Summary
Antenne planteorganer er beskyttet af overhuden, en supramolekylær biopolyester-voks samling. Vi præsenterer protokoller til at overvåge selektiv fjernelse af epi-og intracuticular voks fra tomatfrugt neglebånd på molekylære og mikro skalaer af solid-state NMR og atomic force mikroskopi, henholdsvis, og at vurdere krydsbinding kapacitet manipuleret kutikulære biopolyesters.
Abstract
Kutikula, et hydrofobt beskyttende lag på de overjordiske dele af landplanter, fungerer som en alsidig beskyttende barriere til forskellige biotiske og abiotisk stress og også regulerer vandstrømmen fra det ydre miljø. 1. En biopolyester (cutin) og langkædede fedtsyrer voksarter) danner den primære strukturelle netværk af kutikula, funktionelle integritet kutikulære lag afhænger den ydre "epicuticular 'lag såvel som blanding bestående af cutin biopolymer og' intracuticular har voks 2 heri, beskriver vi et omfattende protokol. at udvinde voks udtømmende fra kommercielle tomat (Solanum lycopersicum) frugt neglebånd eller fjerne epicuticular og intracuticular voks sekventielt og selektivt fra neglebånd komposit. Den metode rensedysen og Schäffer (2001) blev tilpasset til den trinvise ekstraktion af epicuticular og intracuticular voks fra frugt hårstrået. 3,4 At overvågeproces med sekventiel voks fjernelse, solid-state krydspolarisation magic-vinkel-spinning (CPMAS) 13 C-NMR-spektroskopi blev anvendt parallelt med atomic force mikroskopi (AFM), der giver molekylær-niveau strukturelle profiler af bulk materialer suppleret med oplysninger om mikroskala topografi og ruheden af de kutikulære overflader. At evaluere tværbindende kapacitet afvoksede cuticula fra dyrkede vildtype-og enkelt-genet mutante tomater, blev MAS 13C-NMR anvendes til at sammenligne de relative andele af oxygeneret alifatiske (CHO og CH2O) kemiske dele.
Udtømmende afvoksning ved trinvis Soxhlet-ekstraktion med et panel af opløsningsmidler med varierende polaritet tilvejebringer et effektivt middel til at isolere voks dele baseret på hydrofobe egenskaber deres alifatiske og aromatiske bestanddele, samtidig med at den kemiske struktur af cutin biopolyester. Den mekaniske ekstraktion af epicuticular voksarter og Selective fjernelse af intracuticular voks, når de overvåges af komplementære fysiske metoder, giver en hidtil uset mulighed for at undersøge neglebånd forsamlingen: denne tilgang afslører den supramolekylære organisering og strukturelle integration af forskellige typer af voks, at arkitektur cutin-voks matrix, og den kemiske Sammensætningen af hver bestanddel. Desuden viser faststof 13C-NMR forskelle i de relative antal af CHO-og CH2O kemiske dele til vildtype-og mutant røde modne tomater. NMR-teknikker giver særlige værktøjer til fingeraftrykket den molekylære struktur af kutikulære materialer, der er uopløselig amorf og kemisk uensartede. Som en noninvasiv overflade-selektiv imaging teknik, afgiver AFM en effektiv og direkte måde til at undersøge den strukturelle organisering af kutikulære samling på nm-um længdeskala.
Protocol
1. Enzymatisk Isolering af tomat neglebånd 5
- Placer flere kommercielle eller dyrkede tomater i en skål. Peel huden fra de frugter i store dele, kassere det indre skallerne væv. Vask tomatskind med deioniseret vand og bevare dem i vand i et bægerglas.
- Fremstilling af en 50 mM pH 4,0 natriumacetat-puffer (ved 31 ° C) ved at sætte 1,22 g natriumacetat-trihydrat (Mr. 136,08 g / mol) og 2,34 ml iseddikesyre (17,485 M) i et bægerglas, tilsætning af 200 ml deioniseret vand, og derefter justere pH til 4,0 ved 31 ° C. Fremstille en blanding indeholdende 4 ml pectinase (EF 3.2.1.15; 10 U ml-1, TCI America), 0,2 g cellulase (EF 232.734.4; 1,3 enheder / mg faststof, Sigma Aldrich) og 13 mg NaN3, og derefter tilsættes 196 ml natriumacetatpuffer med enzymblandingen til opnåelse af 200 ml af den endelige enzym cocktail. 5 Helt nedsænkes skrælles tomatskind i enzymet cocktail og inkuberved 31 ° C i 24 timer med konstant omrystning (G24 Environmental Incubator Shaker; New Brunswick Scientific Co.)
- Indsamle tomatskind med et køkken si eller Buchner tragt og vaskes med deioniseret vand. Derefter placere dem i en vakuumovn ved stuetemperatur i en time. Bevar de tørrede tomatskind i et mærket og lukket flaske for efterfølgende afvoksningsprocesser procedurer.
2. Udtømmende afvoksning ved Soxhlet-ekstraktion 6
- Det udstyr, der anvendes til udtømmende afvoksning består af en varmekilde (varmekappe og Variac controller), rundbundet kolbe til et opløsningsmiddel reservoir, Soxhlet-apparat, sintret glas fingerbøl eller engangs ekstraktionshætten, anti-støde chips og en kondensator (se fig. 1). Bemærk, at den smalle hæverten armen (dele 6 og 7 i fig. 1) er meget fin og udsat for brud, der kræver omhyggelig håndtering.
- Sættes 0,5-1 g af tomatskind (opnået itrin 1). i en morter, og formale prøven til et groft pulver med en pistil, medmindre prøverne skal anvendes til AFM målinger (afsnit 5). Fylde en sintret glas eller engangs fingerbøl omtrent halvvejs med prøven og anvende en pincet til at placere den omhyggeligt ved bunden af ekstraktionen søjlen.
- Sæt kondensatoren og pak det med alufolie. Opvarm methanol opløsningsmiddel (ACS-kvalitet) i nærvær af et par anti-støde chips, indtil det koger forsigtigt og tilbagesvaler på væggene af kolben. Omfatte opløsningsmidlet reservoiret med både glasuld og aluminiumfolie. Kontrollere processen i en time, forekommer at justere Variac spændingen, så at reservoiret akkumulerer omkring en dråbe pr sekund og hævertvirkning i Soxhlet-apparat, når bægeret er fuld.
- Fortsætte ekstraktionsprocessen i 12 timer, derefter sænke varmekappe og tillader apparatet at afkøle. Fjerne ekstraktoren og reservoiret som en enkelt enhed til bortskaffelse af opløsningsmidlet. Brug Plukrs at hæve fingerbøl til lige under halsen på udvinding kolonnen dræne overskydende opløsningsmiddel fra det, og Hætten anbringes på en ren overflade. Vippe ekstraktionskolonnen at tillade hævertvirkning ind i kolben nedenfor. Tag kolben og hæld affald i en mærket affaldsbeholder opløsningsmiddel beholder.
- Gentage trin 2.3 og 2.4 for successive opløsningsmidler gradvis aftagende polaritet, fx chloroform og hexan i 12 timer i hvert tilfælde.
- Tillade tomat cutin prøven tørre inde i bægeret, enten ved at blæse en strøm af nitrogengas over den eller ved at placere det i en vakuumovn ved stuetemperatur. Endelig måler massen af den tørre prøve og opbevares ved stuetemperatur i en skrue-top glas forseglet med parafilm.
3. Selektiv Isolering af Epicuticular og Intracuticular Voks 3,4
- Første vask hele tomater en særskilt batch af tomater fra dem der er beskrevet i 1). Med destilleret vand. Tør dem med PAPER håndklæder og Kimwipes, og læg dem dæmme nedad på et stykke aluminiumsfolie.
- Male hele tomater med 120% (vægt / vægt, masse-forhold) gummi arabicum vandig opløsning i en top-down måde og tillader omkring en time for gummi arabicum til at tørre på frugten hud, hvilket efterlader en tynd film. Fjern denne film med en pincet, pas på ikke at punktere tomat huden. Gentag proceduren en gang mere.
- Tilsættes filmene til hætteglas indeholdende 1:1 (v / v) chloroform-vand og bland i tre minutter. Efter kraftig omrøring og faseseparation, pipetteres ud chloroformfraktioner og inddampes dem i separate udækkede hætteglas, der forlader epicuticular voks. Tomater forbliver fysisk intakte. Dyppe dem i chloroform i to minutter ved stuetemperatur, og opsamles intracuticular voks efter afdampning af opløsningsmidlet. Dag, skræl tomaterne og behandle dem enzymatisk (med cellulase og pectinase i natriumacetat-puffer) til fjernelse af cellulose og pectin, henholdsvis (som beskrevet i
- Hvis det ønskes, udføre udtømmende afvoksning af disse enzymatisk isolerede cuticula ved Soxhlet-ekstraktion (se trin 2) ved hjælp af tre opløsningsmidler af varierende polaritet (methanol, chloroform og hexan, henholdsvis).
4. Molekylær karakterisering af tomatfrugt Indkoblingen ved krydspolarisation Magic-angle spinning Solid-state Kernemagnetisk resonansspektrum (CPMAS ssNMR) 6
- Place 4-6 mg fuldt afvoksede tomat neglebånd (indkobling) i en 1,6 mm fastMAS zirconia rotor ved hjælp af producents pakning værktøj. (Enten jorden afvoksede tomat neglebånd eller meget små stykker af delvis afvoksede neglebåndene er egnet.) Sørg for, at prøven er pakket ensartet, men ikke for stramt, i rotoren. Efter at have på toppen hætten, male halvdelen af den fælles landbrugspolitik med en sort-blæk markør pen til at lette målinger af spin sats.
- Juster shims af NMR spektrometer til minimum spektral linie bredde i halv højde ennd kalibrere proton (1 H) og carbon (13C) 90 ° impulsbredder anvendelse af en standard forbindelse, såsom adamantan.
- Brug af glycin eller glutamin som modelstoffer, at opnå maksimal signal intensitet ved at optimere alle parametre (Hartmann-Hahn matchende effektniveauer, 1 H - 13 C kontakt tid, heteronuclear 1 H afkobling styrken) af de krydspolarisation Magic-angle spinning (CPMAS) eksperiment. For spektre opnået ved en 1H frekvens på 600 MHz, anbefalede betingelser indbefatter 10 kHz eller 15 kHz spinding frekvens, en 3-sek mellem erhvervelser, og spinal heteronukleær proton afkobling 7 ved en magnetisk feltstyrke, der svarer til en frekvens på 185 kHz.
- Sæt cutin-pakket rotor i sonden. Derefter placere sonden i magneten. Øg spinding hastighed op til 10 kHz gradvist at kontrollere for god prøve pakning og rotor stabilitet. Verificere den sidste spindestabilitet af rotoren inden for± 20 Hz.
- Justere tuning og tilsvarende kondensatorer i proben iterativt at opnå minimal effekt refleksion ved både 1 H-og 13C NMR-frekvenser. Indstille eksperimentelle temperaturen til 25 ° C (eller stuetemperatur).
- Starte præoptimerede CPMAS eksperiment svarende til Hartmann-Hahn matchende tilstand bestemmes ved 10 kHz spinding frekvens.
- Anskaf 4096 transienter, behandler spektrum med eksponentiel (Lorentz) linjeudvidelse af 50-100 Hz, og gøre en Fourier transformation til at generere et NMR-spektrum af signalintensitet vs kemiske afskærmning (ppm).
- Referere 13C kemiske skift eksternt ved hjælp af adamantan indstillet til 38,4 ppm (-CH 2 - gruppe) 8 som en standard.
- Forøge rotoren roterer frekvensen til 15 kHz og gentage CPMAS målingen (trin 4,6-4,8) svarende til Hartmann-Hahn matchende tilstand bestemmes ved denne sidstnævnte roterer frekvens.
- Tre gentagelser endteved CPMAS eksperimenter (trin 4.1-4.9) med naturlige (voksagtig) og delvist afvoksede frugt kutikula prøver.
5. Probing Tomato Cuticle Surface med Atomic Force Microscopy (Digital Instruments Nanoscope IIIa; procedurer vil variere en smule blandt mikroskoper) 6
- Tænd for scanning probe mikroskop (SPM) (fig. 2), og sørg for, at mikroskopet tilstanden vippekontakt er indstillet til den kontaktperson, Atomic Force Microscopy (AFM) mode.
- Manuelt hæve SPM hovedet ved at dreje de to bruger-justerbare forreste knapper. Tag AFM tipholder fra SPM hovedet ved at dreje klemskruen på bagsiden af hovedet.
- Brug en pincet til at fjerne den eksisterende AFM cantilever fra tipholder, derefter forsigtigt fat i en ny siliciumnitrid cantilever (AFM probe) ud af pakken og installere det i stedet for den gamle cantilever. Brug en lysmikroskop at verificere, at nyinstallerede AFM cantilever ikke er brudt.
- Vedhæft the tomat kutikula prøve (en del af delvist afvoksede tomat kutikula ~ 10 mm x 10 mm) til en rustfri stålskive (prøve puck) med dobbeltsidet tape. Anvende et lysmikroskop at verificere, at kutikula overflade forbliver flad og glat efter placering af prøven på pucken.
- Placere puck med tomat kutikula prøve på magnetisk område øverst på SPM scanneren.
- Sæt de to forreste manuel justering skruer scanneren højt ved at dreje knapper, sætte motoriserede tilbage justeringsskruen til omtrent samme niveau som de andre to forreste skruer. Sørg for, at alle tre skruer er sat højt nok til at undgå at bryde AFM spidsen, når du placerer den tipholder i SPM hovedet.
- Sæt den tipholder i SPM hovedet og fastgør den ved at stramme klemskruen på bagsiden af hovedet.
- Når du har tændt laser, justere laseren plet på AFM cantilever ved hjælp af centrale (y) og højre (x) laser justeringsgrebene på toppen af hovedet.Overvåge reflekteres laserstrålen på et stykke papir for at placere laserpletten nøjagtigt ved udgangen af AFM cantilever.
- Justere positionen af det bevægelige spejl iterativt ved hjælp af fotodetektoren justeringsgrebene at opnå maksimalt signal (sumsignal), hvilket sikrer, at den reflekterede laserstrålen bliver modtaget jævnt af de fire kvadranter af fotodetektoren.
- Sænke AFM spids ved at trække den manuelle justeringsindretning forreste skruer og motoriserede bagsiden justeringsskrue af SPM scanneren, visuel overvågning af tilgang AFM spids mod prøveoverfladen med et omvendt mikroskop. Sørg for, at alle tre skruer er på samme niveau for at undgå artefakter fra imaging et skævt prøve. Bring spidsen mod prøven, men ikke så tæt, at spidsen rører eller pauser gennem prøven overfladen.
- På dette tidspunkt, reflekteret laserlyset fra AFM cantilever vil springe tilbage fra den bevægelige spejl til fotodetektoren. For kontakt AFM tilstand med en siliCon nitrid AFM tip, skal du indstille udgangssignalet (lodret udbøjning) spænding til -2 V til 0 V sætpunkt og DIFF Signal (lodret / vandret forskel) til 0 V ved at justere positionen af spejlet.
- Ved hjælp af Nanoscope softwaren, skal du klikke på mikroskopet ikonet og vælge den rigtige profil (Contact tilstand AFM).
- Brug af "Scan Controls Indstillinger" panel, indstille skanningshastigheden og scan størrelse fx 10 mikron scan størrelse og 2 Hz scan hastighed.
- Lad AFM spidsen til at engagere prøvens overflade, ved at klikke på engagere-tip-ikonet. Ved at styre motoriseret bagsiden skruen af SPM base, vil programmet nu sænke spids, indtil den indgriber med prøveoverfladen. Scanningsprocessen starter automatisk, når spidsen har haft held.
- Overvåg scanning processen med både billede og omfanget former for software, justering af parametre såsom setpunkt, integreret gevinst, proportionalforstærkning, scan størrelse, scan hastighed, linjer og prøver / line iterativt at opnå den højesteopløsning. Start scanning med en stor z-aksen område (data skala), derefter omhyggeligt at reducere data skalaværdien at observere den bedste kontrast af overflade funktioner på billedet. Minimere forekomsten af hvide områder i det scannede billede, som viser, at højden af overfladetræk overstiger tilgængelige z-aksen rækkevidde.
- Tag billedet for at gemme datafilen, så behandle data ved hjælp af udfladning funktioner til at fjerne billedfejl grund til lodret (Z) scanner drift, billed-buer, og lodrette forskydning mellem skanningslinjer; 9 Endelig beregner den gennemsnitlige ruhed. Efter at gemme data, trække AFM spidsen ved at vende virkningen af computer-kontrollerede skrue motor, der blev brugt til at udøve den. Billedbehandling kan udføres i offline billedanalyse mode og / eller bruge en anden computer.
- Brug de forreste nederste grå metal knapper i spidsen indehaveren til at ændre x og y positioner af scanningsområdet, og gentag målingen på fem prøve locationer til at kontrollere reproducerbarhed, erstatter AFM cantilever, hvis billedkvaliteten forringes.
6. Repræsentative resultater
Kemiske skift analyse af CPMAS 13C-NMR-spektre (fig. 3) identificerede de vigtigste funktionelle grupper i udtømmende afvoksede tomat kutikula (cutin). De vigtigste carbon dele i cutin biopolyester fandtes at være langkædede alifatiske (0-45 ppm), oxygeneret alifatiske (45-110 ppm), multipelt bundet og aromatiske (110-160 ppm) og carbonyler (160-220 ppm). De oxygenerede alkyldelene (CHO + CH2 O) spiller en afgørende rolle i etableringen kovalente forbindelser mellem de monomere enheder af cutin biopolymer, hvorved der dannes den molekylære arkitektur cutin matrix. Forskellene i de relative arealer observeret i det spektrale område mellem 45 og 100 ppm foreslår, at mutanten cutin har en relativt stor andel af tværbinding dannende CHO Structura l dele sammenlignet med vildtype-cutin, omhyggelige kvantitative målinger ved hjælp af direkte polarisering (DPMAS) NMR 5 metoder støtter denne antagelse (data ikke vist).
CPMAS 13C-NMR-spektre viste også en gradvis aftagende voks top ved 31 ppm (fig. 4), hvilket indikerer sekventiel fjernelse af EPI-og intracuticular voks fra cutin-voks komposit samtidig bevare primære kemiske struktur af cutin biopolymer. Parallel AFM billede analyse (Fig. 5) afslørede ujævnheder på grund af den trinvise ekstraktion af EPI-og intracuticular voks fra frugten neglebånd, der betyder ændringer i organiseringen af kutikulære samling.
. Figur 1 Soxhlet-apparat (billede kilde: Wikipedia).
"/>
Figur 2. A) Scanning probe mikroskop. B) SPM hoved (tilpasset fra AFM træningsmanual fra Digitale instrumenter).
Figur 3. 150 MHz CPMAS 13C NMR-spektrene for udtømmende afvoksede røde modne tomatfrugt cuticula (indkobling) fra vildtype-(M82) og mutant (CM15) viser resonanser med kemiske skift svarende til de funktionelle grupper af en tværbundet hydroxyfatty syre baseret polyester og også nogle multipelt bundet dele. Alle spektre blev erhvervet med en 10 kHz spinding frekvens.
Figur 4. 150 MHz 13 CCPMAS NMR-spektre af kommercielle røde moden tomat frugt neglebånd udvise sammensætning ændres ved sekventiel fjernelse af epicuticular og intracuticular voks af gummi arabisk mekanisk udsugning og en two-minutters chloroform dip, hhv. Alle spektre blev erhvervet med en 15 kHz spinding frekvens.
Figur 5. AFM billeder og ruhed skøn for den delvist afvoksede kommercielle tomat neglebånd beskrevet i figur 4, efter en trinvis fjernelse af epicuticular (venstre) og intracuticular (højre) voks.
Discussion
De her beskrevne protokoller muliggør detaljerede molekylære og mikro karakterisering af et kompleks umedgørlig plantemateriale uden behov for destruktiv kemisk nedbrydning. For at undersøge blanding af cutin biopolyester med forskellige lipider (voks), der kontrollerer den strukturelle organisering af kutikulære forsamling, 10 har vi gennemført og overvåget procedurer for selektiv fjernelse af epicuticular og intracuticular voks fra den heterogene kutikulære blanding. Faststof-13C NMR blev anvendt til at måle ekstraktion af voks molekylære bestanddele, og atomic force-mikroskopi tjente til at undersøge samtidige ændringer i overfladeruhed. 6,11 at sammenligne de tværbindende kapacitet indkobling fra dyrkede vildtype og enkelt-genet mutante tomater blev faststof 13C-NMR også anvendt til at estimere det relative antal af CHO-og CH2O kemiske dele.
En række af design-funktions af denne protokol er bemærkelsesværdige. Som voksmaterialer omfatter en lang række lipider, behandling af frugt kutikula med en række opløsningsmidler med forskellige polariteter er afgørende for at opnå fuldstændig afvoksning. Desuden kan afvoksning variere fra 8 til 24 timer afhængigt af arten af de kutikula prøver. For at udtrække epicuticular voks konsekvent fra intakte frugt hårstrået, er det bydende nødvendigt at anvende klæbemiddelbelægningen ensartet på overfladen.
Solid-state-CPMAS 13C NMR 12 er en hurtig kvalitativ metode til identifikation af forskellige strukturelle komponenter af meget heterogene og uopløselige vegetabilske biopolymerer samtidig bevare deres oprindelige fysiske karakteristika 13 traditionelle løsning-NMR kan også anvendes til at karakterisere de ekstraherede voks blandinger. Hvis kvantitativ vurdering af funktionelle grupper er ønsket for intakte planteceller polymerer, 5 hi-fi direkte polarisationsniveauer magic-angle spinning (DPMAS) 13C NMR 5,14 bør anvendes som en supplerende metode. Nøjagtig kvantificering af de funktionelle grupper kræver omhyggelig optimering af recirkulations gange, excitations pulslængder, og styrken af heteronukleær afkobling. 15. heteronukleær afkobling kan indstilles til en 1H feltstyrke i området fra 50 kHz til 185 kHz ved anvendelse af TPPM 16 eller Spinal 7 metoder. Ud over disse parametre afhænger af følsomheden af CPMAS målinger på spin-lock tid og Hartmann-Hahn matchende tilstand. 15 i stedet for traditionelle CPMAS, kan en skrå-amplitude CP (RAMP-CP) teknik anvendes for at maksimere tværs polarisationsretning effektivitet ved at variere 1H amplitude lineært (~ 20-50%) eller tangentielt samtidig med amplituden af 13C feltstyrke konstant under spin-lock periode (eller omvendt). 17,18 Gennemførelse af CPMAS målinger på mindst to forskellige roTor-spinning frekvenser er vigtigt at skelne spinning sidebånd fra de vigtigste spektrale toppe.
Samtidige AFM målinger foretaget i kontakt tilstand sætte direkte billeder af neglebånd overfladen tilstand med høje scanningshastigheder og høj opløsning, 19 for eksempel under sekventiel fjernelse af voksagtige bestanddele. Opererer AFM i tappe (ikke-kontakt) tilstand, kan anvendes som et alternativ til overfladen karakterisering af fine "bløde" plantematerialer, undgå mulig beskadigelse på grund af laterale (forskydning) kræfter og skrabning af prøveoverfladen. 5,20 I begge tilfælde , sekventiel erhvervelse af flere billeder af det samme sted på overfladen tjener til at identificere en overflade beskadigelse som følge af "probe-overflade interaktioner 'i AFM målinger. 6,21 For optimal reproducerbarhed bør AFM prober med fjederkonstanter er egnede til bløde kutikulære overflader være anvendes, og konstant temperatur og fugtighed skal opretholdes. 6,15,20 22,23 til sporing overflade topografi af disse udsøgt komplekse makromolekylære forsamlinger. 1,2
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af US National Science Foundation tilskud # MCB-0741914 og MCB-0843627; yderligere infrastruktur blev ydet støtte på City College i New York af National Institutes of Health 2 G12 RR03060-26 fra National Center for Research Resources. Vi takker for JKC Rose gruppe i Cornell University Plantebiologi Institut for at give M82 (vildtype) og CM15 (mutant) tomat neglebånd. Vi takker Dr. Spyros Monastiriotis fra CCNY Kemiteknik gruppe af professor Alexander Couzis for hans generøse hjælp med AFM eksperimenter. Vi takker Ms Lauren Gohara for grafisk design support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium acetate trihydrate | Sigma-Aldrich | S8625-500G | |
| Pectinase | TCI America | P0026 | EC 3.2.1.15; 10 U ml-1, store in refrigerator |
| Cellulase | Sigma-Aldrich | C1184-100KU | EC232.734.4; 1.3 units/mg, store in refrigerator |
| Glacial Acetic acid | Sigma-Aldrich | A9967 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | Extremely hazardous |
| Incubator/shaker | New Brunswick Scientific | Model No.G24 | MFG No.M1036-000G |
| Vacuum Oven | Precision Scientific | 31566 | |
| Variac Controller | |||
| Sintered glass thimble (85 mm/25mm) | VWR international | 89056 | |
| Disposable extraction thimble ( 80 mm/ 25 mm) | VWR international | 28320 | |
| Methanol | VWR international | EMD-MX0485-7 | |
| Glass wool | VWR international | RK20789 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
| Tweezers | VWR international | 82027-452 | |
| Chloroform | VWR international | EM-CX1050-1 | |
| Hexane | Fisher Scientific | H302-4 | |
| Nitrogen gas | |||
| Parafilm | VWR international | 52858 | |
| Paper towels | VWR international | 89002-984 | |
| Kim wipes | VWR international | 21905-026 | |
| Gum arabic | Sigma-Aldrich | G9752 | |
| 1.6 mm fastMAS zirconia rotor | Varian Inc., Agilent | ||
| NMR spectrometer | Varian Inc., Agilent | standard bore magnet | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | Model compound for CPMAS |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | 49419 | Model compound for CPMAS |
| Adamantane | Sigma-Aldrich | 100277 | To calibrate 90° pulse in NMR |
| Multimode Scanning Probe Microscope (Nanoscope IIIA) | Digital Instruments | ||
| Nanoscope software | Digital Instruments | Version 5.30r3sr3 (2005) | |
| AFM probe (Nonconductive silicon nitride tip) | Veeco Instruments, Inc. | Model NP-20 | |
| Light microscope | Digital Instruments | ||
| Magnetic puck | Digital Instruments | ||
| Double sided tape | VWR international | ||
| Fruit Peeler | |||
| Büchner funnel | VWR international | 89038 |
References
- Dom#237;nguez, E., Heredia-Guerrero, J. A., Heredia, A. The biophysical design of plant cuticles: an overview. New Phytologist. 189, 938-949 (2011).
- Bargel, H., Koch, K., Cerman, Z., Neinhuis, C. Structure-function relationships of the plant cuticle and cuticular waxes - a smart material? Functional Plant Biol. 33, 893-910 (2006).
- Jetter, R., Schäffer, S. Chemical Composition of the Prunus laurocerasus Leaf Surface. Dynamic Changes of the Epicuticular Wax Film during Leaf Development. Plant Physiol. 126, 1725-1737 (2001).
- Vogg, G. Tomato fruit cuticular waxes and their effects on transpiration barrier properties: functional characterization of a mutant deficient in a very-long-chain fatty acid β-ketoacyl-CoA synthase. J. Exper. Botany. 55, 1401-1410 (2004).
- Isaacson, T. Cutin deficiency in the tomato fruit cuticle consistently affects resistance to microbial infection and biomechanical properties, but not transpirational water loss. Plant J. 60, 363-377 (2009).
- Round, A. N. The Influence of Water on the Nanomechanical Behavior of the Plant Biopolyester Cutin as Studied by AFM and Solid-State NMR. Biophysical J. 79, 2761-2767 (2000).
- Fung, B. M., Khitrin, A. K., Ermolaev, K. An Improved Broadband Decoupling Sequence for Liquid Crystals and Solids. J. Magn. Reson. 142, 97-101 (2000).
- Morcombe, C. R., Zilm, K. W. Chemical shift referencing in MAS solid state NMR. J. Magn. Reson. 162, 479-486 (2003).
- Fang, S. J., Haplepete, S., Chen, W., Helms, C. R., Edwards, H. Analyzing atomic force microscopy images using spectral methods. J. App. Phys. 82, 5891-5898 (1997).
- Pollard, M., Beisson, F., Li, Y., Ohlrogge, J. B. Building lipid barriers: biosynthesis of cutin and suberin. Trends. Plant Sci. 13, 236-246 (2008).
- Stark, R. E. NMR studies of structure and dynamics in fruit cuticle polyesters. Solid State Nucl. Mag. 16, 37-45 (2000).
- Schaefer, J., Stejskal, E. O. Carbon-13 nuclear magnetic resonance of polymers spinning at the magic angle. J. Amer. Chem. Soc. 98, 1031-1032 (1976).
- Sachleben, J. R., Chefetz, B., Deshmukh, A., Hatcher, P. G. Solid-State NMR Characterization of Pyrene-Cuticular Matter Interactions. Envir. Sci. & Tech. 38, 4369-4376 (2004).
- Zlotnik-Mazori, T., Stark, R. E. Nuclear magnetic resonance studies of cutin, an insoluble plant polyester. Macromolecules. 21, 2412-2417 (1988).
- Stark, R. E., Garbow, J. R. Nuclear magnetic resonance relaxation studies of plant polyester dynamics. 2. Suberized potato cell wall. Macromolecules. 25, 149-154 (1992).
- Bennett, A. E., Rienstra, C. M., Auger, M., Lakshmi, K. V., Griffin, R. G. Heteronuclear Decoupling in Rotating Solids. J. Chem. Phys. 103, 6951-6958 (1995).
- Metz, G., Wu, X. L., Smith, S. O. Ramped-Amplitude Cross-Polarization in Magic-Angle-Spinning NMR. J. Magn. Reson. Ser. A. 110, 219-227 (1994).
- Peersen, O. B., Wu, X. L., Smith, S. O. Enhancement of CP-MAS Signals by Variable-Amplitude Cross-Polarization - Compensation for Inhomogeneous B-1 Fields. J. Magn. Reson. Ser. A. 106, 127-131 (1994).
- lessandrini, A., Facci, P. AFM: a versatile tool in biophysics. Measurement Sci. & Tech. 16, 10-1088 (2005).
- Benítez, J. J., Matas, A. J., Heredia, A. Molecular characterization of the plant biopolyester cutin by AFM and spectroscopic techniques. J. Struct. Biol. 147, 179-184 (2004).
- Koch, K., Neinhuis, C., Ensikat, H. J., Barthlott, W. Self assembly of epicuticular waxes on living plant surfaces imaged by atomic force microscopy (AFM). J. Exper. Bot. 55, 711-718 (2004).
- Muller, D. J. AFM: A Nanotool in Membrane Biology. Biochemistry. 47, 7986-7998 (2008).
- Last, J. A., Russell, P., Nealey, P. F., Murphy, C. J. The Applications of Atomic Force Microscopy to Vision Science. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6083-6094 (2010).
