflection fluorescence with photobleaching recovery or correlation spectroscopy. Biophys. J. 33, 435-454 (1981).
- Thompson, N. L., Steele, B. L. Total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy. Nat. Protoc. 2, 878-890 (2007).
- Eggeling, C. Direct observation of the nanoscale dynamics of membrane lipids in a living cell. Nature. 457, 1159-1162 (2009).
- Kolin, D. L., Wiseman, P. W. Advances in image correlation spectroscopy: measuring number densities, aggregation states, and dynamics of fluorescently labeled macromolecules in cells. Cell Biochem. Biophys. 49, 141-164 (2007).
- Shvartsman, D. E., Kotler, M., Tall, R. D., Roth, M. G., Henis, Y. I. Differently anchored influenza hemagglutinin mutants display distinct interaction dynamics with mutual rafts. J. Cell Biol. 163, 879-888 (2003).
- White, R. Holin triggering in real time. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 798-803 (2011).
- Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophys. J. 65, 1135-1146 (1993).
- Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophys. J. 88, 3601-3614 (2005).
- Digman, M. A. Measuring fast dynamics in solutions and cells with a laser scanning microscope. Biophys. J. 89, 1317-1327 (2005).
- Digman, M. A. Fluctuation correlation spectroscopy with a laser-scanning microscope: exploiting the hidden time structure. Biophys. J. 88, L33-L36 (2005).
- Nohe, A., Keating, E., Fivaz, M., van der Goot, F. G., Petersen, N. O. Dynamics of GPI-anchored proteins on the surface of living cells. Nanomedicine. 2, 1-7 (2006).
- Semrau, S., Schmidt, T. Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data. Biophys. J. 92, 613-621 (2007).
- Bates, I. R. Membrane lateral diffusion and capture of CFTR within transient confinement zones. Biophys. J. 91, 1046-1058 (2006).
