Summary
En metode til foto-indkapsling af celler i en krydsbundet PEG hydrogel er beskrevet. Hypoxisk signalering inden indkapslet murine insulinom (MIN6) aggregater er sporet ved hjælp af et fluorescerende markør system. Dette system giver mulighed for seriel undersøgelse af celler i en hydrogel stillads og korrelation på hypoksisk signalering med ændringer i celle fænotype.
Abstract
I Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruktion af pancreas β-celler resulterer i tab af insulin produktion og potentielt dødelige hyperglykæmi. Som en alternativ behandlingsmulighed til eksogen insulin injektion, er transplantation af funktionelle bugspytkirtlen væv er blevet udforsket 1,2. Denne fremgangsmåde giver løfte om en mere naturligt, langsigtet genopretning af normoglycemia. Beskyttelse af donor væv fra værtens immunsystem er nødvendig for at forhindre afstødning og indkapsling er en metode, der anvendes til at bidrage til at nå dette mål.
Biologisk-afledte materialer, såsom alginat 3 og agarose 4, har været det traditionelle valg til kapsel konstruktion, men kan fremkalde inflammation eller fibrose overvækst 5, der kan hindre næringsstoffer og ilt transport. Alternativt, syntetiske poly (ethylen glycol) (PEG)-baseret hydrogeler er ikke-nedværdigende, let funktionaliserede, som findes på høj renhed,har kontrollerbar porestørrelse, og er ekstremt biokompatible, 6,7,8. Som en ekstra fordel, kan PEG hydrogeler dannes hurtigt i et enkelt foto-crosslinking reaktion, der ikke kræver anvendelse af ikke-fysiologiske temperaturer 6,7. En sådan procedure er beskrevet her. I crosslinking reaktion, UV nedbrydning af fotoinitiator, 1 - [4 - (2-Hydroxyethoxy)-phenyl]-2-hydroxy-2-methyl-1-propan-1-on (Irgacure 2959), producerer frie radikaler, der angriber vinyl carbon-carbon-dobbeltbindinger af dimethacrylated PEG (PEGDM) inducerende crosslinking på kæden ender. Crosslinking kan opnås inden for 10 minutter. PEG hydrogeler konstrueret på en sådan måde, har vist sig positivt støtte celler 7,9, og den lave fotoinitiator koncentration og kortvarig udsættelse for UV-bestråling ikke er til skade for levedygtighed og funktion af de indkapslede væv 10. Mens vi methacrylat vores PEG med den metode, der er beskrevet nedenfor, kan PEGDM også dirgenvindes direkte købes fra leverandører som Sigma.
En naturlig konsekvens af indkapsling er isolation af celler fra en vaskulær netværk. Levering af næringsstoffer, især ilt, er derfor reduceret og begrænset af diffusion. Dette reducerede ilt tilgængelighed kan især betydning β-celler, hvis insulin sekretorisk funktion er meget afhængig af ilt 11-13. Capsule sammensætning og geometri vil også påvirke diffusion priser og længder for ilt. Derfor har vi også beskrive en teknik til at identificere hypoxisk celler inden for vores PEG kapsler. Infektion af cellerne med et rekombinant adenovirus giver mulighed for en fluorescerende signal, der skal produceres, når intracellulære hypoxi-inducerende faktor (HIF) veje aktiveres 14. Da HIFs er de primære regulatorer af transkriptionel respons på hypoxi, de repræsenterer et ideelt mål markør til påvisning af hypoxisk signalering 15. Denne fremgangsmåde giver mulighed for nem og hurtig detektion af hypoxic celler. Kortfattet, at adenovirus har sekvens for et rødt fluorescerende protein (Ds Red DR fra Clontech) under kontrol af en hypoxi-responderende element (HRE) trimeren. Stabilisering af HIF-1 ved lavt iltindhold vil drive transskription af den fluorescerende protein (figur 1). Yderligere oplysninger om opførelsen af denne virus er blevet offentliggjort tidligere 15. Den virus er gemt i 10% glycerol ved -80 ° C som mange 150 μL aliquoter i 1,5 ml centrifugeglas ved en koncentration på 3,4 x 10 10 PFU / ml.
Tidligere undersøgelser i vores laboratorium har vist, at MIN6 celler indkapslet som aggregater bevare deres levedygtighed i hele 4 uger af kultur i 20% ilt. MIN6 aggregater kulturperler på 2 eller 1% ilt viste både tegn på nekrotiske celler (stadig ca 85-90% levedygtige) ved farvning med ethidiumbromid samt morfologiske ændringer i forhold til celler i 20% ilt. Den glatte kugleform aggregater vises på 20% var lost og aggregater syntes mere som uorganiserede grupper af celler. Mens den lave ilt-stress ikke er årsag til et markant fald i levedygtighed, er det klart påvirker MIN6 sammenlægning og fungere som målt ved glukose-stimuleret insulinsekretion 15. Western blot analyse af indkapslede celler i 20% og 1% ilt viste også en signifikant stigning i HIF-1α for celler dyrket i den lave ilt-forhold, som korrelerer med udtryk for DsRed DR protein.
Protocol
1. PEGDM syntese og fotoaktive PEGDM macromer løsning forberedelse
- Afvejes 2g i PEG (lineær, 10.000 Da) i et 40 ml hætteglas med en hård plastik hætte.
- Tilsæt ca 308μL af methacrylsyre anhydrid og løst låg hætteglasset.
- Mikroovn hætteglasset på høje i 2 minutter i en standard indenlandsk mikrobølgeovn. Iført varme handsker, grundigt vortex hætteglasset, så mikroovn på høje for yderligere 5 minutter.
- Kort Lad hætteglasset cool nok til at blive håndteret med handsker. Tag hætten af det og tilsæt langsomt methylenchlorid mens hvirvlende hætteglasset. Tilsæt så meget, så den løsning synes klar og homogen, vortex prøven efter behov. Den samlede volumen af methylenchlorid anvendte chlorid skal være 1,5 - 2 ml.
- Bundfald PEGDM i 200 ml koldt, rørte diethylether ved at tilføje løsningen dråbevis.
- Saml PEGDM ved vakuumfiltrering og lad det tørre.
- Opløs PEGDM i en passende mængdedeioniseret vand (typisk 100 -150 ml).
- Dialyze løsningen mod deioniseret vand i 5 dage i dialyse rør, med en molekylvægt cut-off på 1.000 Da. Udskift vandet én gang dagligt.
- Alikvot løsningen i passende beholdere og fryses ved -80 ° C natten over. Lyophilize løsningen i 4 dage for at give en renset hvid PEGDM pulver. Opbevar pulver ved 4 ° C, når det ikke er i brug.
- For at forberede en fotoaktive PEGDM løsning, først forberede en 0,5 vægtprocent fotoinitiator stamopløsning ved at opløse Irgacure 2959 i deioniseret vand. Vortex løsningen og opbevar den i mørke.
- Forbered en 10 vægt% PEGDM og 0,025 vægt% Irgacure 2959 opløsning i Hanks Balanced Salt Solution (HBSS). Vortex grundigt for at sikre opløsning af PEGDM. Vi typisk forbereder 1ml af denne løsning på et tidspunkt.
- Sterilisere løsning ved at filtrere det gennem et 0,2 μm sprøjte filtret ind i en 1,8 ml mikrocentrifugerør. Wrap røret i alufolieog opbevares ved 4 ° C
2. Kultur, infektion, og sammenlægning af MIN6 celler
- MIN6 celler dyrkes i RPMI 1640 medium suppleret med 10% FBS, 7mm glukose, 100 enheder / ml penicillin / streptomycin, og 0,5 mikrogram / ml amphotercin B i en fugtig miljø ved 37 ° C og 5% CO 2.
- For at frigøre celler fra den behandlede kultur kolbe overflade, opsug medium, skylles de celler med 37 ° C calcium / magnesium-fri HBSS, opsug HBSS, derefter tilsættes 2 ml 37 ° C trypsin-EDTA-opløsning og lade cellerne til inkuber i 3 minutter.
- Fast krukke siden af kolben til at slå cellerne fri, hvorefter der tilsættes 8 ml 37 ° C, medium og kraftigt pipette cellesuspensionen op og ned pas på ikke at indføre bobler.
- Pipette cellerne i en steril 15 ml centrifugeglas, og udføre en celletallet ved hjælp af en hemocytometer eller en anden celle tælling procedure.
- I forbindelse med udarbejdelsen at inficere celler med makervirus, først afgøre det samlede antal celler at være smittet og beregne mængden af virussuspension kræves for at opnå den ønskede mangfoldighed af infektion (MOI) (50 til 100 infektiøse partikler per celle).
- Fortynd virus i HBSS ved omhyggeligt pipeting den rette mængde virussuspension i en pre-alikvoteres volumen HBSS i en 1,8 mL mikrocentrifugerør. 50 μL af HBSS per brønd på sammenlægning af cellerne er passende.
- Sprede celler ved pipeting dem op og ned i deres rør, og derefter pipetteres den nødvendige volumen til at opnå 400.000 celler pr langt ind i brønde på en 6-vel suspension kultur pladen.
- Tilsæt passende mængde af fortyndet virus til hver brønd for at opnå den ønskede MOI.
- Tilføj medium til hver brønd for at bringe den samlede mængde på op til 1,7 ml.
- Pladen anbringes på en orbitalryster inde i kuvøse. Sæt shaker på en lav indstilling, så mediet blidt vasker omkring brønde (~ 100 rpm). Lad cellerne til aggregate for 24-36 timer. Aggregater med en omtrentlig diameter på 75-175 μm skal dannes.
3. Indkapsling af celler i PEGDM
- Celler kan være indkapslet som en spredning (trin 2.4) eller som følge af sammenlægning (trin 2.10). Siden hydrogel forløber PEGDM løsning er en væske, kan cellerne tendens til at bosætte sig forud for crosslinking og hydrogel dannelse. Hvis afvikling forventes at finde sted hurtigt, som med større aggregater, kan det være en fordel at producere den hydrogel i to trin, således at cellerne afregne til en central plan gelen. En et-trins-hydrogel syntese måde passende for spredt celler vises (Figur 2) og de to-trins procedure er vist så godt (Figur 3) og detaljeret nedenfor (3,2-3,9).
- Opret et fartøj, hvor hydrogelen vil blive dannet ved at skære den koniske spids ud af en 1 ml plastik sprøjte og placere den åbne ende op i et rack.
- Afpipettér 20 μL af fotoaktive PEGDM såresolution i den åbne ende af sprøjten på stemplet og sørg for lydstyrken dækker hele stemplet overfladen. Juster stemplet i små intervaller for at opnå en flad flydende overflade.
- Sæt pipetten i rack og placer rack under en UV-lampe (365 nm, ~ 7 mW / cm 2) i ca 8 minutter til at give mulighed for hydrogel crosslinking. I løbet af denne tid, kan udarbejdelse af cellerne være begyndt
- Afpipettér en volumen, som indeholder det ønskede antal celler / aggregater i et 1,8 ml mikrocentrifugerør, cap, og centrifuger røret ved 130 gi 5 minutter.
- Ved hjælp af en micropipettor, forsigtigt fjerne mediet uden at forstyrre cellepelleten på spidsen af tuben. Da medierne hovedet nærmer sig pellet, kan det være nyttigt at bruge en finere, 10 μL pipette spids.
- Forsigtigt resuspender cellepelleten i 20 μL af fotoaktive PEGDM løsning (brug en bred åbning pipette spids hvis der arbejdes med tilslagsmaterialer) og tilsæt cellesuspension til sprøjten på toppen af the tidligere krydsbundet hydrogel del.
- Expose sprøjten til yderligere 8 minutter af UV-lys til at fuldføre bygningen af hydrogel. Når du er færdig, skal cellerne være fuldt indkapslet i det cylindriske hydrogel (Figur 3).
- Skub hydrogel fra sprøjten og ind i 1 mL HBSS i brønden af en 24-brønds plade til kortvarigt at vaske gel. Overfør gel til 1 ml af medier i brønd i en 24-brønds plade og kultur under de ønskede forhold.
4. Hypoxi sporing
- På ethvert tidspunkt under den kultur, billedet cellerne ved hjælp af fluorescerende mikroskopi til at spore indledningen af hypoxisk signalering. Afhængigt af, hvad der bliver afbildet du kan billedet i multi-brønds plade eller overføre gel til et objektglas forud for placering på mikroskop scenen. Peak excitation af Ds Red opnås ved 556nm og den maksimale emission sker på 586nm. Emission er temmelig intens, og dermed fotoblegning har ikke været obsered at være problematisk. Tidsforsinkelsen mellem initiering af protein produktion og første signal detektion er cirka 12 timer. Signal er specifik nok til at identificere individuelle signalering celler, men beslutningen kan være utilstrækkelig til bestemmelse af intracellulær signal lokalisering. I signalering celler, er signalet typisk observeres ensartet i hele cytoplasma. Signal intensitet kan også øge med udvidet eksponering for hypoxi, selvom vi endnu ikke er fuldt fastlagt, hvis dette skyldes øget protein udtryk, samlet protein ophobning, eller forsinket protein modning.
5. Repræsentative resultater
Et repræsentativt eksempel på MIN6 aggregater indkapslet i en PEG hydrogel er vist i figur 4. Den krydsbundet gel vil være fast hele vejen igennem, tager form af fartøjet, hvor reaktionen blev udført. En gel med glatte udvendige overflader er at foretrække frem for implantation at støtte forebyggelse af et fremmedlegeme rege indsats. Inden for gel, bør celle aggregater være helt lukket i matrixen og homogent distribueret at give mulighed for bedre stoftransport.
Repræsentant billeder af hypoksisk signalering i MIN6 aggregater er afbilledet i figur 5. Identiske MIN6 aggregater inficeret med markøren virus blev dyrket i enten 20% O 2 (5a) eller 1% O 2 (5b) for 44 timer, før billedoptagelse.
Figur 1. Skematisk af aktiviteten i vores iltmangel markør system. Adenoviral indsættelse af DS Red DR-genet og upstream HRE initiativtageren giver mulighed for hypoxi-induceret produktion af fluorescerende protein under kontrol af HIF-1.
Figur 2. Proceduremæssige Rutediagram for enkelt-trin indkapsling af dispergeret MIN6 celler i en CRosslinked PEGDM hydrogel. For hver gel, er de spredte celler suspenderet i 40μL af fotoaktive PEGDM macromer løsning. Dette er placeret i en halshugget 1ml sprøjten og hydrogel er dannet under 365 nm UV-lys efter 10-12 minutter. Ved afslutningen, er hydrogel disken fjernet fra sprøjten, vaskes og placeres i en mellemstor fyldt brønds plade til inkubation.
Figur 3. Proceduremæssige Rutediagram for dual-trins indkapsling af aggregerede MIN6 celler i en krydsbundet PEGDM hydrogel. For hver gel, er en halv-gel først dannet af UV crosslinking af 20μL af fotoaktive PEGDM macromer løsning til 8 minutter. MIN6 aggregater er omhyggeligt ophængt i et ekstra 20μL af fotoaktive macromer løsning, som er tilføjet på toppen af præformerede halv-gel. Den fulde gel er dannet af yderligere 8 minutter af UV-eksponering med aggregater fuldt ud indkapslet i den medialefly af gelen.
Figur 4. Billede af en 40μL hydrogel under 20x forstørrelse. MIN6 aggregater (~ 400.000 alt celler) er tydeligt ses i gelen. Hydrogel diameter er ca 6mm (bar = 1 mm).
Figur 5. Fluorescerende hypoxi signalering i aggregeret MIN6 celler i en PEGDM hydrogel. Celler, der var indkapslet og derefter placeres i inkubation ved 20% O 2 i 44 timer vises ikke hypoksi signalering (a), mens celler, der var indkapslet inkuberes derefter i 2% O 2 i 44 timer displayet er tomt, allestedsnærværende signal. (Bar = 100μm) (b).
Discussion
Metoden præsenteres her tilbyder en hurtig og enkel teknik til celle indkapsling i en PEG hydrogel med minimal brug af ikke-fysiologiske betingelser. PEG være et meget nyttigt indkapsling materialet til dets biokompatibilitet og nem ændring. Enkel variation af PEG procentdel i fotoaktive løsning, for eksempel kan bruges til at justere mekaniske egenskaber, såsom trykstyrke modulus, og transport egenskaber gennem pore størrelse. Også, PEG let modificeret ved tilsætning af sidekæder. PEG hydrogeler, derfor er både en lovende klinisk enhed og en fleksibel platform for in vitro-forskning
En metode til sporing hypoxi i PEG-indkapslede celler er også blevet præsenteret. Denne metode er nyttig for enkelheden i hypoxi opdagelse og for at undgå behovet for at ofre cellerne af interesse. Teknikken kan anvendes på en række forskellige typer af celler i en række betingelser, der gør sit osefulness bred. For eksempel kan hypoxi som et kriterium til stamceller differentiering spores i stamcelle micromass kulturer. Imidlertid kan denne metode kun blive anvendt til at sprede celle systemer eller system, hvor spredte celler senere aggregeres. Desuden kan detektion af fluorescerende signal være vanskeligt i større eller mere fintmasket væv.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Takket være Kristi Anseth Lab ved University of Colorado, Boulder for generøst at levere MIN6 celler. Finansieringen af dette projekt har været leveret af NSF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEG | Sigma-Aldrich | 309028-500G | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma-Aldrich | 276685-100ML | |
| Microwave | Emerson | MW8784SB | |
| Vortexer | Scientific Industries Inc. | SI-A236 | |
| Methylene Chloride | Sigma-Aldrich | D65100-1L | |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136-1L | |
| Dialysis Tubing | Spectrum | 132640 | |
| Laboratories | |||
| Freezer | |||
| Lyophilizer | Labconco Corp. | 7670521 | |
| Vacuum pump | Welch Allyn | 8917Z-01 | |
| Irgacure 2959 | Ciba-Geigy | 029891301PS04 | |
| HBSS | Mediatech, Inc. | 21-022-CV | |
| Syringe Filter | VWR international | 28145-477 | |
| RPMI 1640 | Mediatech, Inc. | * | *custom formulation |
| FBS | PAA Laboratories | A15-351 | |
| Penicillin-Streptomycin | Mediatech, Inc. | 30-002-CI | |
| Amphotericin B | Mediatech, Inc. | 30-003-CF | |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3597 | Napco Series 8000 WJ w/ O2 suppression |
| Trypsin EDTA | Mediatech, Inc. | 25-052-CI | |
| Orbital Shaker | VWR international | 12620-926 | |
| UV Lamp | Sanyo Denki | FLR40SBLB/M | Holds two 40W, 365nm blacklight blue UV bulbs |
| Centrifuge | Eppendorf | 5811 000.010* | *order number. Model 5810 R |
| Microscope | Nikon Instruments | TI-ND6-PFS | With filterset for 556nm excitation/ 586nm emission |
References
- Kelly, W., Lillehei, R., Merkel, F., Idezuki, Y., Goetz, F. Allotransplantation of the pancreas and duodenum along with the kidney in diabetic nephropathy. Surgery. 61, 827-837 (1967).
- Shapiro, J. A. M., Ricordi, C., Hering, B. J., Auchincloss, H., Lindblad, R., Robertson, R. P., Secchi, A., Brendel, M. D., Berney, T., Brennan, D. C., Cagliero, E., Alejandro, R., Ryan, E. A., DiMercurio, B., Morel, P., Polonsky, K. S., Reems, J., Bretzel, R. G., Bertuzzi, F., Froud, T., Kandaswamy, R., Sutherland, D. E. R., Eisenbarth, G., Segal, M., Preiksaitis, J., Korbutt, G. S., Barton, F. B., Viviano, L., Seyfert-Margolis, V., Bluestone, J., Lakey, J. R. T. International trial of the Edmonton Protocol for islet transplantation. N. Eng. J. Med.. 355, 1318-1330 (2006).
- Sun, A. M., O'Shea, G. M., Goosen, M. F. Injectable microencapsulated islet cells as a bioartificial pancreas. Appli. Biochem. Biotechnol. 10, 87-99 (1984).
- Iwata, H., Amemiva, H., Matsuda, T., Takano, H., Hayashi, R., Akutsu, T. Evaluation of microencapsulated islets in agarose gel as bioartificial pancreas by studies of hormone secretion in culture and by xenotransplantation. Diabetes. 39, 224-225 (1989).
- Zhang, W. J., Laue, C., Hyder, A., Schrezenmeir, J. Purity of alginate affects the viability and fibrotic overgrowth of encapsulated porcine iselt xenografts. Transplant Proc. 33, 3517-3519 (2001).
- Lin-Gibson, S., Bencherif, S., Cooper, J. A., Wetzel, S. J., Antonucci, J. M., Vogel, B. M., Horkay, F., Washburn, N. R. Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels. Biomacromolecules. 5, 1280-1287 (2004).
- Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled β-cell microenvironments. Acta. Biomater. 2, 1-8 (2006).
- Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function. J. Biomed. Mater. Res. A. 90, 720-729 (2009).
- Bryant, S. J., Anseth, K. S. Hydrogel properties influence ECM production by chondrocyte photoencapsulated in poly(ethylene glycol) hydrogels. J. Biomed. Mater. Res. 59, 63-72 (2001).
- Bryant, S. J., Nuttelman, C. R., Anseth, K. S. Cytocompatibility of UV and visible light photoinitiating systems on cultured NIH/3T3 fibroblasts in vitro. J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 11, 439-457 (2000).
- Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. Effect of oxygen on isolated pancreatic tissue. Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs. 35, 739-741 (1989).
- Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. Effect of hypoxia on insulin secretion by isolated rat and canine islets of Langerhans. Diabetes. 42, 12-21 (1993).
- De Groot, M., Schuurs, T. A., Keizer, P. P. M., Fekken, S., Leuvenink, H. G. D., van Schilfgaarde, R. Response of encapsulated rat pancreatic islets to hypoxia. Cell Transplant. 12, 867-875 (2003).
- Fancy, M. L., Topiwala, R., Sahai, P., S,, Blanchette, J. O. Correlating hypoxia with insulin secretion using a fluorescent hypoxia detection system. J. Biomed. Mater. Res. B. 97, 148-155 (2011).
- Webb, J. D., Coleman, M. L., Pugh, C. W. H. ypoxia hypoxia-inducible factors (HIF), HIF hydroxylases and oxygen sensing. Cell. Mol. Life Sci. 66, 3539-3554 (2009).
