Summary
הפרוטוקולים של תא החיידק השתלת רקמות xenografting testis מתוארים. תא הנבט השתלת תוצאות spermatogenesis, התורם המופק האשכים הנמען ומהווה assay הכינון מחדש תפקודית לזיהוי בתאי גזע spermatogonial (SSCs). רקמת אשך xenografting מתרבה פיתוח testis ו spermatogenesis של מינים שונים התורמות בעכברים הנמענים.
Abstract
תא חיידק השתלת פותחה על ידי ד"ר ראלף Brinster ועמיתיו באוניברסיטה של פנסילבניה בשנת 1994 1,2. אלה פורצי מחקרים הראו כי microinjection של בתאי הנבט מעכברים התורמות פוריות לתוך tubules seminiferous תוצאות עכברים עקרות הנמען spermatogenesis, התורם נגזר וייצור זרע על ידי בעל חיים הנמען 2. השימוש של גברים שנשאו התורמות זיהוי חיידקי β-galactosidase גן המותר של spermatogenesis, התורם נגזר והעברת haplotype תורם לצאצא על ידי בעלי חיים הנמען 1. באופן מפתיע, לאחר ההשתלה לתוך לומן של tubules seminiferous, בתאי הנבט המושתלים הצליחו לעבור מתא luminal קרום המרתף שבו spermatogonia ממוקמים 3. מקובל כי SSCs רק מסוגלים ליישב נישה מחדש spermatogenesis את testis הנמענים. לכן, נבט התאהשתלת מספק גישה פונקציונלית ללמוד בתאי גזע נישה האשכים ואת לאפיין המשוערים בתאי גזע spermatogonial. נכון להיום, השתלת נבט משמש להבהיר הביולוגיה הבסיסית בתאי גזע, לייצר חיות מהונדס באמצעות מניפולציה גנטית של בתאי הנבט לפני השתלת 4,5, ללמוד Sertoli תא נבט אינטראקציה התא 6,7, SSC ביות והקולוניזציה 3, 8, כמו גם SSC עצמית התחדשות והתמיינות 9,10.
השתלת תא החיידק הוא גם אפשרי במינים גדולים 11. בכל אלה, היישומים העיקריים הם שימור פוריות, הפצת גנטיקה העילית של אוכלוסיות בעלי חיים, ואת הדור של בעלי חיים מהונדס כמו המחקר של spermatogenesis ו SSC ביולוגיה עם טכניקה זו היא לוגיסטית קשה יותר ויקר יותר במכרסמים. השתלת בתאי הנבט של מינים גדולים לתוך tubules seminiferous תוצאות עכברים colonizatיון של תאים התורמות והרחבת spermatogonial, אבל לא בידול המלא שלהם ככל הנראה בשל אי התאמה של תא מקבל תא סומטי עם בתאי הנבט ממינים רחוקים פילוגנטי 12. גישה חלופית היא השתלת בתאי הנבט של מינים גדולים יחד עם תא סומטי המקיף שלהם. אנו דיווח לראשונה בשנת 2002, כי שברים קטנים של רקמות אשך של גברים בשלים המושתלים מתחת לעור הגב של עכברים immunodeficient מסוגלים לשרוד ולעבור פיתוח מלא עם ייצור של זרע להפריה המוסמכת 13. מאז רקמת אשך xenografting הוכח להצליח מינים רבים ויצאו כתחליף יקר ללמוד פיתוח testis ו spermatogenesis של בעלי חיים גדולים בעכברים 14.
Protocol
חלק א 'נבט השתלת בעכברים
1. הכנת עכברים הנמענים
- מקבלי צריך להיות סובלני immunologically (או התאמה גנטית תורמים או החיסון לקוי) על התאים testis התורמות.
- לנמענים צריכה להיות גם נטולת טבעי של spermatogenesis (למשל w / w-V עכברים) או מדולדל של בתאי הנבט אנדוגניים. תא חיידק דלדול ניתן להשיג על ידי הקרנה או תרופות כימותרפיות כגון busulfan. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את שיטת הכנת עכברים נמענים עם busulfan.
- פנקו את מקבלי בשבוע 4-6 של גיל באמצעות הזרקת ה-IP של busulfan. המינון האופטימלי של busulfan הוא זן תלויים. ב זנים נפוצים נמענים, במינון של 40-50 מ"ג / ק"ג מספיקה כדי לרוקן בתאי הנבט אנדוגני (לדוגמא 44 מ"ג / ק"ג של עכברים בעירום, 50 מ"ג / ק"ג של B6/129 מקבלי F1).
- לפזר אבקת busulfan ב DMSO ולאחר מכן להוסיף נפח שווה של מים מזוקקים לא סטריליתהו את הריכוז הסופי של 4 מ"ג / מ"ל. שמור על פתרון חמים ב 35-40 ° C לפני השימוש, כדי למנוע משקעים של busulfan. מחק פתרון אם משקעים הוא ציין.
- לאחר הטיפול busulfan, לאפשר לפחות חודש לפני השימוש הנמענים. הנמענים ניתן להשתמש בין חודש 1 ו - 3 חודשים לאחר busulfan הטיפול.
2. הכנת בטפי להחדרת נוזלים microinjection
- בחר בטפי להחדרת נוזלים זכוכית בורוסיליקט (צינורות נימי) בקוטר חיצוני 1.0 מ"מ, קוטר פנימי 0.75 מ"מ, אורך של 3 אינץ'.
- Siliconize בטפי להחדרת נוזלים זכוכית עם Sigmacote, לשטוף בטפי להחדרת נוזלים עם מתנול ולפוצץ יבש.
- משוך את בטפי להחדרת נוזלים באמצעות חולץ פיפטה. שונות חולץ מכונות פיפטה יש הגדרות שונות, ולכן, לבדוק כמה הגדרות. בדרך כלל, הגדרה דומה לזה המשמש להכנת בטפי להחדרת נוזלים enucleation יפעלו.
- לשבור את הטיפים פיפטה תחת מיקרוסקופ לנתח לפני השימוש כדי להשיג בקוטר של כ 50 מיקרומטרבקצה.
3. הכנת תאים התורם להשתלה
- Choise של זן תורם תלויה השאלה הניסוי למד. אם כימות של spermatogenesis משמש נקודת הסיום, שימוש תורמים עם סמן גנטי לזיהוי בקלות כגון Lac-Z (למשל B6.129S7-Gt (רוזה) 26Sor / J מ ג'קסון מעבדה) או GFP (למשל C57BL/6-Tg ( החטיבה-EGFP) 1Osb / J מ ג'קסון מעבדה).
- הכן 7 מ"ל של collagenase ב DMEM ב 1 מ"ג / מ"ל, 4 מ"ל של טריפסין-EDTA (0.25% טריפסין בתוספת 1 מ"מ EDTA), ו 2 מ"ל של DNase ב DMEM ב 7 מ"ג / מ"ל. סכום זה נועד לעכל 2 עכבר האשכים התורמות.
- איסוף האשכים בסביבה נקייה מחיידקים, ולהסיר albuginea Tunica. מורחים seminiferous tubules בעדינות עם מלקחיים עדינים כדי להקל על עיכול אנזימטי.
- העברת tubules לתוך collagenase, דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות, ו להתסיס לעתים קרובות.
- לשטוף tubules פעמיים ספינינג (200-300 גרם דקות 3) מחדש השעיית בע"א PBS W / O 2 + +
- מחדש להשעות tubules טריפסין ב-EDTA ולנער עד שהם הופכים דביקים מעונן. לפקח על מערכת העיכול של tubules ב 37 מעלות צלזיוס כפי שהיא צריכה להתרחש בתוך דקות 1-2.
- הוסף DNase ולנער היטב. דגירה של 1-2 דקות.
- הוסף 3 מ"ל של FBS להפסיק את הפעולה של אנזימים.
- תא ההשעיה מסנן באמצעות רשת ניילון עם גודל הנקבוביות 40-70 מיקרומטר להסיר תאים / רקמות גושים.
- איסוף התאים ב 600 גרם של 5 דקות מחדש להשעות התאים כמות קטנה של DMEM (<100 μl).
- ספירת תאים ולהתאים את עוצמת הקול לריכוז הסופי הרצוי (בדרך כלל 100 x 10 6). שמור על השעיית התא על קרח לפני השימוש.
- Busulfan שטופלו כל אחד testis העכבר יהיה מלא μl רק 10-15 ההשעיה התא. בשל דליפת פסולת פוטנציאל, שואפים להיות 30-50 μl לכל testis.
4. הליך ההשתלה (איור 1)
- לטשטש את מקבלי בעקבות הפרוטוקולים שאושרו.
- מקום הגבישכיבה וכן בניתוח להכין את אזור הבטן. לעשות ~ 1cm חתך קו האמצע בטן לחשוף את דופן הבטן. להרים את דופן הבטן באמצעות מלקחיים קטנים בנקודת הקו הלבן, כדי למנוע מקרי פציעה של אברי הבטן, ולהמשיך לעשות ~ 0.5 ס"מ חתך את קו האמצע של דופן הבטן על מנת לחשוף את חלל הצפק.
- השתמש אחד מלקחיים איריס להחזיק את דופן הבטן, ולהשתמש עוד זוג מלקחיים איריס לחפש כריות שומן המחוברים יותרת האשך ו testis בחלל הצפק. משוך בעדינות את כרית השומן החוצה עד testis הוא exteriorized ואת העורק יותרת האשך האשכים נראים בבירור. לעבוד על אחד testis בכל פעם.
- הנח וילון סטרילית דק עשוי כרטיסיות autoclaved כרית מתחת testis שומן / זיהוי חזותי טוב יותר (לא חובה). וילון עובד גם לספוג נוזלים.
- הוסף טיפה של צבע כחול Trypan אל ההשעיה התא בזהירות לטעון את ההשעיה התא polyethyצינורות Lene מחובר מזרק 1 מ"ל. חבר את הצינורית נכנסה צינורות בעדינות לכפות השעיה התא אל פיפטה על ידי הפעלת לחץ על המזרק.
- לזהות את צינורות efferent (כלומר לחבר את testis אל יותרת האשך) ובעדינות להסיר רקמת שומן סביב הצינורות. לעבוד בזהירות הצינורות ואת קרום סביבם הם שקופים.
- בזהירות להכניס פיפטה לתוך צינור בצרור של צינורות efferent, בעדינות חוט כמה מ"מ לכיוון האשכים.
- תוך מניעת העברת פיפטה זריקה, להגיע המזרק בעדינות לדכא את הבוכנה של המזרק על מנת להבטיח כי ההשעיה זורם לתוך testis rete ו seminiferous tubules להתחיל למלא.
- שיעור הזרקת זרימת ההשעיה התא מווסת על ידי לחץ אצבע. למנוע עליה פתאומית בלחץ, לעקוב אחר התנועה של השעיה ב tubules.
- לעצור את הזריקה כאשר כמעט כל משטח tubules מולאו לפני testis מתחיל BECOme איסכמי.
- להחזיר את testis לחלל הבטן. חזור על התהליך על testis הנגדי. לתפור את דופן הבטן עם תפר 6-0 משי לסגור את העור עם קליפים הפצע מתכת. לפקח על עכברים כרית חימום עד להחלמה מלאה.
5. ניתוח של אשכים הנמענים
- אפשר 2-4 חודשים לאחר ההשתלה לפני ניתוח.
- להרדים את העכבר מקבל על פי טיפול בבעלי חיים הנחיות שימוש ולאסוף testis ואת יותרת האשך לתוך PBS. כאשר המתח Lac-Z מהונדס התורם נעשה שימוש, יותרת האשך יכול לשמש כביקורת מכתים חיובית שכן יש פעילות אנדוגני בטא galactosidase.
- עבור זיהוי של תאים על ידי התורם מכתים Lac-Z, לתקן testis שעה 1-2 על 4 מעלות צלזיוס paraformaldehyde 4% (PFA) ב PBS. יש לשטוף 3 x 30 דקות בטמפרטורת החדר lacZ לשטוף המאגר.
- דגירה בין לילה ב 37 ° C בתמיסה מכתים lacZ. Testis ניתן מוכתמת כולה או אחרי פיזוראת tubules.
- תקן ולאחסן ב 10% נייטרלי שנאגרו פורמלין. אם חלקים יש צורך להשתמש באדום מהר נייטרלי כמו נגד הכתם.
חלק ב 'מחוץ לרחם xenografting בעכברים
(מתוך Dobrinski ו Rathi 2008 15, רודריגז סוסה, et al. 2011 16).
1. אוסף של רקמות התורם
- להשיג רקמת אשך על ידי סירוס או ביופסיה מזכר התורם.
- מקום testis ב PBS או ביופסיות לתוך המדיום תרבות, שמירה על תנאים סטריליים.
- שמור על רקמות שנאספו על הקרח והובלה למעבדה.
2. הכנת רקמות התורם
- בצע בשכונה תרביות רקמה כדי לשמור על סטריליות.
- לשטוף את כל testis בקרח קר אנטיביוטיקה PBS המכילים פעמיים עד שלוש פעמים לפני העברת לתוך צלחת תרבות עם PBS. במקרה של ביופסיות, לשטוף את שברי testis פעמיים עד שלוש פעמים עם Medi-קרח תרבותאום המכיל אנטיביוטיקה ידי מסתובב ב 150 דקות 2 ו resuspending במדיום קר כקרח טרי התרבות.
- על האשכים שלמים, הסר vaginalis Tunica על ידי ביצוע חתך על פני השטח ואת extrude את testis. הסר testis כל המבנים לספח (חבל הזרע, יותרת האשך, רקמת חיבור). לשטוף את האשכים פעם בקור PBS והעברה לתוך צלחת תרבות עם PBS.
- מוציאים בזהירות את albuginea Tunica של testis באמצעות להב אזמל וזוג מספריים. אם testis הוא קטן מאוד, Tunica ניתן להסיר על ידי כיווץ רקמת האשכים מתוך Tunica דרך חתך קטן עשה בצד אחד כשהוא אוחז Tunica עם זוג מלקחיים קטנים בצד השני.
- בהתאם לגודל של testis או רקמת אשך כולו ניתן לחתוך לחתיכות קטנות של כ 1-2 מ"מ 3 בגודל באמצעות מלקחיים מעוקלים ולהב אזמל, או חתיכות גדולות של רקמת אשך יכול 1 להסיר testis ואז חתוך קטןחתיכות. כל זה צריך להיעשות בינוני קר כקרח תרבות בתנאים סטריליים בצלוחית קטנה תרבות (60 x15 מ"מ).
- להעביר את שברי רקמות מוכנים בינוני קר כקרח תרבות תרבות מנות קטנות על הקרח עד השתלת.
3. סירוס של הנמען העכבר
- לטשטש את העכבר מעל ולהכין בתחום כירורגית סטרילית ידי מסיכה לשיער (אין צורך בעכברים עירום), מנגב עם אתנול 70% והפתרון בבטאדין.
- הפוך את 0.5 -1 העור הגחון ס"מ חתך קו האמצע לחשוף את דופן הבטן.
- בזהירות לחשוף את testis, העורק האשכים יותרת האשך כמתואר PartA, 4.2-4.3.
- לנתק את הזנב של epidydimis מ gubernaculum ידי דיסקציה קהה.
- ולקשור את העורק האשכים, ו VAS את הזרע יחד עם כלי הדם עם משי, וסעיף המבנים ligated על ידי חיתוך בין testis ואת הקשר.
- לחזור על התהליך עבור הערוץnd testis.
- לתפור את דופן הבטן עם אחד או שניים התפרים.
- לסגור את החתך בעור עם אחד או שני קליפים מישל.
4. חוץ רחמי xenografting
- מקמו את העכבר שכיבה הגחון ולהכין שדה כירורגי סטרילי על גבו כנ"ל.
- בהתאם לאופן שתלי רבים כדי להיות מוכנס (בדרך כלל 4-8/mouse), להפוך את ~~~HEAD=NNS 0.5 ס"מ חתכים בעור ארוכים בכל צד של קו אמצע של החלק האחורי של העכבר.
- השתמש מלקחיים לקיים גבול חתך את העור, ולגרום חלל תת עורית על ידי מתגרה מזה רקמת חיבור באמצעות מספריים.
- באמצעות מלקחיים במקום איריס פיסת רקמה testis עמוק לתוך חלל תת עורית, מחזיק את הגבול של חתך את העור עם עוד מלקחיים איריס.
- לסגור את החתך בעור עם קליפ מישל 1 ולשמור העכבר על כרית חימום עד שהוא מתחיל להתאושש מן ההרדמה.
- מעבירים את העכבר לכלוב עם בידוד שותף נוסףגרסה וצג עד עכברים הם התאוששו באופן מלא.
5. אוסף של xenografts testis עבור ניתוח קצירת הזרע
- להרדים את העכבר המארח לפי טיפול בבעלי חיים הנחיות שימוש, ולעשות חתך בעור לאורך קו האמצע של העור האחורי בורח הזנב עד הצוואר ועור פתוח. זה חושף את שתלי אשר ניתן לאתר גם על הרקמה התת עורית או לעיקול על העור.
- בזהירות להסיר את שתלי באמצעות מלקחיים זוג וזוג מספריים.
- שיא מספר גודל שתלי, התאושש משקל שתלי בודדים.
- לאחזר את שלפוחית הזרע מהבטן של העכבר ולהקליט את משקלם כאינדיקציה ייצור הטסטוסטרון על ידי רקמת מורכבים.
- לניתוח היסטולוגית
- להשעות xenografts לתוך בקבוקון המכיל מדגם הפתרון של Bouin (או מקבע אחר) בנפח ~~~V 10x של xenograft, ואת בקבוקון התווית כראוי.
- לדגורלילה במקרר לאחר מכן לשטוף לפחות 3 פעמים באתנול 70% במרווחים של 24 שעות רצוי.
- המשך לעיבוד הטבעה ב פרפין.
- על קצירת הזרע
- לשטוף xenografts ידי ספינינג אותם ב 300 גרם דקות 1 ו resuspending אותם אנטיביוטיקה תרבות בינוניים המכילים.
- גזור שתלי לחתיכות קטנות לקצץ בזהירות עם מלקחיים במנה רקמות תרבות המכילה 3-5 מ"ל של מדיום התרבות.
- רקמת טחון מסנן דרך מסננת תא 40 מיקרומטר.
חלק ב ג נציג תוצאות
1. תא חיידק השתלת
אם ההשעיה המושתל התא התורם מכיל בתאי גזע spermatogonial הנושאים סמן גנטי כגון transgene LacZ, קולוניזציה של SSCs התורמות ב testis הנמענים ניתן דמיינו ידי מכתים X-gal כמו קטעים כחולים ייחודיים של SEMiniferous tubules אחרי חודש 2-3 לאחר השתלת 3 (איור 2 א). המושבה ומבוססת צריך למתוח ארוכה בצבע כחול כהה של מגזרים מלא לחלוטין עם שניים או יותר שכבות של תאים כחולים למרכז, ואזורים צבעונית יחסית חלשות בשני הקצוות שבו רשת אחת, יחד או קבוצות קטנות של תאים כחולים ניכר 3 (איור 2 ב). חתך של האזור הכהה אבובית seminiferous כחול צריך לחשוף מבוססת היטב ומאורגנת היטב עם spermatogenesis בתאי הנבט כחולים בשלבים בידול שונים (איור 2 ג).
2. Testis רקמות xenografting
הכדאיות של רקמת אשך לאחר ההשתלה קשורה ביחס הפוך שלב התפתחותי של התורם; את התוצאה הטובה ביותר מתקבלת כאשר רקמה זכרים בני יומם משמש, תוך הרקמה הבוגרת מראה נטייה גבוהה להתנוון ולמות 17-21. באופן כללי, ההצלחה xenograft פוחתת ככל רקמות התורם עובר ליiosis של הגל הראשון של spermatogenesis. זמן לפיתוח מלא של רקמות התורם בשלה spermatogenesis המלא הוא מין מסוים, ולעתים קרובות מעט קצר יותר בהשוואה האשכים באתרם. מספר tubules seminiferous עם spermatogenesis המלא משתנה בהתאם למין. בעוד כבשים, עזים וחזירים, כי מספר גדול מ 50%, בבקר וחתולים הוא פחות מ 15% 14 (איור 3).
באיור 1. תא חיידק הליך ההשתלה. מקום לנמענים שכיבה הגב לאחר הרדמה עושים ~ 0.4 אינץ' חתך בבטן קו האמצע (א). לחשוף testis בנסיגה משטח שומן מחוברת יותרת האשך ו testis ואת המקום וילון דק מתחת משטח סטרילי testis שומן / זיהוי חזותי טוב יותר (B). מקם את testis ואת יותרת האשך, כך צינורות efferent קבורים כרית שומן ניכרים (C, D, E). תעודת זהותהישות צינורות efferent בעדינות להסיר רקמת שומן סביב הצינורות. פיסת נייר פלסטיק צבעוני או ניתן למקם מתחת הצינורות עבור הדמיה טוב יותר (G). לשבור או לטחון את קצה הצינורית על פי גודל של צינורות ותא מטען ההשעיה לתוך פיפטה (H). בזהירות להכניס פיפטה לתוך צינור בצרור של צינורות efferent, בעדינות חוט כמה מ"מ לכיוון האשכים (החץ H מראה את הכיוון של פיפטה הזרקת השחלה). Testis עם זריקה מוצלחת tubules seminiferous מוצג (אני). TS: testis, פרקים: יותרת האשך.
איור 2. תוצאות עבור נציג תא נבט השתלת א) testis הזריק מוכתמים X-gal. הקטעים הכחולים של tubules seminiferous מייצגים במושבות שהוקמו מתוך SSCs התורמות הטרנסגניים (LacZ transgene). ב) הגדלה גבוהה של המושבה SSC ב 3 חודשים לאחר ההשתלה. הדואר באזור כחול כהה במרכז מייצג spermatogenesis מלא האזורים התכולים בקצוות מייצגים הרחבה הולכת וגדלה של המושבה. ג) בסעיף היסטולוגית של אבובית כהה seminiferous כחול (3 חודשים לאחר השתלת) מראה spermatogenesis מאורגן היטב. ברים בקנה מידה B ו-C הם 200 מיקרומטר ו 30 מיקרומטר, בהתאמה. (איורים עיבוד Annu Rev Cell התפתחות Biol 2008,. 24:263-86 ו Biol Reprod יוני 1999,. 60 (6) :1429-36).
איור 3. חוץ רחמי xenografting של רקמת אשך בוגרת מבעלי חיים גדולים לעכברים immunodeficient. רסיסי testis התורמות לא מפותחים (~ 1 מ"מ 3) המושתלים מתחת לעור הגב של עכברים immunodeficient (א ') מסוגלים לשרוד ולהגיב gonadotropins עכבר. כתוצאה מכך, רקמת אשך עובר פיתוח מלאה, כולל הקמת זרע להפריה המוסמכת (ב '). לאחר xenografts testis נאספים (C)הם יכולים לשמש לניתוח או לקבל זרע (ד ') עבור ICSI (E) וייצור העובר (F). ברים שווים 50 מיקרומטר (B, E ו-F) או 10 מיקרומטר (ד). (שונה מ-רודריגז סוסה ו Dobrinksi 2009 14).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1. תא חיידק השתלת
תא חיידק השתלת מספק assay רק פונקציונלי אישור חד משמעי של נוכחות בתאי גזע spermatogonial (SSCs) באוכלוסייה התא. SSCs רק יכול הביתה ו ליישב את הנישה SSC על קרום במרתף וליזום התורם הנגזרות spermatogenesis. נבט השתלת איפשר ללמוד ולטפל SSCs באופן חסר תקדים. הטכניקה נעשה שימוש כדי לייצר חיות מהונדס באמצעות מניפולציה גנטית של SSCs 4; להבהיר, דפוס יעילות קינטיקה של קולוניזציה SSC 3,8; ללמוד את מסלולי איתות המווסתים SSC עצמית התחדשות בידול 9,10; לאפיין סמנים על פני השטח SSCs לזיהוי שלהם 22,23, ללמוד על הסביבה נישה SSCs 6,7,24. יתר על כן, השתלת הגומלין כבר מועסק על מנת לבדוק האם פנוטיפ של infertility שמקורה פגם בתאים Sertoli או בתאי הנבט 25,26.
להשתלה לעבוד ביעילות, ואת הבחירה היחס לבעלי חיים הנמענים חשוב. נמענים יש גם התאמה גנטית תורמים או החיסונית שהודחק. מקבלי צריך גם חוסר spermatogenesis אנדוגני: או עקב מוטציה כמו W / W עכברים V, או שניתנו פוריות עקב דלדול תא חיידק על ידי הקרנה או תרופות כימותרפיות כגון busulfan. יתר על כן, הכנה טובה של התא השעיות התורמות ומיומנות הליך השתלת חשובים להצלחת השיטה גם כן.
תא חיידק השתלת יש מגבלות משלה. אין מהר לקריאה החוצה תוצאות. ניתוח של אשכים הנמען צריך לחכות לפחות חודשיים כמו הקמתה מחדש של spermatogenesis מלא מקבלי עקרים אחרת קורה חודשיים לאחר ההשתלה 3. זה אניSA assay איכותי או חצי כמותית בשל שוני גדול בין מספר מוזרק תא מספר מידת הדיכוי נבט הנמען התא. למרות הרעיון של השתלת תאים נבט כבר מותאמת מיני בעלי חיים אחרים, ההליך עצמו שונה מבחינה טכנית קצת יותר מאתגר ב מכרסמים שאינם מינים כתוצאה ההבדלים האנטומיים בין זנים 11.
2. Testis רקמות xenografting
רקמת אשך xenografting עבודות רבות ברחבי מינים התורמות יונקים היא טכניקה פשוטה יחסית. כמו סוגים אחרים של השתלות, אוסף אחרי במוקדם הרקמה המושתלים סיכוי גדול יותר להצלחה. לכן, שימור וטיפול ברקמה מן האוסף השתלת חשוב. עם זאת, הניסיון שלנו רקמת אשך אינו דורש טיפול מיוחד חוץ מלהיות לשמור בקירור. רקמת אשך יכול להישמר במקרר בטמפרטורה של עד 24-36 שעות,ואז שברי ניתן להכין להשתלה. יתר על כן, שברי testis טרי יכול להישמר בכל מדיום תרבות תקן על השתלת 4 ° C לפני בן לילה ללא השפעה ניכרת על תוצאות השתלת 27. רקמת אשך יכול להיות גם אם cryopreserved אחסון לטווח ארוך היא הרצוי. מחקרים שבוצעו ב 13 עזים, חזיר 13,27, ו 28 קופים הראו כי הקפאת ובעקבות הפשרת רקמת אשך אינו משפיע באופן משמעותי את יכולתה לפתח ולייצר זרע לאחר חוץ רחמי xenografting בעכברים. Cryopreservation מוצלחת של רקמת אשך יכולה להיות מושגת על ידי אוטומטית, הקפאת 28 או קונבנציונאלי איטי מקפיא באמבט אלכוהול 13,27, באמצעות DMSO כמו cryoprotectant במדיום תרבות תקן רקמה המכילה FBS. להשתלה, cryopreserved רקמת אשך הוא מופשר אז על ידי שיטות סטנדרטיות ורחץ לאחר מכן בינוני התרבות לפני ההשתלה 27. לאחר TISסו כבר להשתיל את העכבר הנמען משמש in vivo חממה ולא התערבויות הגדולות נדרשים. עם זאת, במקרים מסוימים תוספת של gonadotropins חיצוניים עשויים להידרש, רקמת אשך מ 6 חודשים הישן בקופי רזוס נדרש הזרקת עכברים הנמען תת עורית עם 10 IU של hCG פעמיים בשבוע להגיע spermatogenesis מלא ב 6-7 חודשים 29.
כאמור, התוצאה הטובה ביותר מתקבלת כאשר רקמה זכרים בני יומם משמש. רקמה מן הזכרים שבהם בתאי הנבט postmeiotic נמצאים מראה נטייה להידרדר. עם זאת, עם בעלי חיים מפותחים סיכום מלא של פיתוח testis אפשרי ויש לו יישומים קליניים ומחקרים רבים. בסביבה קלינית, רקמת אשך xenografting יכול לשמש לשימור הפוריות, במיוחד אצל גברים לא מפותחים שבהם ההתאוששות הזרע הוא לא אופציה. חתיכות קטנות בצורה של ביופסיות ניתן לאסוף ולהקפיא עבור אחסון לטווח ארוך. כאשר desired, שברי ניתן להפשיר ו מורכבים לעכברים 27,28. חלופה נוספת היא cryopreservation של הזרע כי הוא קוצרים xenografts. Microinjection עם זרע קפוא מ Snap-xenografts testis חזיר הביא דור של עוברים נורמליים מבחינה מורפולוגית, אם כי ביעילות נמוכה יותר בהשוואה האשכים, epididymal או פלט הזרע 27. לאחר רקמות פיתחה, זה ניתן לאסוף על קצירת הזרע והזרע יכול לשמש לייצור עוברים במבחנה 13,16,30. הגבלה של זה, עם זאת, היא העובדה כי כתוצאה הזרע אינם עוברים התבגרות epididymal ולכן דורשים ICSI להפריה. לכן, השימוש בתרומת זרע xenograft הנגזרות להפריה מוגבל מינים שבהם ICSI כבר נקבעה.
במחקר, רקמת אשך xenografting היא חלופה אטרקטיבית ללמוד פיתוח testis ו spermatogenesis של מינים גדולים במודל מכרסמים. לדוגמה,testis התורמות בודדים ניתן להשתיל בעכברים מרובים. עכברים הנמען יכול להיחשף לטיפולים שונים, ו / או שהקריבו בנקודות זמן שונות לאיסוף xenograft. זה לא רק מבטל תופעות התורמות, אלא גם מפחיתה את מספר הזכרים גדולים הנדרשים לצורך הניסוי במחקר מסוים. הדבר חשוב במיוחד אצל בעלי חיים גדולים בהם מחקרים שכללו גברים רבים שקשה לוגיסטית ויקר, ועלול לשאת מגבלות אתיות, במיוחד אצל הפרימטים. עם זאת, היישומים של xenografting testis רקמות מוגבלים כמניפולציה של סוגי תאים ספציפיים לפני השתלת לא ניתן בקלות ויעילות של spermatogenesis נמוך מינים מסוימים התורם 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
העבודה מהמעבדה סופרים כבר נתמך על ידי משרד החקלאות / CSREES / NRICGP (2007-35203-18213); NIH / NCRR (2 RR17359 R01-06), NIH / NIEHS (1 R21 ES014856-01A2) ו אלברטה מתפתחת - פתרונות בריאות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase (type IV) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| DNaseI | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| DMEM | Invitrogen | 31053-028 | |
| Trypan blue stain | Invitrogen | 15250-061 | |
| Nylon mesh cell strainer | BD Biosciences | 352340 (40µm) 352350 (70µm) | |
| Busulfan | Sigma-Aldrich | B2635 | |
| Thin-Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW 100-3 | |
| BD intramedic plyethylene tubing (PE100) | BD Biosciences | CA-63018-725 | |
| Ethicon 6-0 Silk Suture | Ethicon Inc. | 706G | |
| Wound clips | BD Biosciences | 427631 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma-Aldrich | P3667 | |
| magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 208337 | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | 18896 |
References
- Brinster, R. L., Avarbock, M. R. Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (24), 11303-11303 (1994).
- Brinster, R. L., Zimmermann, J. W. Spermatogenesis following male germ-cell transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (24), 11298-11298 (1994).
- Nagano, M., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Pattern and kinetics of mouse donor spermatogonial stem cell colonization in recipient testes. Biology of Reproduction. 60 (6), 1429-1429 (1999).
- Nagano, M., Brinster, C. J., Orwig, K. E. Transgenic mice produced by retroviral transduction of male germ-line stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (23), 13090-13090 (2001).
- Ryu, B. Y., Orwig, K. E., Oatley, J. M. Efficient generation of transgenic rats through the male germline using lentiviral transduction and transplantation of spermatogonial stem cells. Journal of Andrology. 28 (2), 353-353 (2007).
- Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C. Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche. Cell Cycle. 5 (11), 1164-1164 (2006).
- Oatley, M. J., Racicot, K. E., Oatley, J. M. Sertoli cells dictate spermatogonial stem cell niches in the mouse testis. Biology of Reproduction. 84 (4), 639-639 (2011).
- Nagano, M. C. Homing efficiency and proliferation kinetics of male germ line stem cells following transplantation in mice. Biology of Reproduction. 69 (2), 701-701 (2003).
- Kubota, H., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Growth factors essential for self-renewal and expansion of mouse spermatogonial stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (47), 16489-16489 (2004).
- Oatley, J. M., Avarbock, M. R., Telaranta, A. I. Identifying genes important for spermatogonial stem cell self-renewal and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (25), 9524-9524 (2006).
- Dobrinski, I. Germ cell transplantation and testis tissue xenografting in domestic animals. Animal Reproduction Science. 89 (1-4), 137-137 (2005).
- Dobrinski, I., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Transplantation of germ cells from rabbits and dogs into mouse testes. Biology of Reproduction. 61 (5), 1331-1331 (1999).
- Honaramooz, A., Snedaker, A., Boiani, M. Sperm from neonatal mammalian testes grafted in mice. Nature. 418 (6899), 778-778 (2002).
- Rodriguez-Sosa, J. R., Dobrinski, I. Recent developments in testis tissue xenografting. Reproduction. 138 (2), 187-187 (2009).
- Dobrinski, I., Rathi, R. Ectopic grafting of mammalian testis tissue into mouse hosts. Methods in Molecular Biology. 139, Clifton, N.J. 450-450 (2008).
- Rodriguez-Sosa, J. R., Schlatt, S., Dobrinski, I. Testicular tissue transplantation for fertility preservation. Fertility Preservation: Emerging Technologies and Clinical Applications. Seli, E., Agarwal, A. , Springer. New York, NY. 331-331 (2011).
- Rathi, R., Honaramooz, A., Zeng, W. Germ cell fate and seminiferous tubule development in bovine testis xenografts. Reproduction. 130 (6), 923-923 (2005).
- Rathi, R., Honaramooz, A., Zeng, W. Germ cell development in equine testis tissue xenografted into mice. Reproduction. 131 (6), 1091-1091 (2006).
- Kim, Y., Selvaraj, V., Pukazhenthi, B. Effect of donor age on success of spermatogenesis in feline testis xenografts. Reproduction, Fertility, and Development. 19 (7), 869-869 (2007).
- Arregui, L., Rathi, R., Zeng, W. Xenografting of adult mammalian testis tissue. Animal Reproduction Science. 106 (1-2), 65-65 (2008).
- Schlatt, S., Honaramooz, A., Ehmcke, J. Limited survival of adult human testicular tissue as ectopic xenograft. Human Reproduction. 21 (2), 384-384 (2006).
- Shinohara, T., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. beta1- and alpha6-integrin are surface markers on mouse spermatogonial stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5504-5504 (1999).
- Kanatsu-Shinohara, M., Toyokuni, S., Shinohara, T. CD9 is a surface marker on mouse and rat male germline stem cells. Biology of Reproduction. 70 (1), 70-70 (2004).
- Ryu, B. Y., Orwig, K. E., Oatley, J. M. Effects of aging and niche microenvironment on spermatogonial stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (6), 1505-1505 (2006).
- Costoya, J. A., Hobbs, R. M., Barna, M. Essential role of Plzf in maintenance of spermatogonial stem cells. Nature Genetics. 36 (6), 653-653 (2004).
- Morrow, C. M., Hostetler, C. E., Griswold, M. D. ETV5 is required for continuous spermatogenesis in adult mice and may mediate blood testes barrier function and testicular immune privilege. Annals of the New York Academy of Sciences. 1120, 144-144 (2007).
- Zeng, W., Snedaker, A. K., Megee, S. Preservation and transplantation of porcine testis tissue. Reproduction, Fertility and Development. 21 (3), 489-489 (2009).
- Jahnukainen, K., Ehmcke, J., Hergenrother, S. D. Effect of cold storage and cryopreservation of immature non-human primate testicular tissue on spermatogonial stem cell potential in xenografts. Human Reproduction. 22 (4), 1060-1060 (2007).
- Rathi, R., Zeng, W., Megee, S. Maturation of testicular tissue from infant monkeys after xenografting into mice. Endocrinology. 149 (10), 5288-5288 (2008).
- Honaramooz, A., Li, M. W., Penedo, M. C. Accelerated maturation of primate testis by xenografting into mice. Biology of Reproduction. 70 (5), 1500-1500 (2004).
