Summary
Protokoller til kimcelle transplantation og testikel væv xenografting er beskrevet. Kønsceller celletransplantation resulterer i donor-afledt spermatogenesen i modtagerlandene testikler og repræsenterer et funktionelt rekonstituering analyse til identifikation af spermatogonial stamceller (SSC'er). Testis væv xenografting reproducerer testis udvikling og spermatogenese af forskellige donorarterne i recipientmus.
Abstract
Kønsceller transplantation blev udviklet af Dr. Ralph Brinster og kolleger ved University of Pennsylvania i 1994 1,2. Disse banebrydende undersøgelser viste, at mikroinjektion af kønsceller fra frugtbare donormus ind sædkanalerne af infertile modtagerlandenes mus resulterer i donor-afledte spermatogenese og sperm produktion af modtageren dyret 2. Brugen af donorhandyr bærer det bakterielle β-galactosidase-genet tillod identifikation af donor-afledte spermatogenese og transmission af donor haplotype til afkommet af modtagerlandene dyr 1. Overraskende, efter transplantation ind i lumen af de semniferøse tubuli, var transplanterede kimceller stand til at bevæge fra den luminale rum til det kælderen membranen, hvor spermatogonier er placeret 3. Det er generelt accepteret at kun SSC'er er i stand til kolonisere niche og genetablere spermatogenese i modtagerlandene testis. Derfor, kim celletransplantation tilvejebringer en funktionel tilgang at studere den stamcelle niche i de testis og at karakterisere putative spermatogonial stamceller. Til dato, bliver kimcellens transplantation anvendes til at belyse basal stamcelle biologi, til at producere transgene dyr gennem genetisk manipulation af kimceller forud for transplantation 4,5, at studere Sertoli celle-kimcelle interaktion 6,7, SSC homing og kolonisering 3, 8, såvel som SSC selvfornyelse og differentiering 9,10.
Kønsceller transplantation er også muligt i store arter 11. I disse, er de vigtigste applikationer bevarelse af fertilitet, formidling af elite genetik i dyrepopulationer, og generering af transgene dyr som studiet af spermatogenesen og SSC biologi med denne teknik er logistisk sværere og dyrere end i gnavere. Transplantation af kønsceller fra store arter ind sædkanalerne af mus resulterer i colonization af donorceller og spermatogonial ekspansion, men ikke i deres fulde differentiering formodentlig på grund af uforenelighed modtageren somatiske celler rum med kønsceller fra fylogenetisk fjerne arter 12. En alternativ metode er transplantation af kønsceller fra store arter sammen med deres omgivelser somatisk rum. Vi først rapporteret i 2002, at små fragmenter af testis væv fra umodne mænd transplanteret under ryghud immundefekte mus er i stand til at overleve og gennemgå fuld udvikling med produktion af befrugtning kompetent sæd 13. Siden da testikel væv xenografting har vist sig at være en succes i mange arter, og opstod som et værdifuldt alternativ til at studere testis udvikling og spermatogenese af store dyr i mus 14.
Protocol
DEL A. Germ celle transplantation i mus
1. Udarbejdelse af recipientmusene
- Modtagere skal være immunologisk tolerante (enten genetisk tilpasset til donorer eller immun-mangel) til donoren testisceller.
- Modtagere skal enten være naturligt fri for spermatogenesen (f.eks W / W mod mus) eller tømt af endogene kønsceller. Kønscelle celle depletering kan opnås ved bestråling eller kemoterapeutiske lægemidler såsom Busulfan. I denne protokol, beskriver vi fremgangsmåden til fremstilling recipientmus med Busulfan.
- Behandl modtagere på 4-6 uger af alder ved ip injektion af busulfan. Den optimale dosis af Busulfan er stamme afhængig. I almindeligt anvendte støttemodtagende stammer, er en dosis på 40-50 mg / kg tilstrækkelig til at nedbryder endogene kimceller (f.eks 44 mg / kg for nøgne mus, 50 mg / kg for B6/129 F1-modtagere).
- Opløses Busulfan pulver i DMSO og derefter tilføje en lige så stort volumen sterilt destilleret vand to foretage en slutkoncentration på 4 mg / ml. Holde opløsning varm ved 35-40 ° C før bruge til at undgå udfældning af Busulfan. Kassér opløsning, hvis den nedbør der observeres.
- Efter Busulfan behandling, skal der være mindst en måned før brug modtagere. Modtagere kan bruges mellem 1 måned og 3 måneder efter Busulfan behandling.
2. Forberedelse af mikroinjektion pipetter
- Vælger borsilicatglashulsfærer pipetter (kapillarrørene) med en 1,0 mm ydre diameter, en 0,75 mm indre diameter, og en længde på 3 inches.
- Siliconize glas pipetter med Sigmacote, skylles pipetter med methanol og blæse tør.
- Træk pipetter ved hjælp af en pipette aftrækker. Forskellige pipette skyder maskiner har forskellige indstillinger, derfor, teste et par indstillinger. Generelt, kan en indstilling svarende til den, anvendt til fremstilling af enucleation pipetter fungere.
- Bryde de pipettespidser under dissektionsmikroskop forud at bruge til at opnå en diameter på ca 50 umpå spidsen.
3. Forberedelse af donorceller til transplantation
- Choise af donorstamme er afhængig den eksperimentelle studerede spørgsmålet. Hvis kvantificering af spermatogenesen bruges som endepunkt, brug af donorer med en let identificerbar genetisk markør som Lac-Z (f.eks B6.129S7-Gt (ROSA) 26Sor / J fra Jackson Laboratory) eller GFP (f.eks C57BL/6-Tg ( CAG-EGFP) 1Osb / J fra Jackson Laboratory).
- Forberede 7 ml af collagenase i DMEM ved 1 mg / ml, 4 ml af trypsin-EDTA (0,25% trypsin plus 1 mM EDTA), og 2 ml DNase i DMEM ved 7 mg / ml. Dette beløb er for at fordøje 2 donormus testikler.
- Saml testikler aseptisk og fjern tunica albuginea. Spread sædkanalerne forsigtigt med fine pincet for at lette enzymatisk nedbrydning.
- Overførselsgebyrer tubuli ind collagenase, inkuberes ved 37 ° C i 5-10 min, og omrystes hyppigt.
- Vaskes tubuli to gange ved spinding (200-300 g i 3 min) og re-suspenderende i PBS w / o Ca 2 + +
- Re-suspendere tubuli i trypsin-EDTA og ryst, indtil de bliver klæbrig og uklar. Overvåge fordøjelsen af tubuliene ved 37 ° C som det burde forekomme inden 1-2 min.
- Tilføj DNase og ryst godt. Inkubér i 1-2 min.
- Tilsættes 3 ml af FBS at standse handling af enzymer.
- Filteret cellesuspension under anvendelse af en nylon mesh med 40-70 um porestørrelse at fjerne celle / væv stumper.
- Indsamle celler ved 600 g i 5 min og resuspender celler i en lille mængde af DMEM (<100 ul).
- Tæl celler og justere lydstyrken til en ønsket slutkoncentration (normalt 100 x 10 6). Holde Cellesuspensionen på is før til at bruge.
- Hver Busulfan-behandlede muse testis vil blive fyldt med kun 10-15 ul cellesuspension. På grund af potentielle spild og lækage, har til formål at få 30-50 pi per testikel.
4. Transplantation procedure (figur 1)
- Bedøv modtagere følgende godkendte protokoller.
- Place i dorsaltilbagelænethed og kirurgisk forberede abdominale område. Lav en ~ 1cm midtlinie abdominal incision at eksponere bugvæggen. Løfte bugvæggen ved anvendelse af små pincet ved punktet for den hvide linjen til at undgå uheld skade underlivsorganer, og fortsæt til gøre en ~ 0,5 cm indsnit ved midterlinjen af bugvæggen at blotlægge det peritoneale hulrum.
- Brug en iris pincet til at holde bugvæggen, og bruge et andet par af iris pincet for at søge efter de fedtpuder knyttet til epididymis og testis i bughulen. Træk forsigtigt fedtpuden ud, indtil testiklerne er blotlagt og testikel arterie og epididymis er klart synlige. Arbejde på én testis ad gangen.
- Læg et tyndt sterilt forklæde lavet fra autoklaveret kartotekskort under fedtpuden / testikel for bedre visuel identifikation (valgfrit). Afdækningsstykket arbejder også på at absorbere væske.
- Tilføje et dråbe Trypan Blå farvestof ind i cellen suspensionen og omhyggeligt indlæse den celle suspensionen ind i polyethylene slange forbundet til en 1 ml sprøjte. Fastgør trukket pipetten ind i rør og forsigtigt tvinge den celle suspensionen ind i pipetten ved at påføre tryk til sprøjten.
- Identificer de efferente kanaler (som forbinder testiklerne til bitestiklen), og fjern forsigtigt fedtvæv omkring kanalerne. Arbejde med forsigtighed, da kanalerne og membran omkring dem er gennemsigtige.
- Sæt forsigtigt pipetten i en kanal i pakken, efferente kanaler, forsigtigt Tråd et par mm mod testiklerne.
- Samtidig undgå flytter injektionen pipette, nå for sprøjten, forsigtigt trykkes stemplet af sprøjten at sikre, at suspensionen strømmer ind i rete testis og seminiferøse tubuli begynder at udfylde.
- Injektionen sats og strømning af cellesuspension er reguleret af tommelfingeren tryk. Undgå pludselige stigning i trykket, overvåger flytning af suspensionen i tubuli.
- Stop injektion, når næsten alle overflader tubuli er blevet fyldt før testiklerne begynder at BECOme iskæmisk.
- Returnere testis til den abdominale kavitet. Gentag procedure på de kontralaterale testis. Suturere bugvæggen med 6-0 silkesutur og luk huden med metal sårklemmer. Overvåg mus på en opvarmning pad indtil fuld helbredelse.
5. Analyse af de modtagende testiklerne
- Tillad 2-4 måneder efter transplantationen før analyse.
- Afliv modtageren musen i henhold til pasning af dyr og retningslinjer for anvendelse og indsamle testiklerne og epididymis i PBS. Når der en Lac-Z transgen donor stamme er blevet anvendt, kan den bitestiklen bruges som en positiv farvning kontrol, som det har endogen beta-galactosidase-aktivitet.
- For påvisning af donorceller ved at Lac-Z farvning, fastsætte den testis i 1-2 time ved 4 ° C i 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS. Skyl 3 x 30 min ved stuetemperatur i lacZ skyl buffer.
- Inkuberes natten over ved 37 ° C i lacZ farvning opløsning. Testis kan farves som en helhed eller efter dispergerendetubuliene.
- Fix og opbevar i 10% neutral pufret formalin. Hvis dele er nødvendige bruge neutrale hurtigt rød som mod-pletten.
DEL B. Ektopisk xenografting i mus
(Fra Dobrinski og Rathi 2008 15, og Rodriguez-Sosa et al. 2011 16).
1. Indsamling af donorvæv
- Opnå testis væv ved hjælp af kastration eller biopsi fra en donor mandlig.
- Place testis i PBS eller biopsier ind dyrkningsmedium, opretholdelse sterile betingelser.
- Holde den opsamlede vævet på is og transport til laboratoriet.
2. Forberedelse af donorvæv
- Udøve i vævskultur emhætten at opretholde sterilitet.
- Vask hver testikel i is-koldt PBS, der indeholder antibiotika to til tre gange, før du overfører til en kultur-fad med PBS. I tilfælde af biopsier, vaske testis fragmenter to til tre gange med is-kold kultur medium indeholdende antibiotika ved centrifugering ved 150g i 2 minutter og resuspendering i frisk is-kold dyrkningsmedium.
- For intakte testikler, du fjerne tunica vaginalis ved at gøre en incision langs den overfladen og ekstrudere de testis. Fjern fra testis alle bilag strukturer (sædstrengen, epididymis, bindevæv). Vask testikler gang i koldt PBS og overføres til en kultur-fad med PBS.
- Omhyggeligt fjerne tunica albuginea af den testis ved hjælp af en skalpelblad og et par af sakse. Hvis den testis er meget lille, kan tunica fjernes ved at klemme testikelvæv ud af tunica gennem et lille incision foretaget på ene ende, mens du holder tunica med et par af små pincet på den anden ende.
- Afhængigt af størrelsen af den testis enten hele testiklerne vævet kan skæres i små stykker på omkring 1 - 2 mm 3 i størrelse hjælp af buede forceps og en skalpelblad, eller store stykker af testis væv kan 1:a fjernes fra testis og derefter skåret i mindrestykker. Alt dette bør ske i iskoldt dyrkningsmedium og under sterile forhold i et lille kultur parabol (60 x15 mm).
- Overføre de tilberedte vævsfragmenter til is-kold dyrkningsmedium i små kulturen-skåle på is indtil podning.
3. Kastration af modtagerens mus
- Bedøve muse som ovenfor og forberede sterilt kirurgisk felt ved klipning håret (ikke nødvendigt i nøgne mus), aftørring med 70% Ethanol og Betadine løsning.
- Gøre en 0,5 -1 cm ventral midtlinie hud incision for at blotlægge den abdominale væggen.
- Omhyggeligt blotlægge testis, den testikel arterien og epididymis som beskrevet i Del A, 4,2-4,3.
- Loesrive hale af de epidydimis fra det gubernaculum ved stump dissektion.
- Liger testikel arterie, og vas deferens sammen med blodkar med silke, og § de ligerede strukturer ved at skære mellem testiklerne og ligatur.
- Gentag proceduren for second testis.
- Suturere den abdominale væggen med en eller to kirurgiske sting.
- Lukke incision i huden med en eller to Michel klip.
4. Ektopisk xenografting
- Placer musen i ventrale tilbagelænethed og forberede et sterilt kirurgisk felt på ryggen som ovenfor.
- Afhængigt af hvor mange grafter befinder skal indsættes (generelt 4-8/mouse), -0,5 cm lange hudincisioner foretage på hver side af midten linie af bagsiden af musen.
- Brug pincet til at holde en kant af incision i huden, og gøre en subkutan hulrum ved at drille hinanden i bindevævet med en saks.
- Brug af en iris pincet sted et stykke testis væv dybt ind i subkutane hulrum, holder grænsen af huden snittet med en anden iris pincet.
- Luk incision i huden med en Michel klip og holde musen på varmepude, indtil det begynder at komme fra anæstesi.
- Overfør musen til et bur med ekstra isolering og samarbejdever og monitoren, indtil musene er fuldt tilbagebetalt.
5. Indsamling af testis implanteret til analyse og sæd høst
- Afliv værten musen i henhold til pasning af dyr og retningslinjer for anvendelse af, og lave en midtlinie incision i huden på ryggen huden løber fra halen til halsen og åbne huden. Denne blotlægger de podninger, der kan placeret enten på det subkutane væv eller fastgjort til huden.
- Forsigtigt fjerne de transplantaterne anvendelse af et par pincet og et par af sakse.
- Rekordstort antal af transplantater genvundet, størrelse og vægt af de enkelte vin.
- Hent sædblærerne fra maven af mus og registrere deres vægt som en indikation af testosteron produktionen af det transplanterede væv.
- Til histologisk analyse
- Suspendere xenotransplantater ind prøve, hætteglas indeholdende Bouins opløsning (eller anden fiksativ) i et volumen ~ for 10x, at af xenotransplantatet, og etiketten hætteglasset passende vis.
- Inkubernatten over i køleskabet efterfulgt af vask mindst 3 gange i 70% ethanol ved intervaller på 24 timer fortrinsvis.
- Fortsæt til behandling og indstøbning i paraffin.
- For sæd høst
- Vaske xenotransplantater ved at spinding dem ned ved 300g i 1 min og resuspendering dem i dyrkningsmedium indeholdende antibiotika.
- Skæres transplantater i små stykker og hakkekød omhyggeligt med de pincet i et væv dyrkningsskål indeholdende 3 - 5 ml af kultur medium.
- Filter hakket væv gennem 40 um cellefilter.
DEL C. Repræsentative resultater
1. Kimcellens transplantation
Hvis den transplanterede donorcellen suspension indeholder spermatogonial stamceller celler, der bærer en genetisk markør såsom LacZ transgen, kolonisering af donordata SSC'er i de modtagende testis kan være visualiseres ved X-gal-farvning som særprægede blå segmenter af seminiferous tubuli efter 2-3 måneder post-transplantation 3 (figur 2A). Et veletableret koloni skal have en lang mørk blå strækning af helt fyldt segmenter med to eller flere lag af blå celler tættere på centrum, og relativt svagere farvede regioner på begge ender, hvor et netværk af enkelt, parret eller små grupper af blå celler er tilsyneladende 3 (figur 2B). Et tværsnit af den mørkeblå seminiferous tubulus region skal afsløre veletablerede og velorganiseret spermatogenesen med blå kønsceller på forskellige differentiering stadier (Figur 2C).
2. Testikel væv xenografting
Levedygtigheden af testis væv efter transplantation er omvendt korreleret med udviklingsstadium af donoren; det bedst udfaldet opnås når væv fra nyfødte hanner bruges, medens voksent væv viser en høj tendens til at degenerere og dø 17-21. Generelt, xenotransplantat succes aftager som donorvæv undergår migiosis af den første bølge af spermatogenesen. Tid til fuld udvikling af umodne donorvæv og fuldstændig spermatogenesen er artsspecifik, og ofte lidt kortere sammenlignet med testikler in situ. Antallet af sædkanalerne med komplet spermatogenesen er variabel i henhold til art. Mens der i får, geder og svin, at antallet er større end 50%, i kvæg og katte er det mindre end 15% 14 (Figur 3).
Figur 1.. Kimcellens transplantation procedure. Place modtagere liggende på ryggen efter bedøvelsen og gør en ~ 0,4-tommers midterlinjen abdominal incision (A). Eksponér testis ved tilbagetagelse af fedtpuden fastgjort til bitestiklen-og testis og placere en tynd sterilt afdækningsstykke neden under fedtpuden / testis for bedre visuel identifikation (B). Positionere testis, og bitestiklen således at de efferente kanalerne begravet i fedtstof puden befinder skelnelige (C, D, E). Idenhed, de efferente kanaler og skånsomt fjerner fedt væv omkring kanalerne. Et stykke af farvet papir eller plastic kan placeres nedenunder kanalerne for bedre visualisering (G). Bryde eller slibe pipettespidsen efter størrelsen af kanalerne og belastningscelle affjedring ind i pipetten (H). Sæt forsigtigt pipetten i en kanal i pakken, efferente kanaler, forsigtigt Tråd et par mm mod testiklerne (pilen i H viser retningen af pipetten injektion og gevindskæring). En testis med vellykket injektion ind det seminiferøse tubuliene er vist (I). TS: Testikel; Ep: epididymis.
Figur 2. Repræsentative resultater for kimcellens transplantation A) An injiceret testis farvet med X-gal. De blå segmenter af sædkanalerne repræsenterer etablerede kolonier fra transgene donor SSC'erne (LacZ transgen). B) Højere forstørrelse af en SSC koloni ved 3 måneder post-transplantation. The mørkeblå region i midten repræsenterer fuldstændige spermatogenese og de blege blå regionerne ved de enderne repræsenterer voksende forlængelse af kolonien. C) En histologisk sektion af den mørke blå seminiferous tubulus (3 måneder post-transplantationen) viser godt organiseret spermatogenese. Skala barer i B og C befinder 200 um og 30 um, henholdsvis. (Tal tilpasset fra Annu Rev Cell Dev Biol 2008;. 24:263-86 og Biol Reprod 1999 juni;. 60 (6) :1429-36).
Figur 3. Ektopisk xenografting af umoden testis væv fra store dyr ind i immundeficiente mus. Fragmenter af umodne donor testis (~ 1 mm 3) transplanteret under den dorsale huden af immunodeficiente mus (A) er stand til at overleve og reagere på muse gonadotropiner. Som et resultat, undergår testis væv komplet udvikling, herunder dannelse af fertilisation kompetent sædceller (B). Engang testis xenotransplantater er indsamlet (C)de kan anvendes til analyse eller til opnåelse sperm (D) for ICSI (E) og embryo produktion (F). Barer lige store 50 um (B, E og F) eller 10 um (D). (Modificeret fra Rodriguez-Sosa og Dobrinksi 2009 14).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1. Kimcellens transplantation
Kønscelle celle transplantation tilvejebringer den eneste funktionelt assay for utvetydig bekræftelse af tilstedeværelsen af spermatogonial stamceller (SSC'er) i en celle population. Kun SSC'erne kan hjem til og kolonisere SSC niche på basalmembranen og igangsætte donor-afledte spermatogenese. Kønsceller transplantation gjort det muligt at studere og manipulere SSC'erne i en hidtil uset måde. Den teknik, er blevet anvendt til producere transgene dyr gennem genetisk manipulation af SSC'er 4; at belyse den mønsteret, effektivitet og kinetik af SSC kolonisering 3,8; at studere de signalveje, der regulerer SSC selvfornyelse og differentiering 9,10; at karakterisere overflademarkører på SSC'erne for deres identifikation 22,23, at undersøge niche miljøet for SSC'erne 6,7,24. Desuden er gensidig transplantation blevet ansat til at undersøge, om en fænotype af infertility stammede fra en defekt i Sertoli celler eller i kimceller 25,26.
For transplantation for at arbejde effektivt, valg og behandling af recipientdyr er vigtig. Modtagere skal enten genetisk tilpasset til donorer eller immun-undertrykt. Bør modtagerne mangler også endogen spermatogenesen: enten på grund af en mutation som i W / W v-mus, eller udsmeltet infertile som et resultat af kimcelle depletion ved bestråling eller kemoterapeutiske lægemidler såsom Busulfan. Desuden en god forberedelse af donor cellesuspensioner og færdighedsområder i transplantation procedure er vigtigt for succes af teknikken så godt.
Kimcellens transplantation har sine egne begrænsninger. Der er ingen hurtig læse-out for resultater. Analysen af modtagerlandenes testiklerne nødt til at vente mindst to måneder, som genoprettelsen af fuld spermatogenesen i de ellers ufrugtbare modtagerne sker to måneder efter transplantation 3. Det jegSA kvalitativ eller semi-kvantitativ assay pga. store variationer i celleantal indsprøjtede og graden af modtagerens kimcellens suppression. Selv om begrebet kønscelle transplantation er blevet tilpasset til andre dyrearter, selve proceduren er teknisk anderledes og lidt mere udfordrende i ikke-gnavere som et resultat af de anatomiske forskelle på tværs af arter 11.
2. Testikel væv xenografting
Testis væv xenografting værker i hele mange mammale donorarterne og er et relativt simpel teknik. Som i andre typer af transplantationer, vævet det hurtigere efter indsamlingen er transplanteret til større chance for succes. Derfor, opbevaring og håndtering af væv fra indsamling til transplantation er vigtig. Men i vores erfaring testikel væv ikke kræver særlige andre behandlinger end holdes nedkølet. Testis væv kan opretholdes ved køleskabstemperatur temperatur op til 24 - 36 timer,og derefter fragmenter kan fremstilles til transplantation. Endvidere, kan fragmenter af friske testis blive opretholdt i standard dyrkningsmedium ved 4 ° C natten over forud transplantation uden en mærkbar virkning på podningen udfaldet 27. Testis væv kan også blive kryopræserveres hvis den er lang-tids opbevaring er ønsket. Undersøgelser udført i ged 13, svin 13,27, og aben 28 har vist, at nedfrysning og efterfølgende optøning af testis væv ikke væsentlig indflydelse på dens evne til at udvikle og producere sæd efter ektopisk xenografting i mus. Vellykket kryopræservering af testis væv kan opnås ved automatiseret-frysning 28 eller konventionel langsom-frysning i en alkohol bad 13,27, under anvendelse DMSO som kryobeskyttelsesmiddel i standard vævskulturmedium indeholdende FBS. Til transplantation, bliver kryopræserveret testis væv derefter optøet ved standardmetoder fremgangsmåder og efterfølgende vasket i dyrkningsmedium før transplantation 27. Når tissue har blevet transplanteret støttemodtageren musen tjener som en in vivo inkubator og ingen stoerre indgreb er påkrævet. Imidlertid i nogle tilfælde tilskud med exogene gonadotropiner kan være påkrævet; testis væv fra 6-måneder-gammel rhesus aber kræves injicere recipientmus subkutant med 10 IU af hCG to gange om ugen at nå fuld spermatogenese kl 6-7 måneder 29.
Som nævnt ovenfor, bliver det bedste resultat opnået, når væv fra nyfødte hanner bruges. Væv fra hanner i hvilket postmeiotic kimcellerne er til stede viser en tendens til at degenereret. Men med umodne dyr komplet sammenfatning af testis udvikling er mulig og har en lang række kliniske og forskningsmæssige anvendelser. I en klinisk indstilling, kan testis væv, xenografting blive anvendt til fertiliteten konservering, især i umodne hanner i hvilken sperm inddrivelse er ikke en mulighed. Små stykker i form af biopsier kan indsamles og fryses til langsigtet opbevaring. Når desIRED, kan fragmenterne blive optøet og podet ind mus 27,28. En anden alternativ er kryopræservering af den sperm, der høstes fra xenotransplantater. Mikroinjektion med snap-frossen sæd fra svineproducenterne testis xenografter resulterede i generering af morfologisk normale embryoner, om end på et lavere effektivitet i forhold til testikelkræft, epididymal eller ejakulerede sperm 27. Efter at væv har udviklet, kan det indsamles for høst sædceller og sperm kan anvendes til at producere embryoner i vitro 13,16,30. En begrænsning af denne, imidlertid, er det faktum, at resulterende sperm ikke undergår epididymal modning og derfor kræve ICSI til befrugtning. Derfor er brugen af xenograft-afledt sæd til befrugtning begrænset til arter, hvor ICSI er blevet oprettet.
I forskningen er testis væv xenografting et attraktivt alternativ til at studere testis udvikling og spermatogenese af store arter i en gnavermodel. For eksempel, enenkelt donor testis kan transplanteres til flere mus. Recipientmus kan derefter blive eksponeret for forskellige behandlinger, rejseguider og ogleller ofret på forskellige tidspunkter point for xenotransplantat indsamling. Dette er ikke kun eliminerer donor-effekter, men også reducerer antallet af store mænd, der kræves for et bestemt eksperiment eller en undersøgelse. Dette er særlig vigtigt i store dyr hvor undersøgelser der involverer talrige hanner er logistiske vanskelig og dyr, og kan bære etiske begrænsninger, navnlig i primater. Imidlertid er anvendelser af testis tissueprodukter xenografting begrænset som manipulation af specifikke celletyper før transplantation ikke er let mulig og effektiviteten af spermatogenesen er lav i visse donorarterne 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Arbejde fra forfatterne laboratoriet er blevet støttet af USDA / CSREES / NRICGP (2007-35203-18213), NIH / NCRR (2 R01 RR17359-06), NIH / NIEHS (1 R21 ES014856-01A2) og Alberta innoverer - Sundhed Solutions.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase (type IV) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| DNaseI | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| DMEM | Invitrogen | 31053-028 | |
| Trypan blue stain | Invitrogen | 15250-061 | |
| Nylon mesh cell strainer | BD Biosciences | 352340 (40µm) 352350 (70µm) | |
| Busulfan | Sigma-Aldrich | B2635 | |
| Thin-Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW 100-3 | |
| BD intramedic plyethylene tubing (PE100) | BD Biosciences | CA-63018-725 | |
| Ethicon 6-0 Silk Suture | Ethicon Inc. | 706G | |
| Wound clips | BD Biosciences | 427631 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma-Aldrich | P3667 | |
| magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 208337 | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | 18896 |
References
- Brinster, R. L., Avarbock, M. R. Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (24), 11303-11303 (1994).
- Brinster, R. L., Zimmermann, J. W. Spermatogenesis following male germ-cell transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (24), 11298-11298 (1994).
- Nagano, M., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Pattern and kinetics of mouse donor spermatogonial stem cell colonization in recipient testes. Biology of Reproduction. 60 (6), 1429-1429 (1999).
- Nagano, M., Brinster, C. J., Orwig, K. E. Transgenic mice produced by retroviral transduction of male germ-line stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (23), 13090-13090 (2001).
- Ryu, B. Y., Orwig, K. E., Oatley, J. M. Efficient generation of transgenic rats through the male germline using lentiviral transduction and transplantation of spermatogonial stem cells. Journal of Andrology. 28 (2), 353-353 (2007).
- Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C. Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche. Cell Cycle. 5 (11), 1164-1164 (2006).
- Oatley, M. J., Racicot, K. E., Oatley, J. M. Sertoli cells dictate spermatogonial stem cell niches in the mouse testis. Biology of Reproduction. 84 (4), 639-639 (2011).
- Nagano, M. C. Homing efficiency and proliferation kinetics of male germ line stem cells following transplantation in mice. Biology of Reproduction. 69 (2), 701-701 (2003).
- Kubota, H., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Growth factors essential for self-renewal and expansion of mouse spermatogonial stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (47), 16489-16489 (2004).
- Oatley, J. M., Avarbock, M. R., Telaranta, A. I. Identifying genes important for spermatogonial stem cell self-renewal and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (25), 9524-9524 (2006).
- Dobrinski, I. Germ cell transplantation and testis tissue xenografting in domestic animals. Animal Reproduction Science. 89 (1-4), 137-137 (2005).
- Dobrinski, I., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Transplantation of germ cells from rabbits and dogs into mouse testes. Biology of Reproduction. 61 (5), 1331-1331 (1999).
- Honaramooz, A., Snedaker, A., Boiani, M. Sperm from neonatal mammalian testes grafted in mice. Nature. 418 (6899), 778-778 (2002).
- Rodriguez-Sosa, J. R., Dobrinski, I. Recent developments in testis tissue xenografting. Reproduction. 138 (2), 187-187 (2009).
- Dobrinski, I., Rathi, R. Ectopic grafting of mammalian testis tissue into mouse hosts. Methods in Molecular Biology. 139, Clifton, N.J. 450-450 (2008).
- Rodriguez-Sosa, J. R., Schlatt, S., Dobrinski, I. Testicular tissue transplantation for fertility preservation. Fertility Preservation: Emerging Technologies and Clinical Applications. Seli, E., Agarwal, A. , Springer. New York, NY. 331-331 (2011).
- Rathi, R., Honaramooz, A., Zeng, W. Germ cell fate and seminiferous tubule development in bovine testis xenografts. Reproduction. 130 (6), 923-923 (2005).
- Rathi, R., Honaramooz, A., Zeng, W. Germ cell development in equine testis tissue xenografted into mice. Reproduction. 131 (6), 1091-1091 (2006).
- Kim, Y., Selvaraj, V., Pukazhenthi, B. Effect of donor age on success of spermatogenesis in feline testis xenografts. Reproduction, Fertility, and Development. 19 (7), 869-869 (2007).
- Arregui, L., Rathi, R., Zeng, W. Xenografting of adult mammalian testis tissue. Animal Reproduction Science. 106 (1-2), 65-65 (2008).
- Schlatt, S., Honaramooz, A., Ehmcke, J. Limited survival of adult human testicular tissue as ectopic xenograft. Human Reproduction. 21 (2), 384-384 (2006).
- Shinohara, T., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. beta1- and alpha6-integrin are surface markers on mouse spermatogonial stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5504-5504 (1999).
- Kanatsu-Shinohara, M., Toyokuni, S., Shinohara, T. CD9 is a surface marker on mouse and rat male germline stem cells. Biology of Reproduction. 70 (1), 70-70 (2004).
- Ryu, B. Y., Orwig, K. E., Oatley, J. M. Effects of aging and niche microenvironment on spermatogonial stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (6), 1505-1505 (2006).
- Costoya, J. A., Hobbs, R. M., Barna, M. Essential role of Plzf in maintenance of spermatogonial stem cells. Nature Genetics. 36 (6), 653-653 (2004).
- Morrow, C. M., Hostetler, C. E., Griswold, M. D. ETV5 is required for continuous spermatogenesis in adult mice and may mediate blood testes barrier function and testicular immune privilege. Annals of the New York Academy of Sciences. 1120, 144-144 (2007).
- Zeng, W., Snedaker, A. K., Megee, S. Preservation and transplantation of porcine testis tissue. Reproduction, Fertility and Development. 21 (3), 489-489 (2009).
- Jahnukainen, K., Ehmcke, J., Hergenrother, S. D. Effect of cold storage and cryopreservation of immature non-human primate testicular tissue on spermatogonial stem cell potential in xenografts. Human Reproduction. 22 (4), 1060-1060 (2007).
- Rathi, R., Zeng, W., Megee, S. Maturation of testicular tissue from infant monkeys after xenografting into mice. Endocrinology. 149 (10), 5288-5288 (2008).
- Honaramooz, A., Li, M. W., Penedo, M. C. Accelerated maturation of primate testis by xenografting into mice. Biology of Reproduction. 70 (5), 1500-1500 (2004).
