Summary
En rättfram uppsättning metoder för att isolera och fastställa identiteten för den mest förekommande proteiner som uttrycks i skelettmuskulaturen. Cirka 800 platser är skönjas på en två-dimensionell gel från 10 mg muskel, detta gör det möjligt för bestämning av könsspecifika protein uttryck. Dessa metoder ger likvärdiga resultat i de flesta vävnader.
Abstract
Gross kontraktion i skelettmuskel främst bestäms av ett relativt litet antal kontraktila proteiner, men denna vävnad är också anmärkningsvärt att anpassa till miljöfaktorer 1 såsom hypertrofi av motstånd motion och atrofi av glömska. Den uppvisar därmed ombyggnader och anpassningar till stressfaktorer (värme, ischemi, tungmetaller osv.) 2,3. Skador kan uppstå på muskler av en muskel kraft brukas under förlängning, det så kallade excentrisk kontraktion 4. Den kontraktila proteiner kan skadas i sådana ansträngningar och måste repareras, förstörd och / eller resynthesized, dessa funktioner är inte en del av kontraktila proteiner, men i andra mycket mindre riklig proteiner i cellen. Att avgöra vad delmängd av proteiner är inblandade i en förbättring av denna typ av skada måste en global Proteome fastställas innan träning 5 och sedan följde efter det att arbetet med att bestämma differentialprotein uttryck och därmed markera kandidat proteiner i anpassningarna till skadan och dess reparation. Dessutom har de flesta studier av skelettmuskulaturen gjorts på den manliga av arten och därmed kanske inte vara representativ för kvinnliga muskel.
I denna artikel presenterar vi en metod för att utvinna proteiner reproducerbart från manliga och kvinnliga muskler, och separera dem med två-dimensionell gelelektrofores följt av högupplöst digital bildbehandling 6. Detta ger ett protokoll för fläckar (och senare identifierade proteiner) som visar en statistiskt signifikant (p <0,05) två-faldig ökning eller minskning, visas eller försvinner från staten. Dessa är sedan exciderad, kokas med trypsin och åtskilda av högtrycks-vätskekromatografi kopplad till en masspektrometer (LC / MS) för protein identifiering (LC / MS / MS) 5. Denna metod (Figur 1) kan användas på många vävnader med liten eller ingen förändring (lever, hjärna, höraT osv.).
Protocol
1. Provberedning
- Använd färska, flash-fryst eller RNAlater behandlade vävnad från möss som utgångsmaterial. Blot bort överflödigt konserveringsmedel med en Kimwipe innan du fortsätter.
- Ta bort alla senor och fascia runt muskler och finhacka vävnaden med enkla kanter rakblad i 2 min på kylda glasplåtar i ett kylrum (4 ° C) tills vävnaden är väl malet eller pulver. Samla upp provet i en vägde pre-mikrofugrör och fastställa vikten av vävnaden. Använd inte mer än 10 mg av den vävnad som din utgångsmaterial.
- Tillsätt 45 mikroliter extraktionsbuffert (8 M urea, 50 mm DTT, 4% käkar, 0,2% bärare ampholytes 5 / 8, 0,0002% Bromfenolblått) per 1 mg malet vävnad, vid rumstemperatur. Om volymen är större än 350 mikroliter, lägg till 350 mikroliter initialt och homogenisera (steg 1,4), tillsätt sedan resten av bufferten för att minimera stänk.
- Homogenisera vävnaden sju gånger med en motoriserad mortelstöt (Kontes Corp) i 15 sekunder vid4 ° C, med två minuter kylning på is mellan varje homogenisering.
- Centrifugera proverna vid 15.600 xgi 30 minuter vid 4 ° C. Spara supernatanten och mäta dess volym. Cellen skräp pellet kasseras.
- Utfällning av proteiner i supernatanten med iskall reagens-grade aceton (3 gånger v: v ratio). Vortexa rören i 15 sekunder. Centrifugera 15.600 xgi 10 sekunder för att bilda pellets, och återsuspendera i extraktionsbuffert med Kontes motor och polypropylen omrörning stavar (BioSpec Prod)
- Upprepa steg 1,6.
- Antingen fortsätta med proteinkoncentration uppskattning av proverna eller lagra dem vid -20 ° C.
2. Proteinkoncentration uppskattning
Använd Lowry analysen 7 eller BCA analysen 8 (Pierce), sikta på ca 4,5 mg ml -1.
3. Isoelektrisk fokusering
- Ta bort en ReadyStrip IPG strip (11 cm, pH 5-8, Bio-Rad)från -20 ° C och låt det utjämna till RT i 10-15 min.
- Vortex provet och pipettera 600-800 mikrogram (total volym 200 mikroliter) av protein prov i en rak linje på baksidan kanten av en kanal i provet rehydrering facket, vilket innebär att ungefär 1 cm i varje ände.
- Använd pincett, dra av plastskyddet för IPG strip - se till att hantera endast ändarna på remsan och undvika all kontakt med gelen. Notera grundläggande slutet av remsan och placera den på vänster sida av facket. Placera IPG strip gelen och ner på toppen av provet Undvik att droppa bubblor under. Låt den rehydrera i en timme.
- Overlay med 2,5 ml mineralolja (BioRad). Täck facket med lock, och låt rehydrera över natten i rumstemperatur.
- Placera ett papper veke i båda ändar av att fokusera brickan kanalen och våt var och en med 10 mikroliter Millipore vatten.
- Ta ut IPG band och håller vertikalt i ca 10 sekunder tappa ur oljan. Blot plast bAcking med Kimwipe.
- Placera IPG sidan band gel ner och med grundläggande änden till vänster i fokus facket. Täck remsan med 2,5 ml mineralolja.
- Placera facket i SKIFTANDE IEF cellen (Bio-Rad) och programmera en 3-stegs-protokollet (tabell 1) vid standard cell temperatur av 20 ° C, en maximal ström på 50 μA / band, och ingen rehydrering tid.
Spänning Tid Volt-timmars Ramp Steg 1 250 20 min Linjär Steg 2 8000 2,5 tim Linjär Steg 3 8000 40 tusen Snabb Totalt 6,5 tim 40 tusen Tabell 1. Tre-stegs-protokollet av SKIFTANDE IEF cell för 11 cm IPG remsor.
- Ta IPG remsor ur IEF cellen med hjälp av pincetten. Blot plasten uppbackning med en Kimwipe och placera IPG sidan remsan gel upp i en ren rehydrering facket. Du kan täcka rehydrering facket och slå in den med plastfolie och förvara vid - 80 ° C eller fortsätta.
4. SDS polyakrylamidgelelektrofores
- Överför remsan (gel uppåt) i en 11 cm jämvikt facket.
- Tillsätt 4 ml av minskad buffert (6 M urea, 2% SDS, 0,05 M Tris / HCl pH 8,8, 20% glycerol, 2% DTT) till kanalen och jämvikt remsan i 10 min med lätt skakning.
- Ta bort minskning buffert, tillsätt 4 ml alkylering buffert (6 M urea, 2% SDS, 0,05 M Tris / HCl pH 8,8, 20% glycerol, 2,5% iodoacetamide) och balansera remsan i 10 minuter med mild skakning.
- Skölj IPG band genom att doppa STRIp kort i 1 X SDS löpande buffert (25 mM Tris, 192 mm glycin, 0,1% SDS, pH 8,2).
- Lägg sidan remsan gelen upp på bakstycket av 11 cm Kriterium prefabricerade 10,5% -14% Tris-HCl SDS polyakrylamidgel (Bio-Rad) och tryck den försiktigt i så att den gör full kontakt med SDS gel; se till att inga bubblor är fångade mellan de två gelen ytor.
- Overlay IPG band med 1 ml smält agaroslösningen (0,5% agaros, 25 mM Tris, 192 mm glycin, 0,1% SDS, Bromfenolblått) och låt agarosen stelna i 5 minuter.
- Ladda 5 mikroliter av protein markör 10-225 kDa (USB, P / N: 76.740) i den inre såväl som molekylvikt standarder.
- Kör gelen i SDS buffert (25 mM Tris, 192 mm glycin, 0,1% SDS, pH 8,2) vid 200 V vid rumstemperatur eller i ett kylrum (4 ° C) med hjälp av Bromfenolblått migration färgämne framför att övervaka elektrofores.
- Ta bort gelen från plasten rösterna fläcken över natten genom att skaka försiktigt Coomassie Brilliant BlueR-250 bets (45,5% metanol, 45,5% dH2O, 9,0% ättiksyra, 0,25% Coomassie Brilliant Blue R-250).
- Skaka gelen i Avfärga 1-lösning (45,5% metanol, 45,5% dH 2 O, 9,0% ättiksyra) två gånger för 3 timmar vardera och i Avfärga 2 (5% metanol, 90% dH 2 O, 5% ättiksyra) över natten. Förvara gelen i 7% ättiksyra för analys.
5. Gel avbildning och analys
- Ta bilder av geler med Kvantitet Ett program som driver VersaDoc Imaging System (BioRad). Beskära bilden områden enhetligt för alla geler i experimentet.
- Ladda beskurna bilder på PDQuest 8,0 programvara för att skapa ett experiment uppsättning. Följ guiden experimentet att definiera parametrar för platsen upptäckt och plats matchande över geler. Inspektera och förfina plats matchande resultat manuellt vid behov.
- Utför kvantitativ och statistisk analys av geler för att upptäcka matchas protein fläckar med twO-faldigt eller högre statistiskt signifikanta skillnader i uttryck mellan de två gelen grupperna. Skapa en analys set med dessa fläckar av intresse och skär dem med hjälp av en fräs EXQuest plats (BioRad) för trypsin matsmältning och LC-MS-protein identifiering.
6. I-gel Tryptic matsmältningen
För detta steg en modifierad Pierce In-Gel Tryptic Digest Kit (# 89871X, Pierce) protokollet används.
- Tillsätt 200 mikroliter av avfärgningslösning (25 mm ammoniumbikarbonat, 50% acetonitril) på gelen pluggar. Vortexa och inkubera proverna vid 37 ° C i 30 minuter med skakning. Ta försiktigt bort och kassera lösningen.
- Upprepa steg 6,1.
- Tillsätt 30 mikroliter av nyberedd minska buffert (50 mM tris [2-carboxyethyl] fosfin, 22,5 mm ammoniumbikarbonat) till rören innehåller gelen pluggar och inkubera vid 60 ° C i 10 minuter.
- Låt prover svalna, ta sedan bort och kasta minska buffert.
- Tillsätt 30 mikroliter av alkylering buffert (100 mm iodoacetamide, 20 mm ammoniumbikarbonat, beredas omedelbart före användning i folie förpackade rör. Inkubera proverna i mörker vid rumstemperatur under 1 timme.
- Ta bort och kasta alkylering buffert. Tvätta gelen pluggarna genom att tillsätta 200 mikroliter av avfärgningslösning till varje rör. Inkubera proverna vid 37 ° C i 15 minuter.
- Ta bort och kasta avfärgningslösning och upprepa tvätt.
- Tillsätt 50 mikroliter acetonitril på gelen pluggar och inkubera dem i 10 minuter i rumstemperatur för att låta dem krympa torka sedan försiktigt bort acetonitril.
- Upprepa steg 6,8 gång mer. Gel bitar ska se ut vitt och små.
- Låt gelen bitar för att torka i en Centrivap Concentrator (Labconco, modell EX1245) i 10 minuter.
- Swell gelen bitarna genom att lägga till 10 mikroliter av aktivt trypsin lösningen (10 ng / mikroliter trypsin, 25 mm ammoniumbikarbonat). Inkubera vid rumstemperatur i 15 minutes.
- Tillsätt 25 mikroliter matsmältningen buffert (25 mM ammoniumbikarbonat) till rören. Inkubera proverna i rumstemperatur över natten med skakning.
- Sonikera proverna i 10 minuter (Branson, bad sonicator modell 2510) och spinn ner dem innan du tar bort supernatanten till ett nytt rör. Spara supernatanten.
- För att ytterligare extrakt peptider, lägg till 10 mikroliter på 0,1% myrsyra och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur med skakning. Sonikera proverna i 10 minuter, samla supernatanten och kombinera med sparade supernatanten i steg 6,13.
7. Microscale avsaltning av peptider extrakt
- Ta bort ammonium bikarbonat och andra salter i peptid extrakt med hjälp av PepClean C-18 Spin Columns (ThermoFisher) enligt tillverkarens anvisningar.
- Eluera peptider två gånger med 20 mikroliter 70% acetonitril, dunsta proverna torra genom centrifugering i Centrivap Concentrator i 1 timme och återsuspenderapeptiderna i 10 mikroliter 0,1% myrsyra för MS analys.
8. Protein identifiering av HPLC-kopplad masspektrometri
- Separat 5 mikroliter av peptiden blandningen på en högpresterande vätskekromatograf (HPLC) under 40 minuter, med hjälp av en linjär 2-50% acetonitril övertoning med 0,2% myrsyra på en Pepswift monolitisk PS-DVB kolumn (Dionex) kopplat till en Nanospray jag källa på en jonfälla masspektrometer (LCQ Deca XP Max, Thermo Fisher Scientific) med en flödeshastighet på 400 Nl / min vid spetsen.
- Identifiera peptid MS1 signaler mellan 400 - 1400 m / z och ge utrymme för de 3 mest intensiva jon toppar kan isoleras för MS2 sekvensering genom CID med dynamisk utslagning.
- För protein identifiering, analysera peptiden resultat via en Sequest mus referensdatabas sökning (BioWorks programvara, Thermo-Fisher Scientific) med en statisk alkylerade cystein modifiering och dynamiska ändringar för fosforyleringen (serin, treonin, tyrosin), methylaning (histidin), oxidation (metionin), ADP-ribosylation (arginin) och N-terminal acetylering. Applicera konservativa matchande kriterier (t.ex. peptid tolerans satt till 2 AMU och 1,00 fragment tolerans, proteiner innehåller minst två peptider passerar en Xcorr vs filter laddningstillstånd [z = 1 / x = 1,5, z = 2 / x = 2,00, z = 3 / x = 2,50, z = 4 / x = 3,00] och en sannolikhet på p <0,05) 5 och manuellt kontrollera MS-spektra för säker protein identifiering.
9. Representativa resultat:
Manliga och kvinnliga outnyttjade var murina skelettmuskulatur (biceps brachii) extraheras och separeras i en två-dimensionell karta 5, den första nivån av muskeln jämförande Proteome (Figur 2). När visualiseras med hög upplösning digital bildbehandling, ca 800 protein fläckar upptäcktes i varje. Använda manliga proteomet kartan som utgångspunkt, är det tydligt att det finns många ställen att förändringar i överflöd i den kvinnliga proteom. Platsen stödnivåer åtgärder av förändringen i proteinet mängder (Figur 3). Identiteter av proteinet fläckar som ändrar mer än två gånger (upp eller ner) och är statistiskt signifikant (p <0,05) med ett n = 5 möss, bestäms av aminosyrasekvensen analys med vätskekromatografi-kopplad masspektrometri. Dessa resultat visar att kvinnor visar ett överflöd minskning i ämnesomsättningen socker energi enzymer och kreatinkinas (CK) isoformer, en annan energi system i musklerna. Både människor och djur visa högre manliga serum CK i vila och efter träning 9,10, men serum CK inte nödvändigtvis korrelerar med mängden myofibrillar störningar 11,12. Detta kön dimorphism i cellens överflöd av CK i murina biceps brachii muskeln är en roman finding5 och kan svara på den fysiologiskt olika serum CK-värden.
Siffror:
g1.jpg "/>
Figur 1. En övergripande schematisk av protokollet för jämförande proteomik. Protokollet är indelad i tre grupper: provberedning, provanalys, och, protein identifiering. Ändarna på varje av dessa tre grupper av protokollen är också rimligt att pausa platser, även om de bästa resultaten samlat om det övergripande protokollet sker utan att stanna.
Figur 2. Jämförelse av kvinnliga murina biceps brachii protein spots i förhållande till samma platser i manliga biceps brachii (gröna cirklar o). Fläckar som ökat är större än eller lika med två gånger hos kvinnor är inringade röda (o) och de som minskade mindre än eller lika med två gånger är inringade blå (o).
Figur 3 Gel Spot Intensitet Analys:. X-axel, honaföre träning (kontroll, n = 5), Y-axel, kvinnliga enda anfall 0 hr tidpunkten gruppen (n = 5). Regressionslinje: korrelationskoefficient = 0,919; lutning = 0,976; snappa = -0,0293. Spots över den röda linjen och under den blå linjen förändringen mer än + / - två gånger.
Discussion
LC / MS proteomik metoden som presenteras här är en mest tillförlitliga och reproducerbara protokoll för en snabb analys av den första nivån i skelettmuskulaturen proteom. Det möjliggör en någorlunda ändamålsenligt jämförelse av kön specificitet. Liten förekomst proteiner skulle kräva en fraktionering av muskeln prov att ta bort så många av de kontraktila proteiner som möjligt och därmed öka den låga överflöd proteiner. Skräddarsy proteomet profilen kan ske med olika IPG pH remsor och suppleanter procent geler lutning om så önskas. Känsligare fluorescerande fläckar finns, men vi rekommenderar att varje laboratorium fastställa linjäriteten av dessa fläckar i ditt system. För en mer noggrann analys av proteinuttryck i Dige systemet (tvådimensionell In-gelelektrofores system, GE Healthcare Life Sciences) kan användas, men detta lägger till en nivå av komplexitet med metoden. Vidare kan protokollet beskrivs nedan användas med de flesta djurMal vävnader för vilka arvsmassan har sekvenserat, liksom de novo sekvensering av ett protein från en källa, så länge det kan lösas på ett två-dimensionell gel, eftersom överlappande enzymatiska fragment kan genereras med hög renhet enzymer utöver till trypsin. Prover från andra vävnader källor kan kräva vissa förändringar i utvinning metoden, särskilt om efter membranet och hydrofoba proteiner, har vi dock haft goda resultat med hjälp av detta protokoll med hjärt-, lever, njurar och vävnader hjärnan. Andra post-translationella modifieringar kan upptäckas genom att modifiera masspektrum kriterier databassökning. Sammanfattningsvis har vi presenterat ett rimligt detaljerad första protokoll för proteom profilanalys.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Yutian Gan för användning av Figur 3. Detta arbete stöddes av National Science Foundation 0420971, den Smith College Blakeslee, Wilens och Holmes medel, och Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PepClean C-18 Spin Columns | Consumable | Thermo Fisher Scientific, Inc. | PI-89870 | |
| Pepswift monolithic column (100um x 5 cm) | Consumable | Dionex | 162348 | |
| Criterion pre-cast 10.5%-14% Tris-HCl SDS polyacrylamide gels | Consumable | Bio-Rad | 345-0106 | |
| Readystrip IPG strips | Consumable | Bio-Rad | Varying pH ranges | |
| Acetic acid | Reagent | Fisher Scientific | A465-1 | |
| Acetone | Reagent | Pharmco Products, Inc. | 329000 | |
| Acetonitrile | Reagent | Fisher Scientific | A955 | |
| Agarose | Reagent | Bio-Rad | 163-2111 | Overlay solution |
| Ammonium bicarbonate | Reagent | Fluka | 40867 | |
| Bromophenol blue | Reagent | Fisher Scientific | BP114 | |
| Bio-Lyte Ampholytes | Reagent | Bio-Rad | Varying pH ranges |
|
| CHAPS | Reagent | USB Corp., Affymetrix | 13361 | |
| Commassie blue R-250 | Reagent | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 20278 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Reagent | USB Corp., Affymetrix | 15395 | |
| Formic acid | Reagent | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 28905 | |
| Glycerol | Reagent | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| Glycine | Reagent | USB Corp., Affymetrix | 16407 | |
| Iodoacetamide | Reagent | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Methanol | Reagent | Fisher Scientific | A452 | |
| Mineral oil | Reagent | Bio-Rad | 163-2129 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Reagent | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| Tris base | Reagent | Sigma-Aldrich | 93349 | |
| Tris[2-carb–xyethyl] phosphine | Reagent | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 77720 | |
| Trypsin Endoproteinase, TPCK treated, MS grade | Reagent | Pierce, Thermo Scientific | 90055 | modified |
| Urea | Reagent | USB Corp., Affymetrix | 75826 | |
| Water | Reagent | Burdick & Jackson | 365 | |
| Centrivap Concentrator | Tool | Labconco Corp. | ||
| Exquest spot cutter | Tool | Bio-Rad | ||
| LCQ Deca XP Max ion trap mass spectrometer | Tool | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Motorized pestle | Tool | Kontes Corp | ||
| Polypropylene stirring | Tool | Biospec Products | ||
| rods | ||||
| PROTEAN IEF cell | Tool | Bio-Rad | ||
| Sonicator | Tool | Branson | ||
| Surveyor Plus HPLC system | Tool | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| VersaDoc imaging system | Tool | Bio-Rad |
References
- Fehrenbach, E. Molecular and Cellular Exercise Physiology. Mooren, F. C., Völker, K. , Human Kinetics. New York. 199-217 (2005).
- Mooren, F. C.
- Thompson, H. S., Clarkson, P. M., Scordilis, S. P. The repeated bout effect and heat shock proteins: intra-muscular HSP27 and HSP70 expression following two bouts of eccentric exercise in humans. Acta. Physiol. Scand. 174, 47-56 (2002).
- McHugh, M. P. Recent advances in the understanding of the repeated bout effect: the protective effect against muscle damage from a single bout of eccentric exercise. Scand. J. Med. Sci. Sports. 13, 88-97 (2003).
- Metskas, L. A., Kulp, M., Scordilis, S. P. Gender Dimorphism in the Exercise-Naïve Murine Skeletal Muscle Proteome. Cell Molec. Biol. Lett. 15, 507-516 (2010).
- Lopez, J. L. Two-dimensional electrophoresis in proteome expression analysis. J. Chromatogr. B. 849, 190-202 (2007).
- Lowry, O. H., Rosenburg, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J.
- Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, M. D., Fujimoto, E. K., Goeke, N. M., Olson, B. J., Klenk, D. C.
- Norton, J. P., Clarkson, P. M., Graves, J. E., Litchfield, P. L., Kirwan, J. Serum creatine kinase activity and body composition in males and females. Hum. Biol. 57, 591-598 (1985).
- Amelink, G. J., Kamp, H. H., Bär, P. R. Creatine kinase isoenzyme profiles after exercise in the rat: sex-linked differences in leakage of CK-MM. Pflügers. Arch. 412, 417-421 (1988).
- Kendall, B., Eston, R. Exercise-induced muscle damage and the potential protective role of estrogen. Sports Med. 32 (2), 103-123 (2002).
- Tiidus, P. M. Can oestrogen influence skeletal muscle damage, inflammation, and repair? Br. J. Sports Med. 39, 251-253 (2005).
