Summary
تم وصف طريقة لتغليف الخلايا الضوئية الشمسية في هيدروجيل PEG crosslinked. يتم تعقب إشارات ميتة داخل ورم جزيري الفئران مغلفة (MIN6) المجاميع باستخدام نظام علامة الفلورسنت. يسمح هذا النظام التسلسلي للفحص الخلايا في غضون سقالة هيدروجيل ويشير ارتباط نقص الأوكسجين مع التغيرات في النمط الظاهري الخلية.
Protocol
1. PEGDM التوليف ومتفاعل للضوء حل macromer إعداد PEGDM
- تزن 2G من PEG (خطي ، 10،000 دا) إلى قارورة زجاجية 40mL مع غطاء من البلاستيك الصلب.
- إضافة 308μL تقريبا أنهيدريد ميثاكريليك فضفاضة وغطاء القارورة.
- القارورة الميكروويف على ارتفاع لمدة 2 دقيقة في الميكروويف محلية القياسية. قفازات مقاومة للحرارة لبس ، دوامة القارورة جيدا ، ثم الميكروويف على ارتفاع لمدة 5 دقائق إضافية.
- السماح لفترة وجيزة القارورة ليبرد بما يكفي ليكون التعامل معها قفازات. إرفع قبعة وإضافة ببطء في حين يحوم كلوريد الميثيلين القارورة. إضافة كافية بحيث يبدو الحل واضح ومتجانس ، vortexing العينة حسب الحاجة. وينبغي أن إجمالي حجم كلوريد الميثيلين استخدامها 1،5-2 مل.
- PEGDM يعجل في 200 مل من البرد ، أثار إثيل الأثير عن طريق إضافة قطرة قطرة الحل.
- جمع PEGDM الفراغ عن طريق الترشيح واتركه حتى يجف.
- حل PEGDM في كمية كافيةمن الماء منزوع الأيونات (عادة 100 -150 مل).
- Dialyze الحل ضد الماء منزوع الأيونات لمدة 5 أيام في أنابيب غسيل الكلى مع الوزن الجزيئي قطع من 1000 دا. استبدال المياه مرة واحدة يوميا.
- قسامة الحل في حاويات مناسبة والتجميد في -80 درجة مئوية خلال الليل. Lyophilize الحل لمدة 4 أيام لتنقية تسفر عن مسحوق أبيض PEGDM. تخزين مسحوق عند 4 درجة مئوية عندما لا تكون قيد الاستعمال.
- لإعداد حل PEGDM متفاعل للضوء ، وإعداد لأول مرة في المائة من الوزن 0.5 photoinitiator حل الأسهم عن طريق تذويب Irgacure 2959 في الماء منزوع الأيونات. دوامة الحل وتخزينه في الظلام.
- إعداد 10 ٪ بالوزن وPEGDM 0.025 ٪ بالوزن Irgacure 2959 حل في محلول هانك في سولت المتوازن (HBSS). دوامة بدقة لضمان حل PEGDM. نحن نستعد عادة 1mL هذا الحل في وقت واحد.
- تعقيم حل عن طريق التصفية عليه من خلال تصفية حقنة 0.2 ميكرومتر في أنبوب مل microcentrifuge 1.8. التفاف أنبوب في رقائق الألومنيوموتخزينها في 4 درجات مئوية
2. والثقافة ، والعدوى ، وتجميع الخلايا MIN6
- تستزرع MIN6 الخلايا في المتوسط 1640 RPMI تستكمل مع FBS 10 ٪ والجلوكوز 7mM ، 100 وحدة / مل البنسلين / الستربتومايسين ، و0.5 ميكروغرام / مل ب amphotercin في بيئة ترطيب عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2.
- الافراج عن الخلايا من سطح القارورة ثقافة المعالجة ، ونضح والمتوسطة ، وشطف الخلايا مع 37 درجة مئوية الكالسيوم / المغنيسيوم خالية HBSS ، ونضح HBSS ، ثم يضاف 2 مل من 37 درجة مئوية التربسين - EDTA الحل وتسمح للخلايا احتضان لمدة 3 دقائق.
- جرة بحزم الى جانب القارورة لضرب الخلايا الحرة ، ثم تضاف 8 مليلتر من 37 درجة مئوية والمتوسطة بقوة ماصة تعليق الخلية أعلى وأسفل مع الحرص على عدم إدخال الفقاعات.
- ماصة الخلايا في العقيمة 15 مل أنبوب الطرد المركزي ، وإجراء تعداد خلايا باستخدام عدادة الكريات أو خلية أخرى العد الداخلي.
- في الاستعداد لتصيب الخلايا مع صانعالفيروس ، أولا تحديد العدد الكلي للخلايا المصابة ويكون لحساب حجم تعليق الفيروس اللازمة لتحقيق تعدد المطلوب من العدوى (وزارة الداخلية) (5-10 الجزيئات المعدية في الخلية).
- تمييع الفيروس في HBSS بواسطة pipeting بعناية كمية مناسبة من التعليق الفيروس إلى وحدة تخزين من قبل aliquoted HBSS في أنبوب مل microcentrifuge 1.8. 50 ميكرولتر من HBSS لكل بئر من الخلايا في مجموعها مناسبة.
- تفريق الخلايا pipeting لهم صعودا ونزولا في أنبوب بهم ، ثم الماصة حجم اللازمة لتحقيق 400،000 الخلايا لكل بئر من الآبار في تعليق لوحة الثقافة 6 - جيدا.
- إضافة الحجم المناسب من الفيروس المخفف لكل بئر إلى تحقيق المنشود وزارة الداخلية.
- إضافة إلى كل بئر المتوسطة لتحقيق حجم يصل الإجمالي إلى 1.7 مل.
- وضع لوحة على شاكر المداري داخل الحاضنة. تعيين شاكر على إعداد منخفض بحيث المتوسطة يغسل بلطف حول الآبار (~ 100 دورة في الدقيقة). السماح للخلايا لaggregaالشركة المصرية للاتصالات ل24-36 ساعة. وينبغي تشكيل المجاميع التي يبلغ قطرها التقريبي لل75-175 ميكرون.
3. تغليف الخلايا في PEGDM
- قد تكون مغلفة الخلايا كما تشتت (الخطوة 2.4) أو التجميع التالية (الخطوة 2.10). منذ PEGDM السلائف حل هيدروجيل هو السائل ، قد تميل إلى تسوية الخلايا قبل يشابك وتشكيل هيدروجيل. إذا كان من المتوقع أن تحدث تسوية بسرعة ، كما هو الحال مع المجاميع الكبيرة ، قد يكون من المفيد لانتاج هيدروجيل في خطوتين بحيث تستقر الخلايا إلى الطائرة المركزية للهلام. ويرد التوليف هيدروجيل خطوة واحدة الإجراء المناسب لخلايا متفرقة (الشكل 2) ، ويظهر الإجراء على مرحلتين وكذلك (الشكل 3) ومفصلة أدناه (3،2-3،9).
- إنشاء السفينة التي سيتم تشكيلها في هيدروجيل بقطع رأس مدبب الخروج من حقنة من البلاستيك 1 مل ووضعه في نهاية المطاف فتح في رفوف.
- الماصة 20 ميكرولتر من PEGDM متفاعل للضوء ذلكlution في النهاية المفتوحة للحقنة على الغواص التأكد من حجم يغطي سطح المكبس بأكمله. ضبط المكبس بزيادات صغيرة لتحقيق سطح السائل المسطحة.
- وضع الماصة في رف رف وموقف تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية (365nm ، ~ 7 ميغاواط / سم 2) لحوالي 8 دقائق للسماح لليشابك هيدروجيل. خلال هذا الوقت ، قد بدأت التحضير للخلايا
- الماصة مجلد يحتوي على العدد المطلوب من الخلايا / المجاميع في أنبوب 1.8 مل microcentrifuge ، وكأب ، والطرد المركزي في أنبوب 130 جرام لمدة 5 دقائق.
- باستخدام micropipettor ، إزالة بعناية وسائل الإعلام من دون إزعاج بيليه الخلية في طرف الأنبوب. رئيسا وسائل الاعلام النهج بيليه ، فإنه قد يكون من المفيد استخدام الدقيقة ، 10 ميكرولتر طرف الماصة.
- resuspend بلطف بيليه الخلية في 20 ميكرولتر من محلول PEGDM متفاعل للضوء (استخدام طرف الماصة واسعة الفم إذا كان يعمل مع المجاميع) وإضافة تعليق الخلية إلى حقنة على رأس اله crosslinked سابقا جزء هيدروجيل.
- فضح المحقنة إلى 8 دقائق إضافية من الأشعة فوق البنفسجية لاستكمال بناء هيدروجيل. عند الانتهاء ، يجب أن تكون خلايا مغلفة بشكل كامل في هيدروجيل اسطواني الشكل (3).
- إخراج هيدروجيل من المحاقن وعلى 1 مل من HBSS في البئر من 24 لوحة ليغسل جيدا لفترة وجيزة من هلام. نقل الجل إلى 1 مل من وسائل الإعلام في البئر من 24 لوحة جيدا والثقافة وفقا للشروط المطلوبة.
4. تتبع نقص الأكسجة
- في أي نقطة خلال الصور ، والثقافة الخلايا باستخدام المجهر الفلورسنت لتعقب بدء إشارات ميتة. اعتمادا على ما يجري تصويرها يمكنك الصورة في لوحة متعددة جيدا أو نقل الجل على شريحة المجهر قبل وضعها على المسرح المجهر. ويتم تحقيق الإثارة ذروتها الأحمر التاءات في 556nm والانبعاثات ذروتها في 586nm. الانبعاثات المكثفة إلى حد ما وبالتالي photobleaching لم observإد أن يكون مشكلة. الفارق الزمني بين الشروع في إنتاج البروتين وأول إشارة الكشف عن ما يقرب من 12 ساعة. إشارة محددة بما فيه الكفاية لتحديد الخلايا الفردية إشارات ، ولكن القرار قد لا تكون كافية لتحديد الخلايا توطين الإشارة. في الخلايا مما يشير ، يلاحظ عادة إشارة بشكل موحد في جميع أنحاء السيتوبلازم. ويمكن الإشارة أيضا زيادة كثافة مع التعرض لنقص الأكسجة الموسعة ، على الرغم من أننا حتى الآن لم يحدد تماما ما إذا كان هذا يرجع إلى زيادة البروتين التعبير ، عموما تراكم البروتين ، أو تأخر نضج البروتين.
5. ممثل النتائج
ويبين المثال ممثل MIN6 المجاميع مغلفة في هيدروجيل PEG في الشكل 4. فإن جل crosslinked تكون صلبة في جميع أنحاء ، آخذا شكل السفينة التي كان يؤديها في رد الفعل. وهلام مع أسطح سلسة الخارجي هو الأفضل لزرع للمساعدة في منع إعادة جسم غريبsponse. في هلام ، ينبغي المجاميع الخلية المغلقة بالكامل في المصفوفة وتوزيعها متجانس للسماح لنقل المواد الغذائية على نحو أفضل.
والصور المصورة ممثل يشير ميتة في MIN6 المجاميع في الشكل 5. وكانت متطابقة مثقف MIN6 المجاميع المصابة بالفيروس في علامة O 20 ٪ إما 2 (5A) أو 1 ٪ O 2 (5B) لمدة 44 ساعة قبل التقاط الصورة.
الشكل 1. التخطيطي لنشاط نظامنا علامة نقص الأكسجة. الفيروسة الغدانية الإدراج من الجين التاءات DR الأحمر والمنبع المروج تعليم حقوق الإنسان يسمح لنقص الأكسجة الناجم عن إنتاج بروتين فلوري تحت سيطرة مؤسسة الحرمين - 1.
الشكل 2. فرقت الإجرائية الرسم البياني للتغليف خطوة واحدة من الخلايا في MIN6 هيدروosslinked هيدروجيل PEGDM. لكل جيل ، وعلقت الخلايا الموزعة في 40μL من macromer حل PEGDM متفاعل للضوء. يتم وضع هذا في حقنة a 1mL مقطوعة الرأس ، ويتم تشكيل هيدروجيل تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية 365nm بعد 10-12 دقيقة. عند الانتهاء ، يتم إزالة القرص هيدروجيل من المحاقن ، وغسلها ووضعها في لوحة متوسطة مملوءة جيدا لحضانة.
الشكل 3. الإجرائية الرسم البياني للتغليف المزدوج خطوة من الخلايا MIN6 مجمعة في هيدروجيل PEGDM crosslinked. لكل جيل ، يتم تشكيل لأول مرة نصف هلام الأشعة فوق البنفسجية التي يشابك من 20μL من macromer حل PEGDM متفاعل للضوء لمدة 8 دقائق. وعلقت بعناية MIN6 المجاميع في 20μL إضافية من حل macromer متفاعل للضوء الذي يضاف على الجزء العلوي من هلام نصف قبل تشكيلها. يتم تشكيل هلام الكامل من قبل 8 دقائق من التعرض للأشعة فوق البنفسجية إضافية مع المجاميع مغلفة بشكل كامل في الإنسيالطائرة من هلام.
الشكل 4. صورة من هيدروجيل 40μL 20X تحت التكبير. وينظر بشكل واضح MIN6 المجاميع (~ 400000 مجموع الخلايا) داخل هلام. قطرها حوالي 6mm هيدروجيل هو (شريط 1MM =).
الشكل 5. نقص الأكسجين في الخلايا مما يشير نيون MIN6 مجمعة في هيدروجيل PEGDM. الخلايا التي تم تغليفها ثم توضع في الحضانة عند 20 ٪ O 2 لمدة 44 ساعة لا تعرض إشارات نقص الأكسجة (أ) في حين أن الخلايا التي تم تغليفها ثم حضنت في 2 ٪ O 2 لمدة 44 ساعة شاشة واضحة ، إشارة في كل مكان. (شريط 100μm =) (ب).
Discussion
الطريقة المعروضة هنا تقدم تقنية سريعة وبسيطة لتغليف الخلايا في هيدروجيل الربط مع استخدام الحد الأدنى من الشروط غير الفسيولوجية. PEG يمثل مادة التغليف مفيدة جدا للتوافق مع الحياة وسهولة التعديل. اختلاف بسيط من نسبة الربط في حل متفاعل للضوء ، على سبيل المثال ، قد يتم استخدامها لضبط الخواص الميكانيكية ، مثل معامل الضغط ، وخصائص النقل عن طريق حجم المسام. أيضا ، يتم تعديل الربط بسهولة عن طريق إضافة السلاسل الجانبية. PEG الهلاميات المائية ، وبالتالي ، تمثل كل جهاز السريرية واعدة منصة مرنة للأبحاث في المختبر
كما تم تتبع طريقة لنقص الأكسجة في الربط بين الخلايا مغلفة المقدمة. هذه الطريقة مفيدة للكشف عن نقص الأكسجة بساطة وتجنب الحاجة للتضحية خلايا الفائدة. ويمكن تطبيق هذه التقنية لمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا في مجموعة متنوعة من الظروف مما يجعلنا فيefulness اسعة. على سبيل المثال ، قد يتم تعقب نقص الأكسجة وتلميحا عن تمايز الخلايا الجذعية في الثقافات الجذعية micromass الخلية. ومع ذلك ، لا يمكن إلا أن تطبق هذه الطريقة لتفريق نظم الخلية أو النظام الذي يتم تجميعها في وقت لاحق فرقت الخلايا. أيضا ، قد كشف للإشارة الفلورسنت يكون من الصعب في الأنسجة أكبر أو أكثر كثافة.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
بفضل المختبر Anseth كريستي من جامعة كولورادو في بولدر لتوريد بسخاء MIN6 الخلايا. وقد تم توفير التمويل لهذا المشروع من قبل جبهة الخلاص الوطني.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEG | Sigma-Aldrich | 309028-500G | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma-Aldrich | 276685-100ML | |
| Microwave | Emerson | MW8784SB | |
| Vortexer | Scientific Industries Inc. | SI-A236 | |
| Methylene Chloride | Sigma-Aldrich | D65100-1L | |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136-1L | |
| Dialysis Tubing | Spectrum | 132640 | |
| Laboratories | |||
| Freezer | |||
| Lyophilizer | Labconco Corp. | 7670521 | |
| Vacuum pump | Welch Allyn | 8917Z-01 | |
| Irgacure 2959 | Ciba-Geigy | 029891301PS04 | |
| HBSS | Mediatech, Inc. | 21-022-CV | |
| Syringe Filter | VWR international | 28145-477 | |
| RPMI 1640 | Mediatech, Inc. | * | *custom formulation |
| FBS | PAA Laboratories | A15-351 | |
| Penicillin-Streptomycin | Mediatech, Inc. | 30-002-CI | |
| Amphotericin B | Mediatech, Inc. | 30-003-CF | |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3597 | Napco Series 8000 WJ w/ O2 suppression |
| Trypsin EDTA | Mediatech, Inc. | 25-052-CI | |
| Orbital Shaker | VWR international | 12620-926 | |
| UV Lamp | Sanyo Denki | FLR40SBLB/M | Holds two 40W, 365nm blacklight blue UV bulbs |
| Centrifuge | Eppendorf | 5811 000.010* | *order number. Model 5810 R |
| Microscope | Nikon Instruments | TI-ND6-PFS | With filterset for 556nm excitation/ 586nm emission |
References
- Kelly, W., Lillehei, R., Merkel, F., Idezuki, Y., Goetz, F. Allotransplantation of the pancreas and duodenum along with the kidney in diabetic nephropathy. Surgery. 61, 827-837 (1967).
- Shapiro, J. A. M., Ricordi, C., Hering, B. J., Auchincloss, H., Lindblad, R., Robertson, R. P., Secchi, A., Brendel, M. D., Berney, T., Brennan, D. C., Cagliero, E., Alejandro, R., Ryan, E. A., DiMercurio, B., Morel, P., Polonsky, K. S., Reems, J., Bretzel, R. G., Bertuzzi, F., Froud, T., Kandaswamy, R., Sutherland, D. E. R., Eisenbarth, G., Segal, M., Preiksaitis, J., Korbutt, G. S., Barton, F. B., Viviano, L., Seyfert-Margolis, V., Bluestone, J., Lakey, J. R. T. International trial of the Edmonton Protocol for islet transplantation. N. Eng. J. Med.. 355, 1318-1330 (2006).
- Sun, A. M., O'Shea, G. M., Goosen, M. F. Injectable microencapsulated islet cells as a bioartificial pancreas. Appli. Biochem. Biotechnol. 10, 87-99 (1984).
- Iwata, H., Amemiva, H., Matsuda, T., Takano, H., Hayashi, R., Akutsu, T. Evaluation of microencapsulated islets in agarose gel as bioartificial pancreas by studies of hormone secretion in culture and by xenotransplantation. Diabetes. 39, 224-225 (1989).
- Zhang, W. J., Laue, C., Hyder, A., Schrezenmeir, J. Purity of alginate affects the viability and fibrotic overgrowth of encapsulated porcine iselt xenografts. Transplant Proc. 33, 3517-3519 (2001).
- Lin-Gibson, S., Bencherif, S., Cooper, J. A., Wetzel, S. J., Antonucci, J. M., Vogel, B. M., Horkay, F., Washburn, N. R. Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels. Biomacromolecules. 5, 1280-1287 (2004).
- Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled β-cell microenvironments. Acta. Biomater. 2, 1-8 (2006).
- Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function. J. Biomed. Mater. Res. A. 90, 720-729 (2009).
- Bryant, S. J., Anseth, K. S. Hydrogel properties influence ECM production by chondrocyte photoencapsulated in poly(ethylene glycol) hydrogels. J. Biomed. Mater. Res. 59, 63-72 (2001).
- Bryant, S. J., Nuttelman, C. R., Anseth, K. S. Cytocompatibility of UV and visible light photoinitiating systems on cultured NIH/3T3 fibroblasts in vitro. J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 11, 439-457 (2000).
- Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. Effect of oxygen on isolated pancreatic tissue. Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs. 35, 739-741 (1989).
- Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. Effect of hypoxia on insulin secretion by isolated rat and canine islets of Langerhans. Diabetes. 42, 12-21 (1993).
- De Groot, M., Schuurs, T. A., Keizer, P. P. M., Fekken, S., Leuvenink, H. G. D., van Schilfgaarde, R. Response of encapsulated rat pancreatic islets to hypoxia. Cell Transplant. 12, 867-875 (2003).
- Fancy, M. L., Topiwala, R., Sahai, P., S,, Blanchette, J. O. Correlating hypoxia with insulin secretion using a fluorescent hypoxia detection system. J. Biomed. Mater. Res. B. 97, 148-155 (2011).
- Webb, J. D., Coleman, M. L., Pugh, C. W. H. ypoxia hypoxia-inducible factors (HIF), HIF hydroxylases and oxygen sensing. Cell. Mol. Life Sci. 66, 3539-3554 (2009).
