Summary
हवाई संयंत्र अंगों छल्ली, supramolecular विधानसभा biopolyester मोम के द्वारा संरक्षित कर रहे हैं. हम वर्तमान प्रोटोकॉल के चुनिंदा हटाने महामारी और intracuticular waxes, टमाटर फल cuticles से आणविक और सूक्ष्म तराजू पर ठोस राज्य एनएमआर और परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा, क्रमशः पर नजर रखने के लिए, और इंजीनियर चर्म संबंधी biopolyesters के पार से जोड़ने की क्षमता का आकलन.
Protocol
1. टमाटर की enzymatic अलगाव 5 cuticles
- एक कटोरी में कई वाणिज्यिक या खेती टमाटर रखें. बड़े वर्गों में फल से त्वचा छील, भीतरी फली ऊतक त्यागें. विआयनीकृत पानी के साथ टमाटर की खाल धो और उन्हें एक बीकर में पानी के नीचे बनाए रखने के.
- 1.22 छ सोडियम एसीटेट Trihydrate के (एम आर 136.08 छ / mol) और 2.34 मिलीग्राम एक बीकर में हिमनदों एसिटिक एसिड (17.485 एम) डाल द्वारा एक 50 मिमी पीएच 4.0 सोडियम एसीटेट बफर (31 डिग्री सेल्सियस में) तैयार करने के लिए, 200 मिलीलीटर जोड़ने विआयनीकृत पानी, और फिर 4,0 करने के लिए 31 पर पीएच का समायोजन डिग्री सेल्सियस , 0.2 cellulase के जी (232.734.4 चुनाव आयोग, 1.3 इकाइयों / मिलीग्राम ठोस है, सिग्मा Aldrich), (10 यू मिलीलीटर -1, TCI अमेरिका 3.2.1.15 ईसी) pectinase के 4 मिलीलीटर युक्त मिश्रण तैयार करें, और 13 मिलीग्राम 3 नेन, और तो एंजाइम का मिश्रण करने के लिए सोडियम एसीटेट बफर की 196 मिलीलीटर जोड़ने के लिए अंतिम एंजाइम कॉकटेल के 200 मिलीलीटर प्राप्त 5 पूरी तरह से खुली एंजाइम कॉकटेल टमाटर त्वचा में विसर्जित और सेते हैं.31 में डिग्री सी लगातार झटकों (G24 पर्यावरण इनक्यूबेटर शेखर, नई ब्राउनश्विक वैज्ञानिक कं) के साथ 24 घंटे के लिए.
- टमाटर की खाल का उपयोग रसोई झरनी या BUCHNER कीप और उन्हें विआयनीकृत पानी से धो लीजिए. इसके बाद, उन्हें एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एक निर्वात ओवन में जगह है. बाद डीवैक्सिंग प्रक्रियाओं के लिए एक लेबल और छाया हुआ बोतल में सूखे टमाटर की खाल की रक्षा करता है.
2. Soxhlet 6 निष्कर्षण द्वारा संपूर्ण डीवैक्सिंग
- संपूर्ण डीवैक्सिंग के लिए उपकरणों का इस्तेमाल किया एक गर्मी स्रोत (हीटिंग पोशिश और Variac नियंत्रक), एक विलायक जलाशय के लिए गोल नीचे कुप्पी, Soxhlet चिमटा, sintered - कांच नोक या डिस्पोजेबल निष्कर्षण नोक, विरोधी bumping के चिप्स और एक संघनित्र (छवि देखते हैं के होते हैं. ) 1. ध्यान दें कि संकीर्ण अपनाना हाथ (भागों छवि में 6 और 7 1.) बहुत नाजुक है और टूटना करने के लिए प्रवण है, सावधान से निपटने की आवश्यकता है.
- टमाटर त्वचा की 0.5-1 ग्राम रखो (में प्राप्त1 एक मोर्टार में कदम), और एक पैर के साथ एक मोटे पाउडर के लिए नमूना पीस जब तक कि नमूने के AFM के माप (धारा 5) के लिए इस्तेमाल किया जा रहे हैं. एक sintered गिलास या डिस्पोजेबल नोक लगभग आधे रास्ते नमूना के साथ भरें और चिमटी का उपयोग करने यह निष्कर्षण स्तंभ के आधार पर ध्यान से जगह.
- संघनित्र देते हैं और यह एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लपेटो. कुछ विरोधी bumping के चिप्स की उपस्थिति में मेथनॉल विलायक (ACS ग्रेड) गर्मी जब तक यह धीरे और फ्लास्क की दीवारों पर फोड़े refluxes. दोनों कांच ऊन और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर विलायक जलाशय. एक घंटे के लिए प्रक्रिया की जाँच करें, Variac वोल्टेज का समायोजन इतना है कि जलाशय प्रति सेकंड के बारे में एक बूंद जमा और वसूलना Soxhlet तंत्र के भीतर जब नोक पूर्ण है होता है.
- 12 ज के लिए निकासी की प्रक्रिया जारी रखें, तो कम हीटिंग पोशिश और तंत्र नीचे शांत करने के लिए अनुमति देते हैं. विलायक के निपटान के लिए एक एकल इकाई के रूप में चिमटा और जलाशय निकालें. Tweeze का प्रयोग करेंरु निष्कर्षण स्तंभ की गर्दन के नीचे बस के लिए नोक बढ़ाने के लिए, यह से विलायक अतिरिक्त नाली, और एक स्वच्छ सतह पर नोक जगह है. निष्कर्षण स्तंभ झुकाव कुप्पी में नीचे वसूलना की अनुमति. कुप्पी डिस्कनेक्ट और एक लेबल बर्बादी विलायक गोदाम में बेकार डालना.
- उत्तरोत्तर कम polarity, जैसे, क्लोरोफॉर्म, और प्रत्येक मामले में 12 घंटे के लिए हेक्सेन के लगातार सॉल्वैंट्स के लिए 2.3 और 2.4 चरणों को दोहराएँ.
- टमाटर cutin नमूना नोक अंदर, या तो इसे पर नाइट्रोजन गैस की एक धारा बह द्वारा या कमरे के तापमान पर एक निर्वात ओवन में रखकर शुष्क करने की अनुमति दें. अंत में, सूखी नमूने के द्रव्यमान को मापने के लिए और कमरे के तापमान पर यह एक पेंच शीर्ष parafilm के साथ बंद जार में स्टोर.
3. Epicuticular और Intracuticular 3,4 Waxes के चयनात्मक अलगाव
- सबसे पहले, आसुत जल के साथ पूरे टमाटर (1 में वर्णित उन से टमाटर का एक अलग बैच) धो लो. पैप के साथ उन्हें सूखीएर तौलिए और Kimwipes के, और उन्हें जगह एल्यूमीनियम पन्नी की एक टुकड़ा पर नीचे स्टेम.
- पेंट 120 (w / w, जन अनुपात)% गम फैशन नीचे एक शीर्ष में अरबी जलीय समाधान के साथ पूरे टमाटर और फल त्वचा पर सूखी अरबी गोंद, एक पतली फिल्म छोड़ने के लिए एक घंटे के बारे में अनुमति देते हैं. इस फिल्म चिमटी का उपयोग कर निकालें, टमाटर त्वचा पंचर नहीं सावधान किया जा रहा है. एक बार और प्रक्रिया दोहराएँ.
- तीन मिनट के लिए 01:01 क्लोरोफॉर्म (v / v) पानी और मिश्रण युक्त शीशियों के लिए फिल्मों में जोड़ें. जोरदार आंदोलन और चरण जुदाई के बाद, क्लोरोफॉर्म भिन्न विंदुक और उन्हें खुला अलग शीशियों में लुप्त हो जाना, epicuticular मोम छोड़ने. टमाटर के शारीरिक बरकरार रहेगा. क्लोरोफॉर्म में उन्हें कमरे के तापमान पर दो मिनट के लिए और डुबकी विलायक वाष्पन बाद intracuticular मोम को इकट्ठा. अब, टमाटर छील और उन्हें enzymatically का इलाज (और सोडियम एसीटेट बफर में cellulase pectinase साथ) सेलूलोज़ और कंघी के समान आकार को दूर करने के लिए, क्रमशः (के रूप में वर्णित
- अगर वांछित, इन enzymatically अलग cuticles पर Soxhlet निष्कर्षण द्वारा संपूर्ण डीवैक्सिंग (चरण 2 देखें) करने के लिए, अलग polarity के तीन सॉल्वैंट्स (मेथनॉल, क्लोरोफॉर्म, और हेक्सेन, क्रमशः) का उपयोग.
4. क्रॉस - ध्रुवीकरण द्वारा टमाटर फलों cutin की आणविक विशेषता जादू कोण स्पिनिंग ठोस राज्य के परमाणु चुंबकीय (CPMAS ssNMR) अनुनाद 6
- जगह एक 1.6 मिमी fastMAS zirconia के रोटर में पूरी तरह से dewaxed टमाटर (cutins) के cuticles के विक्रेता की आपूर्ति पैकिंग उपकरण का उपयोग कर के 4-6 मिग्रा. (या तो जमीन dewaxed टमाटर cuticles या आंशिक रूप से dewaxed cuticles के बहुत छोटे टुकड़े उपयुक्त हैं.) सुनिश्चित करें कि नमूना समान रूप से पैक किया जाता है, लेकिन नहीं भी कसकर रोटर में. शीर्ष टोपी पर डाल करने के बाद, एक मार्कर काले रंग की स्याही कलम करने के लिए स्पिन दर की माप की सुविधा के साथ टोपी के आधे रंग.
- आधी ऊंचाई पर न्यूनतम वर्णक्रमीय रेखा चौड़ाई के लिए एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर shimming समायोजित करेंएन डी प्रोटॉन (एच 1) जांचना और कार्बन (13 सी) 90 ° पल्स चौड़ाई adamantane के रूप में एक मानक परिसर का उपयोग.
- मॉडल यौगिकों के रूप में ग्लाइसिन या glutamine का प्रयोग, सभी मानकों (हार्टमैन - हैन मिलान शक्ति स्तर, एच 1 - 13 सी संपर्क समय, heteronuclear 1 एच decoupling शक्ति) अनुकूलन के द्वारा प्राप्त अधिकतम संकेत तीव्रता पार ध्रुवीकरण जादू कोण कताई (CPMAS) प्रयोग. 1 600 मेगाहर्ट्ज के एच आवृत्ति पर प्राप्त स्पेक्ट्रा के लिए, की सिफारिश की शर्तों kHz 10 या 15 kHz के कताई आवृत्ति, अधिग्रहण के बीच 3 - सेकंड देरी, और रीढ़ की हड्डी heteronuclear एक चुंबकीय क्षेत्र 185 kHz के एक आवृत्ति के बराबर ताकत में 7 decoupling प्रोटॉन में शामिल हैं.
- जांच में रोटर cutin पैक डालें. फिर, चुंबक में जांच जगह है. 10 kHz करने के लिए धीरे - धीरे अच्छा नमूना पैकिंग और रोटर स्थिरता के लिए जाँच करने के लिए कताई गति बढ़ाएँ. रोटर के अंतिम कताई स्थिरता के भीतर सत्यापित करें± 20 हर्ट्ज.
- ट्यूनिंग समायोजित करें और जांच के capacitors मिलान iteratively 1 एच 13 सी एनएमआर आवृत्तियों दोनों में कम से कम बिजली प्रतिबिंब को प्राप्त करने के लिए. 25 प्रयोगात्मक तापमान सेट डिग्री सेल्सियस (या कमरे के तापमान).
- पूर्व अनुकूलित CPMAS हार्टमैन हैन मिलान हालत kHz 10 कताई आवृत्ति निर्धारित करने के लिए इसी प्रयोग शुरू करते हैं.
- 50-100 हर्ट्ज के विस्तार घातीय (Lorentzian लाइन) के साथ 4096 यात्रियों, हालत स्पेक्ट्रम मोल, और एक फूरियर को बदलने के लिए संकेत तीव्रता बनाम रासायनिक परिरक्षण (पीपीएम) के एक एनएमआर स्पेक्ट्रम उत्पन्न.
- संदर्भ 13 सी रासायनिक बाह्य 38.4 पीपीएम (CH-2 - समूह) में बदलाव adamantane सेट का उपयोग एक मानक के रूप में 8.
- 15 kHz करने के लिए रोटर कताई आवृत्ति को बढ़ाने के लिए और CPMAS (4.6-4.8 कदम) माप हार्टमैन हैन मिलान बाद इस कताई आवृत्ति में निर्धारित शर्त के लिए इसी को दोहराएँ.
- Repe(मोमी) प्राकृतिक और आंशिक रूप से dewaxed फल छल्ली नमूने के साथ CPMAS प्रयोगों (4.1-4.9 कदम) में.
5. परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी के साथ टमाटर छल्ली भूतल जांच (डिजिटल उपकरण Nanoscope IIIa; प्रक्रिया थोड़ा सूक्ष्मदर्शी के बीच अलग अलग होंगे) 6
- जांच स्कैनिंग खुर्दबीन (एसपीएम) पर बारी (छवि 2) और यकीन है कि खुर्दबीन मोड टॉगल स्विच संपर्क परमाणु बल (AFM) माइक्रोस्कोपी मोड के लिए सेट कर दिया जाता है.
- मैन्युअल रूप से अपने दो उपयोगकर्ता समायोज्य सामने knobs बदल कर एसपीएम सिर उठाना. एसपीएम के सिर से सिर के पीछे में clamping के पेंच बदल AFM के tipholder द्वारा अलग करें.
- मौजूदा AFM के ब्रैकट हटाने के tipholder से चिमटी का उपयोग करें, तो ध्यान से अपने पैकेज से एक नए सिलिकॉन नाइट्राइड ब्रैकट AFM जांच हड़पने के लिए और यह पुराने ब्रैकट की जगह में स्थापित है. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए सत्यापित करें कि नव स्थापित AFM के ब्रैकट टूटा नहीं है.
- वें संलग्नई टमाटर छल्ली नमूना डबल पक्षीय टेप के साथ एक स्टेनलेस स्टील डिस्क (नमूना पक) (आंशिक रूप से dewaxed टमाटर छल्ली के एक वर्ग ~ 10 x 10 मिमी). एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए सत्यापित करें कि छल्ली फ्लैट सतह और चिकनी नमूना पक पर नियुक्ति के बाद का रहता है.
- एसपीएम स्कैनर के शीर्ष पर टमाटर चुंबकीय क्षेत्र पर छल्ली नमूना के साथ पक रखें.
- मोड़ knobs के द्वारा उच्च स्कैनर के सामने दो पुस्तिका समायोजन शिकंजा सेट, अन्य दो सामने शिकंजा के रूप में लगभग एक ही स्तर के लिए मोटर वापस समायोजन पेंच सेट. सुनिश्चित करें कि सभी तीन शिकंजा पर्याप्त उच्च टिप AFM तोड़ने है जब एसपीएम सिर में tipholder रखने से बचने के लिए सेट कर रहे हैं.
- एसपीएम सिर के में tipholder फिर से शामिल करना है और यह सिर के पीछे के पर clamping के पेंच कस द्वारा सुरक्षित.
- लेजर पर बदल के बाद, AFM सिर के शीर्ष पर (y) केंद्रीय और सही (एक्स) लेजर समायोजन knobs का उपयोग ब्रैकट लेजर स्थान पर संरेखित करें.कागज के एक टुकड़े के लिए AFM के ब्रैकट के अंत में वास्तव में लेजर स्थान की स्थिति पर परिलक्षित लेजर बीम मॉनिटर.
- चल दर्पण iteratively photodetector समायोजन knobs का उपयोग करने के लिए अधिकतम संकेत (SUM संकेत) को प्राप्त करने के लिए, इस प्रकार यह सुनिश्चित करना है कि परिलक्षित लेजर बीम photodetector की चार quadrants द्वारा समान रूप से प्राप्त किया जा रहा है की स्थिति को समायोजित करें.
- कम पुस्तिका समायोजन सामने शिकंजा retracting AFM टिप और एसपीएम स्कैनर के मोटरयुक्त वापस समायोजन पेंच, नेत्रहीन एक उलटा माइक्रोस्कोप के साथ नमूना की सतह की ओर टिप AFM के दृष्टिकोण निगरानी. सुनिश्चित करें कि सभी तीन शिकंजा एक ही स्तर पर झुका नमूना इमेजिंग से कलाकृतियों से बचने के. नमूना की ओर टिप लाओ बंद करने के लिए, लेकिन इतना नहीं कि टिप छू या नमूना की सतह के माध्यम से टूट जाता है.
- इस बिंदु पर, लेजर प्रकाश परिलक्षित AFM के ब्रैकट photodetector के लिए चल दर्पण उछाल होगी. एक sili साथ संपर्क AFM मोड के लिएचुनाव नाइट्राइड AFM टिप, एक 0 वी setpoint और diff (अंतर / ऊर्ध्वाधर क्षैतिज) सिग्नल के लिए दर्पण की स्थिति का समायोजन करके 0 वी के लिए उत्पादन (कार्यक्षेत्र विक्षेपन) -2 वी संकेत वोल्टेज सेट.
- Nanoscope सॉफ्टवेयर का उपयोग, खुर्दबीन आइकन पर क्लिक करें और उचित प्रोफ़ाइल (संपर्क मोड AFM) का चयन करें.
- "स्कैन नियंत्रण सेटिंग्स" पैनल का उपयोग, निर्धारित दर स्कैन और स्कैन आकार जैसे, 10 माइक्रोन स्कैन आकार और 2 हर्ट्ज दर स्कैन.
- AFM टिप संलग्न टिप आइकन पर क्लिक करके नमूना की सतह को संलग्न करने के लिए अनुमति देते हैं. एसपीएम आधार मोटर वापस पेंच को नियंत्रित करके, प्रोग्राम अब टिप कम जब तक यह नमूना की सतह संलग्न है. स्कैनिंग की प्रक्रिया को स्वचालित रूप से एक बार टिप सफलतापूर्वक लगा हुआ है शुरू कर देंगे.
- मॉनिटर स्कैनिंग सॉफ्टवेयर दोनों की छवि और गुंजाइश मोड का उपयोग कर, setpoint, अभिन्न लाभ, आनुपातिक लाभ, स्कैन आकार, दर स्कैन, लाइनों और / नमूने लाइन के रूप में मापदंडों का समायोजन iteratively उच्चतम प्राप्त करने के लिए प्रक्रियासंकल्प छवियों. एक बड़ी रेंज है z-अक्ष (डाटा पैमाने) के साथ स्कैनिंग शुरू करो, तो ध्यान से डेटा पैमाने मूल्य को कम करने के लिए छवि पर सतह सुविधाओं का सबसे अच्छा इसके विपरीत निरीक्षण. स्कैन की गई छवि है, जो संकेत मिलता है कि सतह सुविधाओं की ऊंचाई रेंज उपलब्ध z-अक्ष से अधिक में सफेद क्षेत्रों की घटना को कम.
- डेटा फ़ाइल को बचाने के लिए छवि पर कब्जा, तो सपाट कार्य का उपयोग करने के लिए छवि खड़ी स्कैनर (जेड) बहाव, छवि धनुष, और ऊर्ध्वाधर लाइनों स्कैन के बीच ऑफसेट करने के लिए कारण कलाकृतियों हटाने के डेटा की प्रक्रिया, 9 अंत में औसत खुरदरापन गणना करने. डेटा की बचत करने के बाद, कंप्यूटर नियंत्रित पेंच मोटर है कि यह संलग्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था की कार्रवाई के पीछे टिप AFM वापस लेना. छवि प्रसंस्करण ऑफ़लाइन छवि विश्लेषण मोड और / में किया जा सकता है या एक अलग कंप्यूटर का उपयोग कर.
- टिप धारक के सामने नीचे ग्रे धातु knobs का उपयोग करने के लिए स्कैनिंग क्षेत्र के एक्स और वाई पदों को बदलने, तो पाँच नमूना loca पर माप दोहरानामाहौल reproducibility की जाँच करने के लिए, AFM के ब्रैकट की जगह अगर छवि गुणवत्ता कमजोर होती जाती है.
6. प्रतिनिधि परिणाम
रासायनिक CPMAS 13 सी एनएमआर स्पेक्ट्रा के बदलाव विश्लेषण (3 छवि) प्रमुख कार्यात्मक ृनव dewaxed टमाटर छल्ली (cutin) में मौजूद समूहों की पहचान की. cutin biopolyester में महत्वपूर्ण कार्बन moieties लंबी श्रृंखला aliphatics (0-45 पीपीएम), से oxygenated aliphatics (45-110 पीपीएम), गुणा बंधुआ और aromatics (110-160 पीपीएम), और carbonyls (160-220 पाए गए ) पीपीएम. ऑक्सीजन alkyl moieties (चो + दर्पण 2 हे) cutin biopolymer की monomeric इकाइयों के बीच सहसंयोजक कनेक्शन स्थापित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जिससे cutin मैट्रिक्स की आणविक संरचना बनाने. रिश्तेदार चोटी के 45 और 100 पीपीएम के बीच वर्णक्रमीय क्षेत्र में मनाया क्षेत्रों में अंतर बताते हैं कि उत्परिवर्ती cutin पार लिंक बनाने चो structura की एक अपेक्षाकृत बड़ी अनुपात है मैं moieties की तुलना में जंगली प्रकार cutin, सावधान मात्रात्मक प्रत्यक्ष (DPMAS) ध्रुवीकरण एनएमआर पाँच तरीकों का उपयोग माप इस निष्कर्ष का समर्थन (नहीं दिखाया डेटा).
CPMAS 13 सी एनएमआर स्पेक्ट्रा भी उत्तरोत्तर कम 31 पीपीएम (4 छवि) पर मोम शिखर दिखाया, संयुक्त cutin - मोम से महामारी और intracuticular waxes, अनुक्रमिक हटाने का संकेत जबकि cutin biopolymer के प्रमुख रासायनिक वास्तुकला को बनाए रखना है. समानांतर AFM छवि विश्लेषण (5 छवि) सतह फल छल्ली से महामारी और intracuticular waxes की stepwise निष्कर्षण के कारण अनियमितताओं का पता चला, चर्म संबंधी विधानसभा के संगठन में परिवर्तन वाचक.
. चित्रा 1 Soxhlet चिमटा (छवि स्रोत: विकिपीडिया).
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चित्रा 2. ए) स्कैन जांच माइक्रोस्कोप. बी) एसपीएम सिर (AFM के प्रशिक्षण मैनुअल डिजिटल उपकरण द्वारा प्रदान से अनुकूलित).
चित्रा 3 150 मेगाहर्ट्ज CPMAS ृनव dewaxed लाल (M82) जंगली और प्रकार उत्परिवर्ती से पका हुआ टमाटर फल cuticles (cutins) 13 सी एनएमआर स्पेक्ट्रा (CM15) रासायनिक साथ अनुनादों दिखा. पार से जुड़े hydroxyfatty एसिड के कार्य समूहों के लिए इसी बदलाव आधारित पॉलिएस्टर और भी कुछ गुणा बंधुआ moieties. सभी स्पेक्ट्रा एक 10 kHz के आवृत्ति कताई के साथ हासिल किया गया.
चित्रा 4 150 मेगाहर्ट्ज वाणिज्यिक लाल पके टमाटर फल cuticles की 13 CCPMAS एनएमआर स्पेक्ट्रा गम अरबी यांत्रिक निष्कर्षण द्वारा epicuticular और intracuticular waxes के अनुक्रमिक हटाने और एक tw पर compositional परिवर्तन एक्ज़िबिटओ मिनट क्लोरोफॉर्म डुबकी क्रमशः. सभी स्पेक्ट्रा एक 15 kHz के आवृत्ति कताई के साथ हासिल किया गया.
संख्या 5 AFM के छवियों और आंशिक रूप से dewaxed वाणिज्यिक टमाटर के लिए खुरदरापन अनुमान चित्रा 4 में stepwise हटाने के बाद (बाएं) epicuticular और intracuticular वैक्स (दाएं) के वर्णित cuticles.
Discussion
प्रोटोकॉल वर्णित यहाँ विनाशकारी रासायनिक टूटने के लिए जरूरत के बिना एक जटिल असभ्य संयंत्र सामग्री की विस्तृत आणविक और microscale लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देते हैं. विभिन्न लिपिड (वैक्स) है कि चर्म संबंधी विधानसभा के संरचनात्मक संगठन, 10 हम किया और निगरानी की विषम चर्म संबंधी मिश्रण से epicuticular और intracuticular waxes की चयनात्मक हटाने के लिए प्रक्रियाओं पर नियंत्रण के साथ cutin biopolyester के सम्मिश्रण की जांच करने के लिए. ठोस राज्य 13 सी एनएमआर मोम आणविक घटकों की निकासी लाइन के लिए इस्तेमाल किया गया था, और परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी सतह खुरदरापन में सहवर्ती बदलाव की जांच सेवा 6,11 खेती जंगली प्रकार के और एक जीन से पार से जोड़ने cutins की क्षमताओं की तुलना उत्परिवर्ती टमाटर फल, ठोस राज्य के 13 सी एनएमआर भी चो और दर्पण 2 हे रासायनिक moieties के रिश्तेदार की संख्या का अनुमान किया गया था.
डिजाइन सुविधा का एक संख्याइस प्रोटोकॉल के उल्लेखनीय हैं. मोम के रूप में सामग्री lipids की एक विस्तृत श्रृंखला शामिल, मुक़्तलिफ़ छोर वाले सॉल्वैंट्स की एक श्रृंखला के साथ फल छल्ली इलाज संपूर्ण डीवैक्सिंग को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. इसके अलावा, डीवैक्सिंग समय 8 घंटे से 24 घंटे छल्ली नमूनों की प्रकृति के आधार पर भिन्न हो सकते हैं. लगातार बरकरार फल छल्ली से epicuticular waxes निकालने, यह चिपकने वाली कोटिंग समान रूप से लागू करने के लिए सतह के लिए जरूरी है.
ठोस राज्य CPMAS 13 सी 12 एनएमआर अत्यधिक विषम है और अघुलनशील संयंत्र biopolymers के विभिन्न संरचनात्मक घटकों की पहचान करते हुए उनके मूल शारीरिक विशेषताओं के संरक्षण के लिए एक तेजी से गुणात्मक विधि है, 13 परंपरागत एनएमआर समाधान राज्य भी निकाले मोम मिश्रण विशेषताएँ इस्तेमाल किया जा सकता है. यदि कार्यात्मक समूहों का आकलन मात्रात्मक बरकरार संयंत्र पॉलिमर, 5 उच्च विश्वस्तता प्रत्यक्ष ध्रुवीकरण जादू कोण कताई (डी के लिए वांछित हैPMAS 13) सी 5,14 एनएमआर एक पूरक पद्धति के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए. कार्य समूहों की सटीक quantitation पुनरावृत्ति बार, उत्तेजना पल्स लंबाई, और heteronuclear decoupling की ताकत से सावधान अनुकूलन की आवश्यकता है 15 heteronuclear decoupling 16 TPPM या का उपयोग करके 1 एच क्षेत्र 50 kHz से 185 kHz करने के लिए लेकर ताकत के लिए सेट किया जा सकता है. रीढ़ की हड्डी के तरीके 7. इन मापदंडों के अलावा, CPMAS माप की संवेदनशीलता स्पिन ताला समय और हार्टमैन - हैन मिलान शर्त पर निर्भर करता है 15 पारंपरिक CPMAS की जगह, एक ramped आयाम सी.पी. तकनीक (रैंप सीपी) को पार करने को अधिकतम करने के लिए लागू किया जा सकता है ध्रुवीकरण 1 एच आयाम रैखिक अलग (~ 20-50%) या tangentially जबकि 13 सी क्षेत्र स्पिन लॉक अवधि (या विपरीत) के दौरान निरंतर शक्ति के आयाम रखने के द्वारा दक्षता 17,18 बाहर ले जाने पर CPMAS माप. दो अलग अलग भूमिका की एक न्यूनतमटो - कताई आवृत्तियों मुख्य वर्णक्रमीय चोटियों से कताई sidebands भेद करने के लिए जरूरी है.
समवर्ती AFM संपर्क मोड में आयोजित मापन उच्च गति स्कैनिंग और उच्च संकल्प, मोमी घटकों में से एक अनुक्रमिक हटाने के दौरान 19 उदाहरण के लिए साथ छल्ली सतह के हालत के प्रत्यक्ष इमेजिंग सक्षम. दोहन में AFM या तो मामले में मोड (गैर संपर्क) नाजुक "सॉफ्ट" संयंत्र सामग्री की सतह लक्षण वर्णन के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, संभव पार्श्व बलों (कतरनी) की वजह से नुकसान से बचने और नमूना की सतह की scraping के 5,20. आपरेटिंग अनुक्रमिक सतह पर एक ही स्थान के एकाधिक छवियों के अधिग्रहण के लिए किसी भी सतह AFM माप में जांच सतह बातचीत के कारण क्षति की पहचान इष्टतम reproducibility के लिए कार्य करता है. 6,21 वसंत नरम उच्चर्म संबंधी सतहों के लिए उपयुक्त स्थिरांक के साथ AFM जांच होना चाहिए इस्तेमाल किया, तापमान और आर्द्रता की भक्ति और बनाए रखा जाना चाहिए 6,15,20 22,23 जांच प्रदान करता है 1,2.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम अमेरिका के राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन # MCB-0741914 और MCB 0843627 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, अतिरिक्त ढांचागत समर्थन 2 स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान अनुसंधान संसाधन के लिए राष्ट्रीय केन्द्र से G12 RR03060-26 द्वारा न्यूयॉर्क के सिटी कॉलेज में प्रदान किया गया. हम कृतज्ञता से स्वीकार करते हैं JKC M82 (जंगली प्रकार) और CM15 (उत्परिवर्ती) टमाटर cuticles प्रदान करने के लिए कार्नेल विश्वविद्यालय प्लांट बायोलॉजी विभाग में समूह गुलाब. हम उसके AFM प्रयोगों के साथ उदार मदद के लिए CCNY रासायनिक प्रो अलेक्जेंडर Couzis के इंजीनियरिंग समूह से डा. Spyros Monastiriotis धन्यवाद. हम ग्राफिक डिजाइन समर्थन के लिए धन्यवाद सुश्री लॉरेन Gohara.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium acetate trihydrate | Sigma-Aldrich | S8625-500G | |
| Pectinase | TCI America | P0026 | EC 3.2.1.15; 10 U ml-1, store in refrigerator |
| Cellulase | Sigma-Aldrich | C1184-100KU | EC232.734.4; 1.3 units/mg, store in refrigerator |
| Glacial Acetic acid | Sigma-Aldrich | A9967 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | Extremely hazardous |
| Incubator/shaker | New Brunswick Scientific | Model No.G24 | MFG No.M1036-000G |
| Vacuum Oven | Precision Scientific | 31566 | |
| Variac Controller | |||
| Sintered glass thimble (85 mm/25mm) | VWR international | 89056 | |
| Disposable extraction thimble ( 80 mm/ 25 mm) | VWR international | 28320 | |
| Methanol | VWR international | EMD-MX0485-7 | |
| Glass wool | VWR international | RK20789 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
| Tweezers | VWR international | 82027-452 | |
| Chloroform | VWR international | EM-CX1050-1 | |
| Hexane | Fisher Scientific | H302-4 | |
| Nitrogen gas | |||
| Parafilm | VWR international | 52858 | |
| Paper towels | VWR international | 89002-984 | |
| Kim wipes | VWR international | 21905-026 | |
| Gum arabic | Sigma-Aldrich | G9752 | |
| 1.6 mm fastMAS zirconia rotor | Varian Inc., Agilent | ||
| NMR spectrometer | Varian Inc., Agilent | standard bore magnet | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | Model compound for CPMAS |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | 49419 | Model compound for CPMAS |
| Adamantane | Sigma-Aldrich | 100277 | To calibrate 90° pulse in NMR |
| Multimode Scanning Probe Microscope (Nanoscope IIIA) | Digital Instruments | ||
| Nanoscope software | Digital Instruments | Version 5.30r3sr3 (2005) | |
| AFM probe (Nonconductive silicon nitride tip) | Veeco Instruments, Inc. | Model NP-20 | |
| Light microscope | Digital Instruments | ||
| Magnetic puck | Digital Instruments | ||
| Double sided tape | VWR international | ||
| Fruit Peeler | |||
| Büchner funnel | VWR international | 89038 |
References
- Dom#237;nguez, E., Heredia-Guerrero, J. A., Heredia, A. The biophysical design of plant cuticles: an overview. New Phytologist. 189, 938-949 (2011).
- Bargel, H., Koch, K., Cerman, Z., Neinhuis, C. Structure-function relationships of the plant cuticle and cuticular waxes - a smart material? Functional Plant Biol. 33, 893-910 (2006).
- Jetter, R., Schäffer, S. Chemical Composition of the Prunus laurocerasus Leaf Surface. Dynamic Changes of the Epicuticular Wax Film during Leaf Development. Plant Physiol. 126, 1725-1737 (2001).
- Vogg, G. Tomato fruit cuticular waxes and their effects on transpiration barrier properties: functional characterization of a mutant deficient in a very-long-chain fatty acid β-ketoacyl-CoA synthase. J. Exper. Botany. 55, 1401-1410 (2004).
- Isaacson, T. Cutin deficiency in the tomato fruit cuticle consistently affects resistance to microbial infection and biomechanical properties, but not transpirational water loss. Plant J. 60, 363-377 (2009).
- Round, A. N. The Influence of Water on the Nanomechanical Behavior of the Plant Biopolyester Cutin as Studied by AFM and Solid-State NMR. Biophysical J. 79, 2761-2767 (2000).
- Fung, B. M., Khitrin, A. K., Ermolaev, K. An Improved Broadband Decoupling Sequence for Liquid Crystals and Solids. J. Magn. Reson. 142, 97-101 (2000).
- Morcombe, C. R., Zilm, K. W. Chemical shift referencing in MAS solid state NMR. J. Magn. Reson. 162, 479-486 (2003).
- Fang, S. J., Haplepete, S., Chen, W., Helms, C. R., Edwards, H. Analyzing atomic force microscopy images using spectral methods. J. App. Phys. 82, 5891-5898 (1997).
- Pollard, M., Beisson, F., Li, Y., Ohlrogge, J. B. Building lipid barriers: biosynthesis of cutin and suberin. Trends. Plant Sci. 13, 236-246 (2008).
- Stark, R. E. NMR studies of structure and dynamics in fruit cuticle polyesters. Solid State Nucl. Mag. 16, 37-45 (2000).
- Schaefer, J., Stejskal, E. O. Carbon-13 nuclear magnetic resonance of polymers spinning at the magic angle. J. Amer. Chem. Soc. 98, 1031-1032 (1976).
- Sachleben, J. R., Chefetz, B., Deshmukh, A., Hatcher, P. G. Solid-State NMR Characterization of Pyrene-Cuticular Matter Interactions. Envir. Sci. & Tech. 38, 4369-4376 (2004).
- Zlotnik-Mazori, T., Stark, R. E. Nuclear magnetic resonance studies of cutin, an insoluble plant polyester. Macromolecules. 21, 2412-2417 (1988).
- Stark, R. E., Garbow, J. R. Nuclear magnetic resonance relaxation studies of plant polyester dynamics. 2. Suberized potato cell wall. Macromolecules. 25, 149-154 (1992).
- Bennett, A. E., Rienstra, C. M., Auger, M., Lakshmi, K. V., Griffin, R. G.
- Metz, G., Wu, X. L., Smith, S. O.
- Peersen, O. B., Wu, X. L., Smith, S. O. Enhancement of CP-MAS Signals by Variable-Amplitude Cross-Polarization - Compensation for Inhomogeneous B-1 Fields. J. Magn. Reson. Ser. A. 106, 127-131 (1994).
- lessandrini, A., Facci, P. AFM: a versatile tool in biophysics. Measurement Sci. & Tech. 16, 10-1088 (2005).
- Benítez, J. J., Matas, A. J., Heredia, A. Molecular characterization of the plant biopolyester cutin by AFM and spectroscopic techniques. J. Struct. Biol. 147, 179-184 (2004).
- Koch, K., Neinhuis, C., Ensikat, H. J., Barthlott, W. Self assembly of epicuticular waxes on living plant surfaces imaged by atomic force microscopy (AFM). J. Exper. Bot. 55, 711-718 (2004).
- Muller, D. J. AFM: A Nanotool in Membrane Biology. Biochemistry. 47, 7986-7998 (2008).
- Last, J. A., Russell, P., Nealey, P. F., Murphy, C. J. The Applications of Atomic Force Microscopy to Vision Science. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6083-6094 (2010).
