Summary
Crosslinked खूंटी hydrogel में कक्षों की तस्वीर encapsulation के लिए एक विधि का वर्णन है. समझाया murine insulinoma भीतर hypoxic संकेतन (MIN6) समुच्चय एक फ्लोरोसेंट मार्कर प्रणाली का उपयोग करने के लिए नज़र रखी है. इस प्रणाली के एक hydrogel पाड़ और hypoxic संकेत के सहसंबंध के भीतर सेल phenotype में परिवर्तन के साथ कोशिकाओं के धारावाहिक परीक्षा की अनुमति देता है.
Protocol
1. PEGDM संश्लेषण और प्रकाश द्वारा सहज प्रभावित PEGDM macromer समाधान तैयारी
- एक कठिन प्लास्टिक की टोपी के साथ एक 40ml कांच की शीशी में खूंटी के 2g (रैखिक, 10,000 दा) वजन.
- Methacrylic एनहाइड्राइड के लगभग 308μL जोड़ें और शिथिल शीशी टोपी.
- एक मानक घरेलू माइक्रोवेव में 2 मिनट के लिए माइक्रोवेव उच्च पर शीशी. पहने हुए गर्मी प्रतिरोधी दस्ताने, अच्छी तरह से भंवर शीशी, तो एक अतिरिक्त 5 मिनट के लिए माइक्रोवेव उच्च पर.
- संक्षेप में पर्याप्त शीशी शांत करने के लिए दस्ताने के साथ संभाला जा अनुमति देते हैं. यह खुलना और धीरे धीरे methylene क्लोराइड जोड़ने जबकि शीशी घूमता. पर्याप्त जोड़ें ताकि समाधान स्पष्ट और सजातीय प्रकट होता है, नमूना vortexing जरूरत के रूप में. एमएल 2 - methylene क्लोराइड की कुल मात्रा 1.5 होना चाहिए.
- ठंड के 200 एमएल में वेग PEGDM, समाधान dropwise जोड़कर diethyl ईथर हड़कंप मच गया.
- वैक्यूम निस्पंदन द्वारा PEGDM लीजिए और यह शुष्क करने की अनुमति देते हैं.
- एक पर्याप्त मात्रा में PEGDM भंगविआयनीकृत पानी (आमतौर पर 100 -150 एमएल).
- डायलिसिस टयूबिंग में 5 दिनों के लिए कट ऑफ 1,000 दा की आणविक भार के साथ विआयनीकृत जल के खिलाफ समाधान Dialyze. पानी एक बार दैनिक बदलें.
- अशेष भाजक -80 ° रातोंरात सी उपयुक्त कंटेनर और फ्रीज में समाधान. 4 दिनों के लिए समाधान Lyophilize एक शुद्ध सफेद PEGDM पाउडर उपज. 4 डिग्री सेल्सियस जब उपयोग में नहीं पाउडर स्टोर.
- एक प्रकाश द्वारा सहज प्रभावित PEGDM समाधान तैयार करने के लिए, पहले विआयनीकृत जल Irgacure 2959 में भंग द्वारा एक 0.5 वजन प्रतिशत photoinitiator स्टॉक समाधान तैयार करते हैं. भंवर समाधान और यह अंधेरे में संग्रहीत.
- एक 10% wt PEGDM और 0.025 wt% हांक बैलेंस्ड नमक समाधान (HBSS) में Irgacure 2959 समाधान तैयार करें. भंवर अच्छी तरह से PEGDM के विघटन को सुनिश्चित करने के लिए. हम आम तौर पर एक समय में इस समाधान के 1ml तैयार.
- एक 0.2 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर के माध्यम से यह एक 1.8 एमएल microcentrifuge ट्यूब में फ़िल्टरिंग समाधान जीवाणुरहित. एल्यूमीनियम पन्नी में ट्यूब लपेटेंऔर 4 बजे दुकान ° C
2. संस्कृति, संक्रमण, और MIN6 कोशिकाओं के एकत्रीकरण
- MIN6 कोशिकाओं RPMI १६४० 10% FBS, 7mm ग्लूकोज, 100 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 0.5 μg / एमएल amphotercin बी एक humidified वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 के साथ पूरक मध्यम में सभ्य हैं .
- इलाज संस्कृति फ्लास्क सतह से कोशिकाओं को रिलीज करने के लिए, मध्यम महाप्राण (व्यंजन), 37 के साथ कोशिकाओं कुल्ला डिग्री सेल्सियस कैल्शियम, मैग्नीशियम / मुक्त HBSS, HBSS महाप्राण (व्यंजन), तो 37 ° सी trypsin EDTA समाधान के 2 एमएल जोड़ने और कोशिकाओं की अनुमति 3 मिनट के लिए सेते हैं.
- मजबूती फ्लास्क के पक्ष जार करने के लिए कोशिकाओं को मुक्त दस्तक, तो 37 के 8 एमएल जोड़ने डिग्री सेल्सियस मध्यम और सख्ती सेल निलंबन विंदुक ऊपर और नीचे की देखभाल लेने के बुलबुले परिचय नहीं.
- एक बाँझ 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में कोशिकाओं पिपेट और एक सेल गिनती एक hemocytometer या अन्य प्रक्रिया सेल गिनती का उपयोग कर प्रदर्शन.
- निर्माता के साथ कोशिकाओं को संक्रमित करने की तैयारी मेंवायरस, पहले से संक्रमित होने की कोशिकाओं की कुल संख्या का निर्धारण और वायरस के संक्रमण के वांछित बहुलता (MOI) (सेल प्रति 50 100 संक्रामक कणों) प्राप्त करने के लिए आवश्यक निलंबन की मात्रा की गणना.
- ध्यान से एक 1.8 एमएल microcentrifuge ट्यूब में एक पूर्व aliquoted HBSS की मात्रा में वायरस के निलंबन की उचित मात्रा में pipeting द्वारा HBSS में वायरस पतला. अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं की कुल HBSS के 50 μL उपयुक्त है.
- उन्हें pipeting ऊपर और नीचे अपनी ट्यूब में है, तो निलंबन 6-अच्छी तरह से संस्कृति की थाली के कुओं में अच्छी तरह से प्रति 400.000 कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए आवश्यक मात्रा pipet द्वारा कोशिकाओं को फैलाने.
- हर अच्छी तरह से पतला वायरस की उचित मात्रा जोड़ें वांछित MOI प्राप्त करने के लिए.
- हर अच्छी तरह से मध्यम जोड़ें 1.7 एमएल तक कुल मात्रा लाने के लिए.
- इनक्यूबेटर के अंदर एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर थाली प्लेस. एक कम सेटिंग पर एक प्रकार के बरतन सेट इतना है कि माध्यम धीरे कुओं (~ 100 rpm) के आसपास washes. Aggrega करने के लिए कोशिकाओं की अनुमति दें24-36 घंटे के लिए ते. 75-175 सुक्ष्ममापी की एक अनुमानित व्यास के साथ समुच्चय का गठन किया जाना चाहिए.
3. कक्षों की PEGDM में इनकैप्सुलेशन
- कक्ष (2.4 कदम) फैलाव या निम्नलिखित एकत्रीकरण (2.10 कदम) के रूप में समझाया जा सकता है है. चूंकि hydrogel अग्रदूत PEGDM एक तरल समाधान है, कोशिकाओं को पहले crosslinking और hydrogel गठन व्यवस्थित करते हैं हो सकता है. यदि बसने के लिए जैसे बड़े समुच्चय के साथ तेजी से होने की उम्मीद है, यह दो चरणों में hydrogel उत्पादन इतना है कि कोशिकाओं को जेल के एक केंद्रीय विमान को व्यवस्थित करने के लिए फायदेमंद हो सकता है. एक एक कदम hydrogel संश्लेषण छितरी कोशिकाओं के लिए उपयुक्त प्रक्रिया (चित्रा 2) दिखाया गया है और दो कदम प्रक्रिया के रूप में अच्छी तरह से दिखाया (चित्रा 3) और नीचे विस्तृत (3.2-3.9) है.
- एक पोत जिसमें hydrogel 1 एमएल प्लास्टिक सिरिंज के बंद पतला टिप काटने और यह एक रैक अंत में खुला रखने का गठन किया जाएगा बनाएँ.
- Pipet प्रकाश द्वारा सहज प्रभावित PEGDM के 20 μL इतनासिरिंज के खुले अंत में सवार पर lution यकीन है कि मात्रा पूरे सवार की सतह को कवर कर रही है. छोटे वेतन वृद्धि में सवार समायोजित करने के लिए एक फ्लैट द्रव की सतह को प्राप्त है.
- रैक और लगभग 8 मिनट के लिए एक यूवी दीपक (365nm, ~ 7 मेगावाट / 2 सेमी) नीचे रैक hydrogel crosslinking के लिए अनुमति देने के लिए की स्थिति में pipet रखें. इस समय के दौरान, कोशिकाओं की तैयारी शुरू हो सकता है
- Pipet एक 1.8 एमएल microcentrifuge ट्यूब में कोशिकाओं / समुच्चय के वांछित संख्या युक्त मात्रा, टोपी, और 130 ग्राम से कम 5 मिनट के लिए ट्यूब अपकेंद्रित्र.
- एक micropipettor का प्रयोग, ध्यान से ट्यूब की नोक पर सेल गोली परेशान बिना मीडिया को दूर. के रूप में मीडिया के सिर गोली दृष्टिकोण है, यह सहायक हो करने के लिए एक बेहतर उपयोग, 10 μL pipet टिप.
- धीरे प्रकाश द्वारा सहज प्रभावित PEGDM समाधान (pipet चौड़े मुँह टिप का उपयोग करें यदि समुच्चय के साथ काम कर रहे) के 20 μL में कक्ष गोली का resuspend और सिरिंज वीं के शीर्ष पर सेल निलंबन जोड़नेई पहले hydrogel भाग Crosslinked.
- यूवी प्रकाश की एक अतिरिक्त 8 मिनट hydrogel के निर्माण को पूरा करने के लिए सिरिंज बेनकाब. जब समाप्त हो, कोशिकाओं बेलनाकार hydrogel (चित्रा 3) के भीतर पूरी तरह से समझाया होना चाहिए.
- सिरिंज से 24 अच्छी तरह से थाली करने के लिए संक्षेप में जेल धोने के कुएं में HBSS के 1 एमएल में hydrogel बाहरकरें. मीडिया के 1 एमएल 24 अच्छी तरह से एक थाली और संस्कृति की अच्छी तरह से में वांछित शर्तों के तहत जेल स्थानांतरण.
4. Hypoxia ट्रैकिंग
- संस्कृति छवि के दौरान किसी भी बिंदु पर कोशिकाओं फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर hypoxic संकेतन की दीक्षा को ट्रैक करने के लिए. क्या imaged किया जा रहा है पर निर्भर करता है आप बहु - अच्छी तरह से थाली में छवि या एक खुर्दबीन स्लाइड खुर्दबीन मंच पर नियुक्ति के लिए जेल से पहले हस्तांतरण कर सकते हैं. डी एस लाल की पीक उत्तेजना 556nm पर हासिल की है और चोटी उत्सर्जन 586nm होता है. उत्सर्जन काफी तीव्र है और इस प्रकार photobleaching observ नहीं किया गया हैएड समस्याग्रस्त हो. प्रोटीन के उत्पादन और पहला संकेत का पता लगाने की दीक्षा के बीच अंतराल समय लगभग 12 घंटे है. सिग्नल काफी विशिष्ट व्यक्ति संकेत कोशिकाओं की पहचान है, लेकिन संकल्प intracellular संकेत स्थानीयकरण का निर्धारण करने के लिए अपर्याप्त हो सकता है. कोशिकाओं में संकेत है, संकेत आमतौर पर cytoplasm भर में समान रूप से मनाया. सिग्नल तीव्रता भी hypoxia के लिए विस्तारित जोखिम के साथ वृद्धि कर सकते हैं, हालांकि हम अभी तक पूरी तरह से अगर यह वृद्धि की प्रोटीन अभिव्यक्ति, समग्र प्रोटीन संचय, या देरी प्रोटीन परिपक्वता के कारण है निर्धारित नहीं है.
5. प्रतिनिधि परिणाम
MIN6 एक पेग hydrogel में समझाया समुच्चय का एक प्रतिनिधि उदाहरण चित्रा 4 में दिखाया गया है. Crosslinked जेल भर में ठोस, पोत में जो प्रतिक्रिया प्रदर्शन किया गया था के आकार ले जाएगा. चिकनी बाहरी सतहों के साथ एक जेल आरोपण एक विदेशी शरीर पुनः की रोकथाम में सहायता करने के लिए बेहतर हैsponse. जेल के भीतर, सेल समुच्चय पूरी तरह मैट्रिक्स में संलग्न किया जाना चाहिए और homogenously बेहतर पोषक तत्वों परिवहन के लिए अनुमति वितरित.
MIN6 समुच्चय में hypoxic संकेतन के प्रतिनिधि चित्र 5 चित्रा में कल्पना कर रहे हैं. समान MIN6 मार्कर वायरस से संक्रमित समुच्चय या तो 20% 2 हे (5a) या% 1 हे 44 घंटे के लिए (5 ब) 2 में छवि पर कब्जा करने से पहले सुसंस्कृत थे.
चित्रा 1 हमारे hypoxia मार्कर प्रणाली की गतिविधि के योजनाबद्ध. डी एस लाल डॉ. जीन और नदी के ऊपर HRE प्रमोटर के adenoviral सम्मिलन hypoxia प्रेरित HIF-1 के नियंत्रण के तहत फ्लोरोसेंट प्रोटीन के उत्पादन के लिए अनुमति देता है.
Figure 2. एकल कदम के encapsulation के लिए प्रक्रियात्मक प्रवाह चार्ट एक करोड़ MIN6 कोशिकाओं छितरीPEGDM hydrogel osslinked. प्रत्येक जेल के लिए, छितरी कोशिकाओं 40μL प्रकाश द्वारा सहज प्रभावित PEGDM macromer समाधान में निलंबित कर रहे हैं. यह एक decapitated 1ml सिरिंज में रखा गया है और hydrogel 10-12 मिनट के बाद 365nm यूवी प्रकाश के तहत गठित की गई है. पूरा होने पर, hydrogel डिस्क सिरिंज से निकाल दिया जाता है, धोया और एक मध्यम भरा ऊष्मायन के लिए अच्छी तरह से थाली में रखा.
चित्रा 3 एकत्रित MIN6 कोशिकाओं की एक Crosslinked PEGDM hydrogel में दोहरे कदम encapsulation के लिए प्रक्रियात्मक प्रवाह चार्ट. प्रत्येक जेल के लिए, पहले एक आधा - जेल से 8 मिनट के लिए प्रकाश द्वारा सहज प्रभावित PEGDM macromer समाधान के 20μL की यूवी crosslinking द्वारा गठित है. MIN6 समुच्चय को ध्यान प्रकाश द्वारा सहज प्रभावित macromer समाधान है जो पूर्व गठित आधा जेल के शीर्ष पर जोड़ा जाता है की एक अतिरिक्त 20μL में निलंबित कर रहे हैं. पूर्ण जेल समुच्चय के साथ यूवी जोखिम के एक अतिरिक्त 8 मिनट पूरी तरह से औसत दर्जे में समझाया द्वारा बनाई हैजेल के विमान.
चित्रा 4 20X आवर्धन के तहत एक 40μL hydrogel की छवि. MIN6 समुच्चय (~ 400.000 कुल कोशिकाओं) स्पष्ट रूप से जेल के भीतर देखा जाता है. Hydrogel व्यास लगभग 6mm (बार 1mm =) है.
चित्रा 5 प्रतिदीप्त hypoxia PEGDM hydrogel में एकत्रित MIN6 कोशिकाओं में संकेत. कक्ष कि समझाया गया और तब ऊष्मायन में रखा 44 घंटे के लिए 20% 2 हे कि फिर समझाया गया और 2% 2 हे 44 घंटे के लिए में incubated कोशिकाओं स्पष्ट, सर्वव्यापक संकेत प्रदर्शित जबकि hypoxia संकेतन (एक) प्रदर्शित नहीं करते हैं . (पट्टी 100μm =) (ख).
Discussion
यहाँ प्रस्तुत विधि गैर शारीरिक स्थितियों के न्यूनतम उपयोग के साथ एक खूंटी hydrogel में सेल encapsulation के लिए एक त्वरित और सरल तकनीक प्रदान करता है. खूंटी और biocompatibility संशोधन की आसानी के लिए एक बहुत ही उपयोगी सामग्री encapsulation का प्रतिनिधित्व करता है. प्रकाश द्वारा सहज प्रभावित समाधान में खूंटी प्रतिशत के साधारण परिवर्तन, उदाहरण के लिए, रोमकूप आकार के माध्यम से compressive मापांक के रूप में यांत्रिक गुणों, और परिवहन संपत्तियों को समायोजित करने के लिए इस्तेमाल किया हो सकता है. इसके अलावा, खूंटी पक्ष श्रृंखला के अलावा द्वारा आसानी से संशोधित किया गया है. खूंटी hydrogels, इसलिए दोनों एक आशाजनक नैदानिक डिवाइस और इन विट्रो अनुसंधान में के लिए एक लचीला मंच का प्रतिनिधित्व
खूंटी समझाया कोशिकाओं में hypoxia पर नज़र रखने के लिए एक विधि को भी प्रस्तुत किया गया. इस विधि hypoxia का पता लगाने के सादगी के लिए और ब्याज की कोशिकाओं को बलिदान की जरूरत से बचने के लिए उपयोगी है. तकनीक कोशिकाओं के प्रकार की एक किस्म के लिए हमें अपनी स्थितियों की एक किस्म में लागू किया जा सकता हैव्यापक efulness. उदाहरण के लिए, स्टेम सेल भेदभाव के लिए एक क्यू के रूप में hypoxia स्टेम सेल micromass संस्कृतियों में लगाया जा सकता है. हालांकि, इस विधि केवल सेल सिस्टम या सिस्टम में जो कोशिकाओं छितरी बाद में एकत्रित कर रहे हैं को फैलाने के लिए लागू किया जा सकता है. इसके अलावा, फ्लोरोसेंट संकेत का पता लगाने बड़ा या denser ऊतकों में मुश्किल हो सकता है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
उदारता MIN6 कोशिकाओं की आपूर्ति के लिए बोल्डर, कोलोराडो विश्वविद्यालय के Kristi Anseth प्रयोगशाला के लिए धन्यवाद. इस परियोजना के लिए अनुदान NSF द्वारा प्रदान की गई है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEG | Sigma-Aldrich | 309028-500G | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma-Aldrich | 276685-100ML | |
| Microwave | Emerson | MW8784SB | |
| Vortexer | Scientific Industries Inc. | SI-A236 | |
| Methylene Chloride | Sigma-Aldrich | D65100-1L | |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136-1L | |
| Dialysis Tubing | Spectrum | 132640 | |
| Laboratories | |||
| Freezer | |||
| Lyophilizer | Labconco Corp. | 7670521 | |
| Vacuum pump | Welch Allyn | 8917Z-01 | |
| Irgacure 2959 | Ciba-Geigy | 029891301PS04 | |
| HBSS | Mediatech, Inc. | 21-022-CV | |
| Syringe Filter | VWR international | 28145-477 | |
| RPMI 1640 | Mediatech, Inc. | * | *custom formulation |
| FBS | PAA Laboratories | A15-351 | |
| Penicillin-Streptomycin | Mediatech, Inc. | 30-002-CI | |
| Amphotericin B | Mediatech, Inc. | 30-003-CF | |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3597 | Napco Series 8000 WJ w/ O2 suppression |
| Trypsin EDTA | Mediatech, Inc. | 25-052-CI | |
| Orbital Shaker | VWR international | 12620-926 | |
| UV Lamp | Sanyo Denki | FLR40SBLB/M | Holds two 40W, 365nm blacklight blue UV bulbs |
| Centrifuge | Eppendorf | 5811 000.010* | *order number. Model 5810 R |
| Microscope | Nikon Instruments | TI-ND6-PFS | With filterset for 556nm excitation/ 586nm emission |
References
- Kelly, W., Lillehei, R., Merkel, F., Idezuki, Y., Goetz, F. Allotransplantation of the pancreas and duodenum along with the kidney in diabetic nephropathy. Surgery. 61, 827-837 (1967).
- Shapiro, J. A. M., Ricordi, C., Hering, B. J., Auchincloss, H., Lindblad, R., Robertson, R. P., Secchi, A., Brendel, M. D., Berney, T., Brennan, D. C., Cagliero, E., Alejandro, R., Ryan, E. A., DiMercurio, B., Morel, P., Polonsky, K. S., Reems, J., Bretzel, R. G., Bertuzzi, F., Froud, T., Kandaswamy, R., Sutherland, D. E. R., Eisenbarth, G., Segal, M., Preiksaitis, J., Korbutt, G. S., Barton, F. B., Viviano, L., Seyfert-Margolis, V., Bluestone, J., Lakey, J. R. T. International trial of the Edmonton Protocol for islet transplantation. N. Eng. J. Med.. 355, 1318-1330 (2006).
- Sun, A. M., O'Shea, G. M., Goosen, M. F. Injectable microencapsulated islet cells as a bioartificial pancreas. Appli. Biochem. Biotechnol. 10, 87-99 (1984).
- Iwata, H., Amemiva, H., Matsuda, T., Takano, H., Hayashi, R., Akutsu, T. Evaluation of microencapsulated islets in agarose gel as bioartificial pancreas by studies of hormone secretion in culture and by xenotransplantation. Diabetes. 39, 224-225 (1989).
- Zhang, W. J., Laue, C., Hyder, A., Schrezenmeir, J. Purity of alginate affects the viability and fibrotic overgrowth of encapsulated porcine iselt xenografts. Transplant Proc. 33, 3517-3519 (2001).
- Lin-Gibson, S., Bencherif, S., Cooper, J. A., Wetzel, S. J., Antonucci, J. M., Vogel, B. M., Horkay, F., Washburn, N. R. Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels. Biomacromolecules. 5, 1280-1287 (2004).
- Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled β-cell microenvironments. Acta. Biomater. 2, 1-8 (2006).
- Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function. J. Biomed. Mater. Res. A. 90, 720-729 (2009).
- Bryant, S. J., Anseth, K. S. Hydrogel properties influence ECM production by chondrocyte photoencapsulated in poly(ethylene glycol) hydrogels. J. Biomed. Mater. Res. 59, 63-72 (2001).
- Bryant, S. J., Nuttelman, C. R., Anseth, K. S. Cytocompatibility of UV and visible light photoinitiating systems on cultured NIH/3T3 fibroblasts in vitro. J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 11, 439-457 (2000).
- Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. Effect of oxygen on isolated pancreatic tissue. Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs. 35, 739-741 (1989).
- Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. Effect of hypoxia on insulin secretion by isolated rat and canine islets of Langerhans. Diabetes. 42, 12-21 (1993).
- De Groot, M., Schuurs, T. A., Keizer, P. P. M., Fekken, S., Leuvenink, H. G. D., van Schilfgaarde, R. Response of encapsulated rat pancreatic islets to hypoxia. Cell Transplant. 12, 867-875 (2003).
- Fancy, M. L., Topiwala, R., Sahai, P., S,, Blanchette, J. O. Correlating hypoxia with insulin secretion using a fluorescent hypoxia detection system. J. Biomed. Mater. Res. B. 97, 148-155 (2011).
- Webb, J. D., Coleman, M. L., Pugh, C. W. H. ypoxia hypoxia-inducible factors (HIF), HIF hydroxylases and oxygen sensing. Cell. Mol. Life Sci. 66, 3539-3554 (2009).
