Nós desenvolvemos uma nova técnica de quantificar as alterações de receptores de acetilcolina nicotínicos no interior das regiões subcelulares de subtipos específicos de neurónios no SNC a compreender melhor os mecanismos da dependência da nicotina, usando uma combinação de abordagens, incluindo a marcação da proteína fluorescente do receptor usando o arrastamento na abordagem e espectral imagiologia confocal.
Canais ligando-iônicos no sistema nervoso central (CNS) estão implicados em numerosas condições com sérias consequências médicas e sociais. Por exemplo, dependência de nicotina através de fumo de tabaco é a principal causa de morte prematura em todo o mundo (Organização Mundial de Saúde) e é provavelmente causada por uma alteração de ião canal de distribuição no cérebro 1. Exposição crónica de nicotina em ambos os roedores e os resultados seres humanos em aumento do número de receptores de acetilcolina nicotínicos (nAChRs) no tecido cerebral 1-3. Da mesma forma, alterações nas glutamatérgicos GluN1 ou GluA1 canais têm sido implicados no desencadeamento de sensibilização a outras drogas como a cocaína, as anfetaminas e opiáceos 4-6.
Consequentemente, a capacidade de mapear e quantificar a distribuição e os padrões de expressão de canais iónicos específicos é criticamente importante para a compreensão dos mecanismos de dependência. O estudo do cérebro específico de região efciais de drogas individuais foi avançada pelo advento de técnicas como ligantes radioativos. No entanto, a baixa resolução espacial de ligação do ligando radioactivo evita a possibilidade de quantificar canais ligando-iônicos em subtipos específicos de neurónios.
Codificados geneticamente repórteres fluorescentes, tais como a proteína verde fluorescente (GFP) e suas variantes de cor muitos, têm revolucionou o campo da biologia 7. Por marcação geneticamente um repórter fluorescente para uma proteína endógena se pode visualizar as proteínas in vivo 7-10. Uma vantagem das proteínas fluorescentes de marcação com uma sonda é a eliminação do uso de anticorpos, que têm problemas de inespecificidade e acessibilidade à proteína alvo. Nós temos usado essa estratégia para nAChRs fluorescente rótulo, o que permitiu o estudo do conjunto receptor usando Förster Resonance Energy Transfer (FRET) em cultura de células transfectadas 11. Mais recentemente, temos utilizado a Knock-na abordagem aos ratos engenheiro com proteína fluorescente amarela marcado α4 subunidades (nAChR α4YFP), permitindo a quantificação exacta do ex vivo receptor em resolução submicrométricas em neurônios do sistema nervoso central através de microscopia confocal espectral 12. O alvo fluorescente knock-in mutação é incorporado no locus endógeno e sob o controlo do seu promotor nativo, produzindo níveis normais de expressão e regulação do receptor, quando comparado aos receptores não marcados em ratinhos de tipo selvagem. Esta abordagem knock-in pode ser estendido para marcar fluorescentemente canais iónicos outros e oferece uma abordagem poderoso de visualizar e quantificar os receptores do SNC.
Neste artigo descrevemos uma metodologia para quantificar as mudanças na expressão nAChR em neurônios específicos do SNC após exposição crônica à nicotina. Nossos métodos incluem mini-implante de bomba osmótica, a fixação de perfusão intracardíaca, imagem e análise de fluorescência marcado rec nicotínicosubunidades eptor de α4YFP knock-em ratinhos (Fig. 1). Temos optimizada a técnica de fixação para minimizar a partir de autofluorescência tissue.We cérebro fixo descrever em detalhe a nossa metodologia de imagem utilizando um microscópio confocal espectral em conjunto com um algoritmo de desmistura linear espectral para subtrair o sinal autofluoresent, a fim de obter com precisão o sinal de fluorescência α4YFP. Finalmente, mostra resultados de upregulation nicotina induzida crónica de receptores α4YFP no caminho perfurante medial do hipocampo.
The authors have nothing to disclose.
Anthony Renda foi apoiado por uma Universidade de Victoria Prêmio Bolsa de Pós-Graduação. Esta pesquisa foi suportada por uma Ciências Naturais e Engenharia Council of Canada Discovery Grant, um investigador NARSAD Prêmio Jovem (para RN), a Fundação Victoria – Myre e Winifred Sim Fund, a Fundação Canadense para Inovação de subvenção, a British Columbia Fundo de Desenvolvimento do Conhecimento e Ciências Naturais e Engenharia do Conselho de Pesquisa de Ferramentas de Pesquisa do Canadá e Grant Instrumentação. Agradecemos Jillian McKay, Christina Barnes, Ariel Sullivan, Jennifer MacDonald e Daniel Morgado para criação excelente mouse.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
mini-osmotic pumps | Alzet | model 2002 | |
saline | Teknova | S5819 | |
(-)-nicotine hydrogen tartrate salt | Sigma | N5260 | |
eye drops | Novartis | Tear-Gel | |
Vetbond glue | 3M | 1469SB | |
heparin sodium salt | Sigma | H4784 | |
10x PBS | Invitrogen | 70011 | |
ketamine | Wyeth Animal Health | 0856-4403-01 | |
medatomidine hydrochloride | Pfizer | 1950673 | |
23G butterfly needle | Becton Dickinson | 367253 | |
paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
plastic embedding mold | VWR | 18986-1 | |
O.C.T. Mounting Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
Mowiol 4-88 | EMD-Calbiochem | 475904 | pH 8.5 |