Summary
तीन आयामी मैट्रिक्स कोशिकी में ट्यूमर सेल आक्रमण के मॉडल बेहतर प्रतिबिंबित
Protocol
1. फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ कोशिकाओं के रेट्रोवायरल लेबलिंग
- प्लेट 0.25 x 10 6 कोशिकाओं पर प्रति अच्छी तरह से एक 6-अच्छी तरह से बाहर रेट्रोवायरल पैकेजिंग कोशिकाओं (जैसे फीनिक्स) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) / DMEM में पकवान.
- Transfect रेट्रोवायरल डीएनए के साथ 48 घंटे के बाद कोशिकाओं कोशिकाओं 'निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार Effectene का उपयोग.
- कुओं दो बार मध्यम 24 घंटे के साथ बाद कुल्ला, तो 10% FBS / भी प्रति DMEM के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें.
- टिशू कल्चर में pipetting और 2 एमएल microcentrifuge ट्यूब को स्थानांतरित द्वारा पैक वायरस मध्यम 48 घंटे बाद लीजिए.
- 5 मिनट के लिए गोली किसी भी कोशिकाओं के लिए 1600 rpm पर अपकेंद्रित्र.
- -80 में एक स्वच्छ ट्यूब को सतह पर तैरनेवाला और दुकान हटाने डिग्री सेल्सियस
- Retrovirally transduced हो कक्ष से बाहर 1.5 x 10 5 एक छह अच्छी तरह से पकवान की अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं पर चढ़ाया जाता है और 37 ° रातोंरात सी पर एक humidified इनक्यूबेटर में रखा .
- अगले दिन, कोशिकाओं और विज्ञापन से मीडिया को दूरवायरस एक अच्छी तरह से 4 μl polybrene (2 मिलीग्राम / एमएल) के साथ पूरक शेयर की एक मिलीलीटर. इनक्यूबेटर में प्लेटें बदलें.
- 5-6 घंटे के लिए ऊष्मायन के बाद, 2 मिलीलीटर एक अच्छी तरह से 10% FBS / DMEM और जोड़ने प्लेटें 37 में प्रतिस्थापित कर रहे हैं ° inbubator सी रातोंरात.
- अगले दिन, मीडिया की जगह है और कोशिकाओं को उपयुक्त चयनात्मक मीडिया को जोड़ने से पहले 24 घंटे की अनुमति.
- जब मिला हुआ है (जो कोशिकाओं के विकास दर, और रेट्रोवायरल transduction की क्षमता पर निर्भर करता है, लेकिन आमतौर पर 4-14 दिनों से लेता है), एक संदर्भ के रूप में का उपयोग कर प्रतिदीप्ति गैर transduced कोशिकाओं के लिए कोशिकाओं और सॉर्ट trypsinize इकट्ठा, और पूल कोशिकाओं के साथ प्रतिदीप्ति गैर transduced -80 कोशिकाओं और फ्रीज aliquots से अधिक डिग्री सेल्सियस भविष्य के उपयोग के लिए.
2. प्रतिलोम Matrigel आक्रमण परख
- धीरे धीरे बर्फ (चित्र 1 ए) पर पूरा Matrigel (यानी वृद्धि कारकों से युक्त) के एक विभाज्य पिघलना.
- Defrosted एक बार बर्फ के ठंडे पीबीएस में पतला Matrigel 01:01 (साथ किसी भी अन्य अतिरिक्त के साथपीबीएस में 2x एकाग्रता के कमजोर पड़ने से पहले उपचार, चित्रा 1 बी). यह आसान polymerization के पहले Matrigel संभाल करने के लिए करते हैं, plasticware (उदाहरण के लिए, टिप्स, ट्यूबों, आदि) बर्फ का ठंडा होना चाहिए.
- सम्मिलित करें के रूप में कई 8 माइक्रोन ताकना 6.5 मिमी uncoated व्यास के रूप में एक 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट के कुओं में आवश्यक Transwells, तो ध्यान से कुओं में पतला Matrigel 100 μl विंदुक और छोड़ने के लिए 37 ~ 30 मिनट के लिए सेते ° सी जमना करने के लिए (चित्रा 1C).
- इस समय के दौरान तैयार करने के लिए, एक या एक से अधिक fluorescently लेबल के बीच में 1 से 4 x 10 मिलीलीटर प्रति 5 कोशिकाओं, कोशिका लाइन के आधार पर प्रत्येक पूर्व इलाज (ई. जी siRNA, नशीली दवाओं के उपचार.) हालत से उनके सामान्य विकास में सेल निलंबन मध्यम (चित्रा 1D).
- जब Matrigel, फिल्टर (चित्रा 1E) के ऊपर की ओर का सामना करना पड़ नीचे पर और विंदुक सेल निलंबन के 100 μl Transwells पलटना जम गया है.
- ध्यान से एक 24 अच्छी तरह से ऊतक के आधार के साथ Transwells कवरसंस्कृति की थाली, सेल निलंबन (चित्रा 1F) की एक छोटी बूंद के साथ संपर्क बनाने.
- उल्टे राज्य में 4 घंटे के लिए थाली करने के लिए सेल लगाव (चित्रा 1G) के लिए अनुमति देने के लिए सेते हैं.
- इस समय के बाद, प्लेटें बारी सही साइड अप और 2 एक्स 1 मिलीलीटर सीरम मुक्त माध्यम (2A चित्रा) में अनुक्रमिक सूई से प्रत्येक Transwell धोने.
- एक अच्छी तरह से किसी भी दवाओं या उपचार की आवश्यकता युक्त तिहाई (चित्रा 2B) में Transwells छोड़ो.
- धीरे (25 एनजी / एमएल जी ई. EGF.) जम / Matrigel पीबीएस मिश्रण के शीर्ष पर Transwell में 10% की FBS / DMEM प्लस chemoattractant 100 μl पिपेट, 3-5 दिनों के लिए 37 पर ढक्कन और सेते जगह ° सी के साथ 5% सीओ 2 (चित्रा 2C).
3. धुंधला और दृश्य
- फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त कक्ष नीचे दिए गए चरणों का confocal माइक्रोस्कोपी से पहले छोड़ सकते हैं
- गैर फ्लोरोसेंट छवि ताजा 24 अच्छी तरह से बर्तन और विंदुक 4 सुक्ष्ममापी की 1 मिलीलीटर में Matrigel, जगह Transwells हमलावर कोशिकाओंCalcein AM दाग समाधान प्रत्येक Matrigel प्लग के शीर्ष पर, यह खत्म हो पक्षों गिर करने के लिए और ऊपर और नीचे से दाग की अनुमति. Calcein AM (calcein के acetoxymethyl एस्टर) एक जीवित सेल डाई है कि दाग हरी पूरे कोशिकाओं और कोई निर्धारण की आवश्यकता है.
- 37 से कम 1 घंटे सेते डिग्री सेल्सियस में 5% सीओ 2 humidified वातावरण, पर जो बात की कोशिकाओं को पूरी तरह से सना हुआ और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged किया जा करने के लिए तैयार हैं.
- वैकल्पिक रूप से, गैर फ्लोरोसेंट कोशिकाओं Matrigel हमलावर और तय किया जा सकता है दाग के रूप में नीचे 3.5 में 3.9 वर्णित है.
- एक ताजा 24 अच्छी तरह से थाली प्रत्येक Transwell स्थानांतरण. ओवरले 4% para-formaldehyde/0.2% ट्राइटन - एक्स 100 की एक मिलीलीटर.
- 0.5 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- लगानेवाला निकालें और 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ 3 बार धोने.
- 30 मिनट RNase 100 μg / मिलीलीटर RNase का उपयोग कर उपचार के साथ cytoplasmic शाही सेना निकालें. पीबीएस के साथ 2 बार धो लें.
- दृश्य के लिए 0.01 Propidium मिलीग्राम / एमएल (पीआई) आयोडाइड पीबीएस में पतला जोड़ने और दा में कमरे के तापमान पर छोड़0.5 घंटे के लिए आर. पीबीएस के साथ 3 बार धोएं. इस स्तर पर, पीआई दाग transwell कम से कम 1 महीने के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर रखा जा सकता है.
- Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा सटीक इमेजिंग तरीकों उपलब्ध संसाधनों पर निर्भर हैं. बड़े coverslip पर एक अवशिष्ट पीबीएस के छोटे गैर विसर्जन 20 एक्स उद्देश्य और ऑप्टिकल वर्गों matrigel प्लग के नीचे से हर 10-15 सुक्ष्ममापी पर कब्जा से अधिक राशि (सुनिश्चित नहीं बुलबुले मौजूद हैं) के साथ एक औंधा confocal सूक्ष्मदर्शी, जगह Transwell का उपयोग करना. व्यक्तिगत ऑप्टिकल स्लाइस आक्रमण (चित्रा 3A) की हद तक यों या Volocity (3B चित्रा) के रूप में उचित सॉफ्टवेयर का उपयोग 3 आयामी वस्तुओं में निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
4. प्रतिनिधि परिणाम
ऑप्टिकल स्लाइस की एक जेड श्रृंखला का एक उदाहरण चित्रा 3A में दिखाया गया है. इस उदाहरण में, कोशिकाओं Calcein AM के साथ दाग थे और फिल्टर से हमलावर कोशिकाओं की संख्या के लिए दूरी के साथ कम देखा जा सकता है है. में की मात्रा का ठहरावvasion विश्लेषण Calcein के अनुपात में प्रत्येक अंतराल पर, या निर्धारण / धुंधला ऊपर विस्तृत विधि का उपयोग कर और पीआई प्रत्येक स्थिति में सकारात्मक नाभिक गिनती नकारात्मक पिक्सल के लिए सकारात्मक पिक्सल AM करके किया जा सकता है. Calcein का एक फायदा यह धुंधला हो जाना है सेल आक्रमण की है कि तीन आयामी पुनर्निर्माण Volocity जैसे सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, आक्रमण के मोड (3B चित्रा) के एक दृश्य चित्रण देने इकट्ठा किया जा सकता है. यदि कोशिकाओं फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित कर रहे हैं, तो प्रत्येक रंग कक्ष की स्थिति 3 - आयामी पुनर्निर्माण में कल्पना हो सकता है, या तो पक्ष (चित्रा 3C) से या पुनर्निर्माण (चित्रा 3 डी) के माध्यम से स्लाइसें बनाने के द्वारा देखा जा सकता है.
चित्रा 1 व्युत्क्रम आक्रमण परख की स्थापना में शामिल चरणों के योजनाबद्ध आरेख . ए) Matrigel ECM पर बर्फ thawed. बी) Matrigel पीबीएस दो बार अंतिम एकाग्रता पर किसी भी दवा उपचार युक्त के साथ 1:1 पतला है. सी) Transwell आवेषण multiwell प्लेटों में रखा जाता है, और Matrigel प्रत्येक में pipetted. डी) सेल निलंबन वांछित एकाग्रता में बनाया है. ई) एक बार Matrigel स्थापित किया है, थाली उलटा है और हटा दिया, कोशिकाओं Transwell आवेषण के नीचे फिल्टर पर चढ़ाया जाता है. एफ) औंधा स्थिति में, multiwall थाली Transwell आवेषण पर ध्यान रखा गया है, सेल निलंबन के साथ संपर्क बनाने. जी) कक्ष के 4 घंटे के लिए फिल्टर का पालन करने के लिए अनुमति दी जाती है.
चित्रा 2 व्युत्क्रम आक्रमण परख के लिए योजनाबद्ध आरेख का सिलसिला. ए) एक बार कोशिकाओं का पालन किया है, सीरम मुक्त मीडिया में प्रत्येक Transwell डुबकी दो बार ढीली कोशिकाओं को दूर करने के लिए. बी) प्लेस अंतिम अच्छी तरह से युक्त मीडिया प्लस उपचार के रूप में आवश्यक में Transwell धोया. सी) मीडिया आवश्यक के रूप में उपचार के साथ (जैसे 10% भ्रूण गोजातीय सीरम) chemoattractant युक्त ध्यान Matrigel पर स्तरित है.
चित्रा 3 व्युत्क्रम आक्रमण परख के परिणामों के प्रतिनिधि छवियाँ. ए) Calcein साथ दाग कोशिकाओं के ऑप्टिकल वर्गों Matrigel हमलावर AM confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा 15 सुक्ष्ममापी अंतराल पर लिया. बी) confocal z-श्रृंखला छवियों, की ओर से देखा के ढेर से एक 3 - आयामी सेल आक्रमण के पुनर्निर्माण के पुनर्निर्माण. संदर्भ 10 से Reprinted. सी) GFP और आरएफपी लेबल की ओर से देखा Matrigel हमलावर कोशिकाओं के पुनर्निर्माण तीन आयामी. डी) GFP और आरएफपी लेबल की कोशिकाओं के 3 आयामी पुनर्निर्माण के माध्यम से ऑप्टिकल टुकड़ा. संदर्भ 10 से Reprinted.
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Discussion
Matrigel आक्रमण assays के परंपरागत chemoattractant प्रेरित गतिशीलता के साथ बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन की एक दिशा में परत पर रखा और नीचे में एक फिल्टर के माध्यम से कोशिकाओं के साथ किया गया है स्थापित. Invasiveness कितने कोशिकाओं को फिल्टर के underside पर गिना जा सकता है है की एक समारोह के रूप में रन बनाए किया गया था. हालांकि व्यावहारिक "उलटा" आक्रमण ऊपर वर्णित परख के साथ थोड़ा अंतर है, वहाँ आक्रमण की प्रक्रिया है कि हमलावर कोशिकाओं visualizing के रूप में वे Matrigel के माध्यम से और कदम के द्वारा निर्धारित किया जा सकता के बारे में काफी अधिक जानकारी है. उदाहरण के लिए, के अलावा में अलग लेबल कोशिकाओं कल्पना करने के लिए अग्रणी बनाम सामूहिक आक्रमण (चित्रा -3 सी और 3 डी) में कोशिकाओं के बाद, इस पद्धति का उपयोग करके की जांच करने में सक्षम किया जा रहा कोशिकाओं को तय किया जा permeabilized, दाग और प्रोटीन के स्तर या subcellular वितरण के लिए तो imaged की अनुमति देता है . इस विधि का हल शक्ति प्रतिदीप्ति की आधारभूत संकेत तीव्रता द्वारा सीमित होगाNT के प्रोटीन कोशिकाओं और इमेजिंग तंत्र की संवेदनशीलता को व्यक्त, खासकर यदि दो या अधिक रंग imaged किया गया. डाई बुझती (DQ) कोलेजन (जो इतनी भारी fluorescein साथ संयुग्मित कि फ्लोरोसेंट संकेत है जब तक proteolysis कोलेजन टुकड़े अलग है, जिससे स्थानीय fluorescein एकाग्रता कम और प्रतिदीप्ति की अनुमति बुझती है) के साथ मिलाकर देखना Matrigel इस तरीका है कि होगा एक और आवेदन बहु रंग है कोशिकाओं पर हमला करके ECM गिरावट के दृश्य के लिए अनुमति देते हैं. उच्च सामग्री स्क्रीनिंग confocal इमेजिंग और पर्यावरण कक्षों के साथ लगे उपकरणों का प्रयोग इस कार्यविधि 4 घ वास्तविक समय आक्रमण परख है, जो भी ईसीएम गिरावट के रूप में अतिरिक्त उपायों के साथ मल्टिप्लेक्स किया जा सकता है में तब्दील करने के लिए सक्षम होगा. स्वचालन के साथ संयुक्त, यह भी संभव हो सकता है उच्च throughput सेल आधारित assays कि उपन्यास विरोधी आक्रमण के लक्ष्य के लिए रासायनिक पुस्तकालयों स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है डिजाइन.
श कारकों की एक संख्याould सावधानी से नियंत्रित हो सकता है जब इस व्युत्क्रम आक्रमण परख का उपयोग कर. सेल घनत्व आक्रमण की स्पष्ट क्षमता को प्रभावित कर सकते हैं, तो प्रत्येक को दोहराने के कक्षों की संख्या बराबर में इस्तेमाल किया जाना चाहिए. उपचार है कि सेल नंबर (ई. जी. साइटोटोक्सिक दवाओं) बदल आक्रमण की हद तक बदल दिखाई देते हैं, लेकिन हो सकता है भी इस सेल घनत्व प्रभाव को प्रतिबिंबित कर सकते हैं. हालांकि कई सेल लाइनों इस परख में अच्छी तरह से काम करते हैं, अच्छी तरह से करने के लिए उपयोगी हो के लिए पर्याप्त नहीं सभी आक्रमण, तो प्रत्येक एक मामले के आधार द्वारा मामले पर मूल्यांकन किया जाना चाहिए है. के लिए एक अच्छा संकेत विंडो प्रदान करने के लिए पर्याप्त आक्रमण के स्तर को प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय की लंबाई empirically से निर्धारित किया जाना चाहिए प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए, एमडीए MB से 231 सेल लाइन 4 दिनों में अच्छी तरह से परख की शुरुआत के बाद उदाहरण के लिए काम करता है,. इसके अलावा, सुझाव दिया (जैसे Transwell आवेषण के लिए 8 माइक्रोन ताकना आकार) कुछ शर्तों के हर कोशिका लाइन के अनुरूप नहीं है, और कुछ अनुकूलन आवश्यक हो सकता है हो सकता है. अतिरिक्त जब मानक Matrigel आक्रमण परख मीटर की तुलना में इस विधि से व्युत्पन्न मूल्यake यह सार्थक किसी भी गंभीरता से 3 - डी के आक्रमण में शामिल प्रक्रियाओं का अध्ययन करने में रुचि रखते प्रयोगशाला में स्थापित है.
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Disclosures
लेखकों खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस शोध के लिए अनुदान कैंसर रिसर्च यूके से है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | GIBCO, by Life Technologies | 21969 | |
| Fetal Bovine Serum | PAA Laboratories | A15-101 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| 200 mM L-Glutamine (100x) | GIBCO, by Life Technologies | 25050-032 | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | AL-118 | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| 6.5mm Transwells, 8.0 μm pore size | Corning | 3422 | |
| Complete Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Calcein AM | Invitrogen | C1430 | |
| RNase | Qiagen | 19101 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| Confocal microcope | Leica Microsystems | SP2MP |
References
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