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Immunology and Infection

在仓鼠的背部皮肤:皮肤利什曼病Antileishmanial药物筛选的一个有用的模型

doi: 10.3791/3533 Published: April 21, 2012

Abstract

传统上,仓鼠实验接种在鼻子或脚垫。然而,在这些网站溃疡并不总是发生,测量病灶大小,是一个很难的过程和动物显示困难,吃饭,呼吸,因为移动的病变。为了优化皮肤利什曼病,年轻的成年男性和女性的金黄地鼠,仓鼠模型(Mesocricetus鲫鱼 )皮内注射在背侧皮肤与1至1.5×L0 7 promastigotes的利什曼物种及后续病变的进展进行评估,最多16周后感染。金黄地鼠被选中,因为它被认为是足够的生物模型,以评估对利什曼原虫的药物,因为它们很容易受到感染不同物种。皮肤感染仓鼠但控制慢性病灶,临床演变与人类观察到的迹象类似的结果。因此,建立Øf的感染程度测量根据病灶硬结和溃疡面积的大小是可行的。这种方法已被证明它的多功能性,易于管理,在接种跟进和表征不同处理后通过不同的方式,获得临床标本典型病变(溃疡),应用的治疗。动物的生命质量有关运动使用这种方法,还保存着寻找食物和水,游戏和社交活动。

Protocol

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1。感染仓鼠

1。动物

用于自交系男性和女性的黄金仓鼠(Mesocricetus鲫鱼 ),6-8周,体重140-160克。他们被安置在动物设施,在温度控制的住宿,饲喂标准啮齿类动物干制食品和水随意提供。所有的程序,涉及动物机构的实验动物使用的伦理委员会批准。之前与dermotropic 利什曼寄生虫的动物实验感染的性别鉴定,标志着加权按规范的程序。动物性别鉴定,检查,如乳腺线和ANO生殖器女性短距离的可视化,或睾丸和肛门和男性的包皮之间的距离更大的可视化鲜明的特点。然后,动物被标记穿耳洞或染色面积的皮肤用浸泡棉签苦味酸。耳穿孔,耳后,用70%酒精清洁利用老鼠的耳朵冲被刺穿。必须避免与血管的区域。建议镇静或麻醉与氯胺酮(50毫克/公斤)和Xilacine(20毫克/千克)腹腔容积260-300μL25-G的针混合9时01分。最后,动物被放置在一个精确的平衡条件的一个陷阱或方块,他们权衡。

2。寄生虫

promastigotes的dermotropic 利什曼物种,如属亚马孙 ,双相的诺维-MacNeal尼科尔(NNN)培养基中培养,在26°C。亚循环(固定)相promastigotes(5天)用于感染仓鼠。简言之,寄生虫收获,洗两次使用磷酸盐缓冲液(PBS),计数和接种男性或女性在0.1毫升PBS调整为1×10 7(男性)或1.5×10 7(女性)寄生虫,分别,然而,接种量可能会有所不同,根据利什曼物种(程序在视频显示)。

3。实验感染

接种前一个面积的皮肤被剃。简言之,麻醉动物被放置在俯卧位,并用剪刀,把头发从两英寸的尾巴的基地。清理后用无菌生理盐水溶液剃光面积寄生虫接种皮内注射,直至形成丘疹。

4。临床随访

动物进行监测,每7天到4 - 6周后接种病变的外观。不久,动物被固定在一个陷阱和接种面积的皮肤被触及。然后,形成溃疡的硬结区划定并用游标卡尺测量溃疡的宽度和长度。

2。仓鼠的治疗

1。 ADMInistration的化合物

治疗计划开始时,动物们溃疡病变(接种后4-6周)。动物主要分布在5-6动物群体为每个要测试的化合物。化合物可以外用,口服,肌注或病灶路线管理。药物应用之前,仓鼠麻醉,用生理盐水或PBS清洗病灶​​区域。当化合物是通过局部或病灶,仓鼠是固定的陷阱,让暴露的面积治疗时,该化合物是由口服或肌肉注射航线管理的同时,仓鼠被牢固地固定颈部的基础。一)局部应用适用于:复合病变和动物,几分钟后返回笼子。 b)对于肌肉注射,注射的药物是(200μL最大)通过半腱半膜肌躯。 c)对于口腔ADMInistration,该药物的动物提供探头连接到1毫升注射器通过奥罗胃14G(200μL最大)。 d)对于病灶内注射毒品(100微升最大)正在逐步注入在使用26G计针的斜面放置下来溃疡基地。针旋转覆盖整​​个区域的病变。每天在10-20天的治疗管理,根据定义的治疗方案。

2。临床随访

因为在这个实验模型的有效性取决于新antileishmanial化合物根据治疗后病灶的愈合和疤痕,每个动物进行临床监测每周在大院,长达三个月后申请结束。监测期间,病变的类型描述和硬结和溃疡面积测量与游标卡尺。到t的不同地区存在的病灶他接种部位以及病灶复发的外观也被描述和登记。每两个星期,动物加权和病变图。动物每天观察监测:一)外表(头发,协调,温度,眼睛,耳朵的位置,梳洗,排便,腹水存在,搅拌和脱水)和b)的行为(清醒,警惕,好奇,周到,保持同组,食品和饮料,硬期待赶上)。充血,炎症,咬和脱毛的存在,也观察到的复合应用程序的网站。

仓鼠也是在45天的治疗,以确定血液和血清学的价值可与相关化合物的毒性(见下文)结束后放血。

每次治疗的有效性进行评估比较前病变的大小和治疗后,使用下面的得分小号ystem: 治愈 (100%的面积和病变完全消失愈合); 临床症状明显改善 (> 50%的面积在减少病灶大小); 临床失败 (增加病灶的大小); 复发的病灶上固化后)。在研究结束时,吸入二氧化碳以前麻醉处死动物。死亡后,寄生虫学,组织学和血清学分析所需的样本采取。

3。寄生虫学考试

利什曼在从皮肤样本(病变或疤痕)的存在,肝,脾,肾的决定直接检查涂片染色吉姆萨1和这些组织病理检查(见下文)。

在病变部位的寄生虫负担极限稀释法估计,根据提图斯和同事(1985)2。简言之,一个组织的一小块是REMoved从每个动物,称重,匀浆冷PBS溶液用注射器柱塞。在4°C离心10分钟获得暂停在600克此后,被丢弃上清,并与抗生素1%和10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中悬浮颗粒。转移到每个96口井的悬浮一百L的含50μL施耐德中NNN以中等覆盖微孔板保持在26°C。在这promastigotes可以通过考试检测倒置显微镜下一个月每星期的最高稀释可行的寄生虫在每个样品的数量确定。

4。皮损病理检查(或瘢痕)和其他组织

一个从皮肤,肝脏和肾脏活检标本的第三部分是在10%福尔马林固定,石蜡包埋。从脾和心脏标本也可能是processeD。五微米的固定组织切片染色与haemotoxilin,曙红和使用200X,400X或1000X油浸研究微架构,细胞渗透的特点,和寄生虫的存在或没有光学显微镜下检查。显微照片和数字图像捕获。

5。治疗毒性评价

有毒活性化合物的基础上跟进(见上文)在临床监测参数根据动物的身体和行为的条件。根据血液在血液样本,如上所述,在与haemotoxilin - 伊红染色的组织切片观察病理变化和代谢参数也决定毒性。

从心,最好的心室的血液样本。血液测试,血液转移对EDTA抗凝管和处理雅丁规范完整的血球计数的协议。血清学检查,血液转移到1.5离心瓶,离心获得血清肌酐,ALT和BUN水平的代谢分析测量使用柯达Ektachemdry化学3。

6。数据分析

数据处理和未经处理的动物相比,使用方差的检验。意义设定为P <0.05。

3。代表结果

总结

皮肤利什曼病的仓鼠模型进行了改进,利用该模型在药物疗效筛选目标。在仓鼠的皮肤皮肤原发感染后,病变的发展和寄生虫参数进行了研究。自交系的男性和女性的金黄地鼠(Mesocricetus鲫鱼 ),6-8周,皮内注射1×10 7(男性)或1.5×10 7(女)元L 循环(固定相)promastigotes 亚马孙 。结节出现20 - 35天PI后4-6周丕成立感染后形成溃疡,疗效评价,两种剂量的五价锑(SBV)。仓鼠随机分为三组,每组5只动物中,葡甲胺锑酸盐在80或120 SBV毫克/千克每天在10天肌肉注射治疗。第三组用PBS肌肉注射安慰剂。 A组的三只动物是未经处理的,作为阴性对照。每次治疗的反应的治疗期结束后3个月随访。

1。临床课程后研究亚马孙感染金黄地鼠(Mesocricetus鲫鱼

在背部皮肤感染的仓鼠不断发展,临床上明显的表皮溃疡,感染后4-6周。病变开始与小结节和溃疡结束根据感染后的时间和增加在大小达到被视为一种实验性药物的效果评价最优规模由第四至第六周后感染(18,99 54,7毫米2 4周35,55到92,71毫米,在6周2)( 图1,图2)。病灶,随后保持长达20周后感染明显的溃疡,而在此时,实验终止( 图1)。

感染由L.亚马孙并不影响仓鼠体重的变化从104,9 124,69克和129,71到134,02克,分别在未受感染和感染仓鼠(P> 0.05,ANOVA)。在研究过程中获得的动物平均25,58±5,98%的体重。赛瑞肌酐和丙氨酸氨基转移酶(ALT)和血象参数值分别为未感染利什曼原虫感染仓鼠的参考值。 ONLy的BUN尿素氮(BUN)水平增加60%的受感染的动物。

病变的组织病理学分析与研究感染的仓鼠亚马孙显示,与那些未受感染的动物的差异。在一般情况下,从仓鼠感染的皮肤活组织切片检查显示没有炎症反应或任何病理改变( 图3a),而那些感染 L 亚马孙发展肉芽肿性皮炎和丰富的巨噬细胞浸润真皮( 图3b)存在。 L感染仓鼠的组织病理学分析亚马孙和葡甲胺锑在80和120的SBV毫克/千克/天在10天的剂量治疗的感染过程相似,那些在对照组(感染和未经处理)的观测相关的更改。在一般情况下,仓鼠的皮肤样本呈轻微的浆水平(20%)和中性粒细胞(80%)中等陪同浸润淋巴细胞(80%),温和(20%)或严重(80%)( 见表2)巨噬细胞的浸润。这些意见符合诊断的肉芽肿性皮炎,炎症性的事件,损害的真皮和下方的所在肌肉。这是主要的病变相关的感染,这是严重的表现与皮肤利什曼病在动物研究中的所有兼容。该协会统计相关时,卡方培,产生P <0.05。在肾皮质和glomerules伴随着轻微的肾脏萎缩75%的动物,动物的60-100%的肾脏样本呈中度增生。这些意见与膜增生glomerulonefritis,先前已感染有关其他利什曼物种感染的诊断兼容。统计协会是大皮尔逊P <0.05与卡方。 40-100%的肝脏各组imals表明在肝细胞轻微的空泡变化,可伴有生理过程,如肝细胞的糖原积累。其他如脂肪变性,纤维化和拥塞肝组织异常对应的感染过程。其他意见,如在肝细胞中的液泡改变,cardiomegalies,胞浆内eosinophiles夹杂物的存在,以及在肾管细胞空泡没有统计学相关(P> 0.05)的测试化合物的毒性作用,并有可能由于在仓鼠的生理过程。

2。葡甲胺锑酸盐在仓鼠模型的疗效

表1总结了在不同的时间点,治疗后的临床表型感染仓鼠。 SBV 120毫克/公斤/天的剂量肌肉注射葡甲胺锑的重量在10天的治疗高效诱导完全回归的研究在所有动物的的亚马孙病变( 图4)。 2和8周后治疗期间内治愈的比例是100%。然而,三个月后复发的病变观察20仓鼠%。当葡甲胺锑酸盐在80毫克SBV /公斤体重管理,彻底治愈观察,仅在3只动物。在其他两种动物的病变下降了33,9和69,0%,分别为( 图5)。经过3个月内,L。亚马孙保持目前在葡甲胺锑酸盐治疗在SBV 80毫克/公斤/天的剂量,所有动物的皮肤,只有SBV 120毫克/公斤/天葡甲胺锑酸盐治疗的动物之一。治疗剂量的肌肉注射120 SBV毫克/公斤/天在10天的决定。

使用稀释法的限制,估计寄生虫数量呈显着减少为治疗组与MEGLUMINE锑比较负(未处理)的控制和车辆(安慰剂)治疗组(P <0.001)。病变部位在未经处理的动物和用PBS治疗的,可行的寄生虫(每0.4至1.6毫克的皮肤组织的寄生虫)检测。只分离的动物,没有回应与葡甲胺锑酸盐治疗:一个120毫克/公斤/天( 图5b)和80毫克/公斤/天( 图5c)治疗仓鼠治疗的动物寄生虫。没有区别,观察葡甲胺锑比较后,未经处理或处理用PBS这些动物没有治愈的仓鼠寄生负载。

在皮肤活检病理组织学SBV 120毫克/千克/天肌肉注射葡甲胺锑酸盐治疗的仓鼠没有寄生虫观察,看到一些巨噬细胞和淋巴细胞浸润真皮( 图6A,6B)。相反,当仓鼠我们重新处理与葡甲胺锑酸盐80 SBV毫克/公斤/天,广泛地被发现( 图6C,6D),肉芽肿性皮炎真皮浸润的巨噬细胞的大量存在。

3。毒性

使用相同的治疗方案疗效的研究,在80和120的SBV毫克/公斤体重,葡甲胺锑的毒性进行了评价。一般健康状况和体重监测的最后一次给药后3个月。治疗没有影响仓鼠体重变化从104,9 124,69和129,71到134,02 GR GR在未受感染和感染仓鼠,分别。动物获得的27,59±4,22%的体重平均在治疗期间及28,74±2,26%,在后续(P> 0.05,ANOVA)。减肥没有观察到任何治疗组(数据未显示)。赛瑞肌酐和丙氨酸氨基转移酶(ALT)和血象参数值在未处理和葡甲胺锑酸盐治疗仓鼠的参考值是相似的。仅BUN尿素氮(BUN)水平增加20%,处理的动物。

L感染仓鼠的组织病理学分析亚马孙和与葡甲胺锑酸盐治疗剂量为80和120 SBV毫克/公斤/天10天期间发现没有相关的药物毒性的变化。

表1
磷酸盐缓冲液,B 处理后几天。
表1临床表型的研究 亚马孙实验仓鼠葡甲胺锑酸盐治疗后感染。

每次治疗的有效性进行了评估比较前和治疗后的病灶大小,使用以下的评分系统: 治愈 (100%的面积和病变完全消失愈合)临床症状明显改善 (> 50%的面积在减少病灶大小); 临床失败 (增加病灶的大小);复发(病变治愈后激活)

表2
答:不存在的迹象;适用:不适用; M:温和,M:中等,S:严重;中性粒细胞:中性粒细胞;国家安全法:无显着性病变,妊娠期糖尿病:肉芽肿皮肌炎; PGD的:Pyogranulomatous皮炎。 1。淋巴管; 2。矿产类材料。
表2。仓鼠的皮肤组织病理学实验感染 L 亚马孙和葡甲胺锑酸盐治疗。

图1
图1。皮肤病灶发展的历程后感染仓鼠皮下接种1-1.5×10 7 L。亚马孙亚循环(stationa RY阶段)promastigotes在20周。 Y轴代表以毫米为单位的溃疡面积。

图2
图2(b)和6个星期(三)发展中的金黄地鼠背皮肤溃烂病灶在2个星期(一),4周后的10×10 7皮内接种Photographyic历史。

图3
图3(一)仓鼠未受感染和未经处理的:皮肤活检观察无炎症反应,既没有显着的病理改变;(二)仓鼠感染和治疗肉芽肿性皮炎与多核巨细胞的存在(箭头加星号)和丰富的寄生虫(黑箭头)和巨噬细胞(白色箭头)浸润真皮。苏木素 - 伊红染色400X。

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图4。摄影史上的临床反应的仓鼠感染 L 亚马孙和SBV 120毫克/公斤/天在10天肌肉注射葡甲胺锑酸盐治疗。图片显示,在治疗(10天)(二)年底前病变的治疗(一)外观,并在后续:30天(C),60(d)和90(e)在治疗。

图5
图5。葡甲胺锑酸盐在治疗皮肤利什曼病鼠的有效性。金黄地鼠感染 L 亚马孙在背侧皮肤。感染6周后,他们是未经处理的(a)或在PBS单(二),葡甲胺锑120 SBV毫克/公斤/天(c)或80的SBV毫克/公斤/天(D)10天肌肉注射治疗。图表显示的比例减少病灶大小(0天)治疗结束,在15天,30,治疗结束后随访60 90。 P <0.001为120或80 SBV毫克/公斤/日主场迎战车辆,而不是治疗。

图6
图6。皮肤活检SBV 120毫克/公斤/天(A,B)和80毫克SBV /公斤/天(C,D)感染者和肌肉注射megumine antinmoniate治疗仓鼠。稀缺的巨噬细胞和淋巴细胞浸润真皮的存在。没有寄生虫遵守。苏木精 - 曙红染色200X(一),(三)具有丰富的巨噬细胞浸润,真皮广泛存在的1000倍(C)肉芽肿性皮炎。泡沫巨噬细胞与phagocyted寄生虫。苏木精 - 曙红染色200X(二),1000X(D)。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Ketamine Reagent Holliday –Scott S.A
Xilacine Reagent Synthesis
PBS Reagent GIBCO, by Life Technologies 14190-136
Digital caliper Equipment Fisher Scientific 15-077-958
Giemsa Reagent Sigma-Aldrich GS1L-1L
Formalin Reagent Nova lab 11273
Paraffin Reagent Pechiney Plastic Packaging PM-996
Haemotoxilin Reagent Nova lab 10870103
Eosin Nova lab 10870203
Kodak Ektachem dry chemistry Equipment Kodak Ektachem DT-60
meglumine antimoniate Reagent Aventis
Microscopy Equipment Nikon Instruments YS2-T

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References

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Robledo, S. M., Carrillo, L. M., Daza, A., Restrepo, A. M., Muñoz, D. L., Tobón, J., Murillo, J. D., López, A., Ríos, C., Mesa, C. V., Upegui, Y. A., Valencia-Tobón, A., Mondragón-Shem, K., RodrÍguez, B., Vélez, I. D. Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs. J. Vis. Exp. (62), e3533, doi:10.3791/3533 (2012).More

Robledo, S. M., Carrillo, L. M., Daza, A., Restrepo, A. M., Muñoz, D. L., Tobón, J., Murillo, J. D., López, A., Ríos, C., Mesa, C. V., Upegui, Y. A., Valencia-Tobón, A., Mondragón-Shem, K., RodrÍguez, B., Vélez, I. D. Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs. J. Vis. Exp. (62), e3533, doi:10.3791/3533 (2012).

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