Vi har udviklet en ny teknik til at kvantificere nicotinacetylcholinreceptorneurotransmission ændringer inden for subcellulære regioner af specifikke undertyper af CNS-neuroner til bedre at forstå mekanismerne i nikotintrangen ved hjælp af en kombination af metoder, herunder fluorescerende protein tagging af receptoren ved hjælp af knock-in tilgang og spektral konfokal billeddannelse.
Ligand-gatede ionkanaler i centralnervesystemet (CNS) er impliceret i talrige betingelser med alvorlige medicinske og sociale følger. For eksempel er afhængighed af nikotin via tobaksrygning en førende årsag til for tidlig død på verdensplan (World Health Organization), og er sandsynligvis forårsaget af en ændring af ion-kanal fordeling i hjernen 1. Kronisk eksponering for nikotin i både gnavere og mennesker resulterer i forøgede antal af nicotinacetylcholinreceptorer (nAChRs) i hjernevæv 1-3. Ligeledes har ændringer i glutamaterge GluN1 eller GluA1 kanaler blevet impliceret i at udløse sensibilisering andre vanedannende stoffer, såsom kokain, amfetamin og opiater 4-6.
Følgelig evnen til at kortlægge og kvantificere distribution og ekspressionsmønstre af specifikke ionkanaler er kritisk vigtigt at forstå mekanismerne i afhængighed. Undersøgelsen af hjerne region-specifikke efeffekter af individuelle lægemidler blev fremført ved fremkomsten af teknikker såsom radioaktive ligander. Den lave rumlige opløsning af radioaktiv ligand binding forhindrer muligheden for at kvantificere ligand-gatede ionkanaler i specifikke undertyper af neuroner.
Genetisk indkodede fluorescerende reportere, såsom grønt fluorescerende protein (GFP) og mange andre farver, har revolutioneret inden for biologi 7. Ved genetisk mærkning af en fluorescerende reporter til et endogent protein kan man forestille proteiner in vivo 7-10. En fordel ved fluorescens mærkning proteiner med en probe er elimineringen af antistof brug, som har problemer med nonspecificity og tilgængelighed til målproteinet. Vi har brugt denne strategi til fluorescens-mærke nAChRs, som gjorde det muligt for studiet af receptoren samling bruge Förster Resonance Energy Transfer (FRET) i transficerede dyrkede celler 11. Nylig, har vi brugt knock-in tilgang til ingeniør mus med gult fluorescerende protein tagged a4 nAChR underenheder (α4YFP), hvilket muliggør præcis kvantificering af receptoren ex vivo ved submikrometer opløsning i CNS-neuroner via spektral konfokal mikroskopi 12. Den målrettede fluorescerende knock-in mutation er inkorporeret i det endogene locus og under kontrol af dens native promotor, der producerer normale niveauer af ekspression og regulering af receptoren sammenlignet med umærkede receptorer i vildtype-mus. Dette knock-i fremgangsmåde kan udvides til fluorescens mærke andre ionkanaler og giver en kraftig metode til at visualisere og kvantificere receptorer i CNS.
I dette papir beskriver vi en metode til at kvantificere ændringer i nAChR udtryk i specifikke CNS-neuroner efter udsættelse for kronisk nikotin. Vores metoder omfatter mini-osmotisk pumpe implantation, intrakardial perfusion fiksering, billedbehandling og analyse af fluorescens mærket nikotinsyre receptor underenheder fra α4YFP knock-i mus (fig. 1). Vi har optimeret fiksering teknikken for at minimere autofluorescens fra fast hjerne tissue.We detaljeret beskrivelse vores billeddannelse metode under anvendelse af en spektral konfokalt mikroskop i forbindelse med en lineær spektral unmixing algoritme til at subtrahere autofluoresent signal for nøjagtigt at opnå α4YFP fluorescenssignal. Endelig viser vi resultatet af kronisk nikotin-fremkaldt opregulering af α4YFP receptorer i den mediale perforante sti i hippocampus.
The authors have nothing to disclose.
Anthony Renda blev støttet af en University of Victoria Graduate Fellowship Award. Denne forskning blev støttet af en Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant, en NARSAD Young Investigator Award (til RN), en Victoria Foundation – Myre og Winifred Sim Fund, en canadisk Institut for Innovation tilskud, en British Columbia Viden Fond og en naturlig Sciences and Engineering Research Council of Canada Research Tools og Instrumentering Grant. Vi takker Jillian McKay, Christina Barnes, Ariel Sullivan, Jennifer MacDonald og Daniel Morgado for fremragende mus dyrehold.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
mini-osmotic pumps | Alzet | model 2002 | |
saline | Teknova | S5819 | |
(-)-nicotine hydrogen tartrate salt | Sigma | N5260 | |
eye drops | Novartis | Tear-Gel | |
Vetbond glue | 3M | 1469SB | |
heparin sodium salt | Sigma | H4784 | |
10x PBS | Invitrogen | 70011 | |
ketamine | Wyeth Animal Health | 0856-4403-01 | |
medatomidine hydrochloride | Pfizer | 1950673 | |
23G butterfly needle | Becton Dickinson | 367253 | |
paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
plastic embedding mold | VWR | 18986-1 | |
O.C.T. Mounting Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
Mowiol 4-88 | EMD-Calbiochem | 475904 | pH 8.5 |