Summary
Protokoller for bakterie celle transplantasjon og testis vev xenografting er beskrevet. Bakterie celle transplantasjon resultater i donor-derived spermatogenesen i mottakerlandene testikler og representerer en funksjonell rekonstituering analysen for identifisering av spermatogonial stamceller (SSCs). Testikkel vev xenografting reproduserer testis utvikling og spermatogenesen av ulike donor arter i mottakerlandene mus.
Abstract
Bakterie celle transplantasjon ble utviklet av Dr. Ralph Brinster og kolleger ved University of Pennsylvania i 1994 1,2. Disse banebrytende studier viste at mikroinjeksjon av kjønnsceller fra fruktbare donor mus inn i sædproduserende tubuli av infertile mottakerlandenes mus resulterer i donor-avledet spermatogenesen og sperm produksjon av mottakeren dyret to. Bruken av donor menn bærer bakteriell β-galaktosidase genet tillatt identifisering av donor-avledet spermatogenesen og overføring av donor haplotype til avkommet etter mottakerland dyr 1. Overraskende, etter transplantasjon inn i lumen av seminiferous tubuli, var transplanterte kjønnsceller kunne bevege seg fra luminal rommet til basalmembran hvor spermatogonier ligger tre. Det er generelt akseptert at bare SSCs er i stand til å kolonisere nisje og reetablere spermatogenesen i mottakerlandene testis. Derfor bakterie celletransplantasjon gir en funksjonell tilnærming for å studere stamcelleforskningen nisje i testis og å karakterisere antatte spermatogonial stamceller. Til dags dato er bakterie celle transplantasjon brukes til å belyse grunnleggende stamcelleforskningen biologi, for å produsere transgene dyr gjennom genetisk manipulering av kjønnsceller før transplantasjon 4,5, for å studere sertoli celle-bakterie celle interaksjon 6,7, SSC homing og kolonisering 3, 8, samt SSC selvfornyelse og differensiering 9,10.
Bakterie celle transplantasjon er også mulig i store arter 11. I disse de viktigste programmene er bevaring av fruktbarhet, formidling av elite genetikk i dyrepopulasjoner, og generering av transgene dyr som studiet av spermatogenesen og SSC biologi med denne teknikken er logistikkmessig vanskeligere og dyrere enn hos gnagere. Transplantasjon av kjønnsceller fra store arter i de seminiferøse tubuli av mus resulterer i colonization av donor cellene og spermatogonial ekspansjon, men ikke i sin fulle differensiering antakelig på grunn av inkompatibilitet av mottakeren somatiske kupé med kjønnsceller fra fylogenetisk fjerne arter 12. En alternativ tilnærming er transplantasjon av kjønnsceller fra store arter sammen med sine omkringliggende somatisk avdeling. Vi først rapportert i 2002, at små fragmenter av testikkel vev fra umodne hanner transplantert under dorsal huden av immunsvikt mus er i stand til å overleve og gjennomgå full utvikling med produksjon av befruktning kompetent sperm 13. Siden da testikkel vev xenografting har vist seg å være vellykket i mange arter, og dukket opp som et verdifullt alternativ til å studere testis utvikling og spermatogenesen av store dyr i mus 14.
Protocol
DEL A. Germ celle transplantasjon i mus
1. Utarbeidelse av mottaker mus
- Mottakere skal være immunologisk tolerant (enten genetisk tilpasset givere eller immun-mangelfull) til donor testis cellene.
- Mottakere skal være enten naturlig blottet for spermatogenesen (f.eks w / w v mus) eller utarmet av endogene kjønnsceller. Bakterie celle uttømming kan oppnås ved bestråling eller cellegifter som busulfan. I denne protokollen, beskriver vi metoden for å forberede mottakerlandenes mus med busulfan.
- Unn mottakere 4-6 uker av alder via ip injeksjon av busulfan. Den optimale dosen av busulfan er belastning avhengig. I brukte mottakerlandene stammer, er en dose på 40-50 mg / kg tilstrekkelig til å utarme endogene kjønnsceller (f.eks 44 mg / kg for nakenmus, 50 mg / kg for B6/129 F1 mottakere).
- Løs busulfan pulver i DMSO og deretter legge til en tilsvarende volum sterilt destillert vann to foreta en endelig konsentrasjon på 4 mg / ml. Hold løsning varm ved 35-40 ° C før bruk for å unngå utfelling av busulfan. Kast løsning hvis nedbør er observert.
- Etter busulfan behandling, la minst en måned før bruk mottakere. Mottakere kan brukes mellom 1 måned og 3 måneder etter busulfan behandling.
2. Utarbeidelse av mikroinjeksjon pipetter
- Velg borsilikatglass pipetter (kapillarrør) med en 1,0 mm ytre diameter, en 0,75 mm indre diameter, og en lengde på 3 inches.
- Siliconize glass pipetter med Sigmacote, skyll pipetter med metanol og blåse tørr.
- Trekk pipetter ved hjelp av en pipette avtrekker. Ulike pipette avtrekkerarmer maskiner har ulike innstillinger, derfor teste noen få innstillinger. Vanligvis kan en innstilling lik den som brukes for å lage enucleation pipetter fungere.
- Bryt pipettespisser under dissekere mikroskop før bruk for å oppnå en diameter på ca 50 mikrometerpå spissen.
3. Utarbeidelse av donor cellene for transplantasjon
- Choise av donor belastning er avhengig av eksperimentelle spørsmålet studert. Hvis kvantifisering av spermatogenese benyttes som endepunkt, bruk av givere med en lett identifiserbar genetisk markør som Lac-Z (f.eks B6.129S7-Gt (ROSA) 26Sor / J fra Jackson Laboratory) eller GFP (f.eks C57BL/6-Tg ( CAG-EGFP) 1Osb / J fra Jackson Laboratory).
- Forbered 7 ml collagenase i DMEM på 1 mg / ml, 4 ml trypsin-EDTA (0,25% trypsin pluss 1mm EDTA), og 2 ml av DNase i DMEM på 7 mg / ml. Dette beløpet er for å fordøye 2 donor mus testiklene.
- Samle testiklene aseptisk og fjern hvite hinne. Spre seminiferous tubuli forsiktig med fine tang for å lette enzymatisk fordøyelse.
- Overfør tubuli inn collagenase og Inkuber ved 37 ° C i 5-10 min, og agitere ofte.
- Vask tubuli to ganger ved å spinne (200-300 g for 3 min) og re-suspendere i PBS w / o Ca 2 + +
- Re-suspendere tubuli i trypsin-EDTA og rist til de blir klissete og skyet. Overvåk fordøyelsen av tubuli ved 37 ° C som det skal skje innen 1-2 min.
- Legg DNase og rist godt. Inkuber i 1-2 min.
- Legg 3 ml FBS å stoppe virkningen av enzymer.
- Filter cellesuspensjon bruke en nylon mesh med 40-70 mikrometer porestørrelse å fjerne celle / vev biter.
- Samle cellene ved 600 gr i 5 min og re-suspendere celler i en liten mengde DMEM (<100 mL).
- Telle celler og justere volumet til ønsket endelig konsentrasjon (vanligvis 100 x 10 6). Hold cellesuspensjon på isen før bruk.
- Hver busulfan-behandlede mus testikkel vil bli fylt med bare 10-15 mL av cellesuspensjon. På grunn av potensiell avfall og lekkasje, tar sikte på å ha 30-50 mL per testikkel.
4. Transplantasjon prosedyre (Figur 1)
- Anaesthetize mottakere følgende godkjente protokoller.
- Plasser i dorsalrecumbency og kirurgisk forberede mageområdet. Lag en ~ 1cm midtlinjen abdominal snitt til å eksponere bukveggen. Løft bukveggen ved hjelp av små tang på det punktet av den hvite linjen for å unngå uhell skade bukorganer, og fortsetter å lage en ~ 0,5 cm snitt ved midtlinjen av bukveggen for å avdekke bukhulen.
- Bruk en Iris tang til å holde bukveggen, og bruke et annet par iris tang for å søke etter de fete pads er festet til epididymis og testikkel i bukhulen. Trekk forsiktig fettet puten ut til testis er exteriorized og testicular arterien og bitestikkelen er klart synlig. Arbeidet med én testikkel gangen.
- Plasser en tynn steril drapere laget fra autoklaveres kartotekkort under fettet pad / testis for bedre visuell identifisering (valgfritt). Den drapere arbeider også for å absorbere væske.
- Tilsett en dråpe Trypan Blå fargestoff inn i cellen fjæring og nøye laste cellesuspensjon inn polyethyLene slange koblet til en 1 ml sprøyte. Fest trakk pipetten inn i røret og forsiktig tvinge cellesuspensjon inn i pipetten ved å legge trykk på sprøyten.
- Identifiser efferente kanaler (som kobler testis til epididymis) og forsiktig fjerne fettvev rundt kanalene. Arbeid forsiktig som kanalene og membranen rundt dem er gjennomsiktig.
- Forsiktig sett pipetten inn i en kanal i bunt av efferente kanaler, forsiktig træ noen mm mot testis.
- Samtidig unngå å flytte injeksjonen pipetten, nå for sprøyten, forsiktig trykke stempelet på sprøyten for å sikre at suspensjonen strømmer inn i rete testis og seminiferous tubuli begynner å fylle.
- Injeksjonen rate og flyten av cellesuspensjon reguleres av tommelen press. Unngå brå økning i trykket, overvåke bevegelser av suspensjon i tubuli.
- Stopp injeksjonen når nesten alle overflater tubuli har blitt fylt før testis begynner å BECOme iskemisk.
- Returner testis til bukhulen. Gjenta prosedyren på motsatt testis. Suture bukveggen med 6-0 silke sutur og lukker huden med metall sår klipp. Overvåk mus på en oppvarming puten før full restitusjon.
5. Analyse av mottaker testiklene
- Tillat 2-4 måneder etter transplantasjon før analyse.
- Avlive mottakeren musen ifølge dyr omsorg og retningslinjer for bruk og samle den testis og bitestikkel inn PBS. Når en Lac-Z transgen donor stamme har blitt brukt, kan bitestikkelen brukes som en positiv farging kontroll som det har endogen beta-galaktosidase aktivitet.
- For påvisning av donor cellene ved Lac-Z flekker, fikse testis for 1-2 time ved 4 ° C i 4% paraformaldehyde (PFA) i PBS. Skyll 3 x 30 min ved romtemperatur i lacZ skyll buffer.
- Inkuber over natten ved 37 ° C i lacZ farging løsning. Testis kan farges som en helhet eller etter dispergeringtubuli.
- Fiks og lagre i 10% nøytral bufret formalin. Hvis deler er nødvendig å bruke nøytrale fort rød som counter-beis.
DEL B. Ektopisk xenografting i mus
(Fra Dobrinski og Rathi 2008 15, og Rodriguez-Sosa et al. 2011 16).
1. Innsamling av donor vev
- Skaff testikkel vev ved kastrering eller biopsi fra en donor mannlig.
- Plasser testikkel i PBS eller biopsi til kultur medium, opprettholde sterile forhold.
- Hold samlet vev på is og transport til laboratoriet.
2. Utarbeidelse av donor vev
- Utfør i vevskultur hette for å opprettholde sterilitet.
- Vask hver testikkel i iskalde PBS som inneholder antibiotika to til tre ganger før de overføres til et kultur-tallerken med PBS. I tilfelle av biopsier, vaske testikkel fragmenter to til tre ganger med iskaldt kultur medium som inneholder antibiotika ved å spinne på 150g i 2 min og resuspending i frisk iskald kultur medium.
- For intakte testiklene, fjerne tunica vaginalis ved å gjøre et snitt langs overflaten og extrude testis. Fjern fra testikkel alle anneks strukturer (sædlederen, bitestikkelen, bindevev). Vask testiklene en gang i kaldt PBS og overføring til et kultur-tallerken med PBS.
- Fjern forsiktig hvite hinne av testikkel ved hjelp av en skalpell blad og en saks. Hvis testiklene er svært liten, kan tunica fjernes ved å klemme på testiklene vev ut av tunica gjennom et lite innsnitt gjort på den ene enden mens du holder tunica med et par små tenger på den andre enden.
- Avhengig av størrelsen på testiklene enten hele testis vev kan kuttes i små biter på rundt 1-2 mm 3 i størrelse bruker buede pinsett og en skalpell blad, eller store biter av testikkel vev kan først tas ut av testis og deretter skåret i mindrestykker. Alt dette bør gjøres i iskaldt kultur medium og under sterile forhold i en liten kultur tallerken (60 X15 mm).
- Overfør de preparerte vev fragmenter til iskald kultur medium i små kultur-retter på is inntil poding.
3. Kastrering av mottaker mus
- Anaesthetize mus som ovenfor og forberede sterilt kirurgisk felt ved å klippe håret (ikke nødvendig i nakne mus), tørke over med 70% etanol og Betadine løsning.
- Lag en 0,5 -1 cm ventral midtlinje hud innsnitt for å avsløre bukveggen.
- Forsiktig utsette testis, det testicular arterien og bitestikkelen som beskrevet i PartA, 04.02 til 04.03.
- Løsne halen av epidydimis fra gubernaculum av stump disseksjon.
- Ligate testicular arterien, og sædledere sammen med blodet fartøyet med silke, og delen de ligated strukturene ved å kutte mellom testiklene og ligatur.
- Gjenta prosedyren for Second testis.
- Suture bukveggen med en eller to kirurgiske sting.
- Lukk huden snittet med ett eller to Michel klipp.
4. Ektopisk xenografting
- Plasser musen i ventrale recumbency og forberede et sterilt kirurgisk felt på ryggen som ovenfor.
- Avhengig av hvor mange grafts må settes inn (vanligvis 4-8/mouse), gjør ~~~HEAD=NNS 0,5 cm lange hud snitt på hver side av midtlinjen på baksiden av musen.
- Bruk pinsett til å holde en grense av huden snitt, og lage en subkutan hulrom ved erting fra hverandre bindevevet med saks.
- Bruke en iris tang sted et stykke testikkel vev dypt inn i subkutant hulrom, holder grensen av huden snitt med en annen iris tang.
- Lukk huden snittet med en Michel klipp og holde musen på varmepute til det begynner å komme seg fra anestesi.
- Overfør musen til et bur med ekstra isolasjon og cover og skjermen inntil mus er fullt restituert.
5. Innsamling av testikkel xenografts for analyse og sperm høsting
- Avlive verten musen ifølge dyr omsorg og retningslinjer for bruk, og lage en midtlinje hud snitt på baksiden huden går fra hale til hals og åpen hud. Dette avslører grafts som kan være plassert enten på det subkutane vev eller festet til huden.
- Fjern forsiktig grafts ved hjelp av en par pinsett og en saks.
- Rekordmange grafts gjenvinnes, størrelse og vekt av individuelle grafts.
- Hente sædblærene fra buken av mus og spille inn sin vekt som en indikasjon på testosteron produksjonen av podet vev.
- For histologisk analyse
- Suspend xenografts inn prøven hetteglass Bouin løsning (eller annet bindemiddel) i et volum msgstr 10x at av xenograft, og etiketten hetteglass hensiktsmessig.
- Inkuberover natten i kjøleskap fulgt av vask minst 3 ganger i 70% etanol i intervaller på 24 timer helst.
- Fortsett for å behandle og innstøping i parafin.
- For sperm høsting
- Vask xenografts ved å spinne dem ned på 300g i 1 min og resuspending dem i kultur medium som inneholder antibiotika.
- Skjær grafts i små biter og hakke forsiktig med pinsett i en vevskultur tallerken inneholder 3-5 ml av kultur medium.
- Filter hakket vev gjennom 40 mikrometer cellen sil.
Del C. Representative Resultater
1. Bakterie celle transplantasjon
Hvis den transplanterte donor cellesuspensjon inneholder spermatogonial stamceller bærer en genetisk markør som LacZ transgenet, kolonisering av donor SSCs i mottakerlandene testis kan bli visualisert ved X-gal flekker som karakteristiske blå segmenter av Seminiferous tubuli etter 2-3 mnd etter transplantasjonen 3 (Figur 2A). Et veletablert koloni bør ha en lang mørk blå strekning av helt fylt segmenter med to eller flere lag med blå celler nærmere sentrum, og relativt svakere farget regioner i begge ender, der et nettverk av singel, paret eller små grupper av blå celler er tydelig 3 (figur 2B). Et tverrsnitt av den mørke blå seminiferous tubule regionen bør avsløre veletablert og godt organisert spermatogenesen med blå kjønnsceller på ulike differensiering stadier (figur 2C).
2. Testis vev xenografting
Levedyktigheten til testikkel vev etter transplantasjon er omvendt korrelert med utviklingsstadiet av donor, det beste resultatet oppnås når vev fra nyfødte guttebarn blir brukt, mens voksen vev viser en tendens til å utarte og dø 17-21. Vanligvis synker xenograft suksess som donor vev gjennomgår megiosis av den første bølgen av spermatogenesen. Tid til full utvikling av umoden donor vev og fullstendig spermatogenesen er artsspesifikk, og ofte noe kortere sammenlignet med testikler i situ. Antallet sædproduserende tubuli med komplett spermatogenesen er variabel avhengig av tresort. Mens i sauer, geiter og griser at antallet er større enn 50%, i storfe og katter det er mindre enn 15% 14 (figur 3).
Figur 1. Bakterie celle transplantasjon prosedyre. Stedsnavn mottakere i dorsal recumbency etter anestesi og gjør en ~ 0,4-tommers midtlinjen abdominal snitt (A). Expose testikkel ved å trekke ut fett puten festet til epididymis og testikkel og legg en tynn steril drapere under fettet pad / testis for bedre visuell identifisering (B). Plasser testis og bitestikkelen, slik at de efferente kanaler begravet i fett puten er merkbare (C, D, E). Idenhet de efferente kanaler og forsiktig fjerne fettvev rundt kanalene. Et stykke farget papir eller plast kan plasseres under kanalene for bedre visualisering (G). Bryt eller slipe pipettespissen henhold til størrelsen på kanaler og last celle suspensjonen i pipetten (H). Forsiktig sett pipetten inn i en kanal i bunt av efferente kanaler, forsiktig træ noen mm mot testis (pilen i H viser retningen pipetten injeksjon og gjenging). En testikkel med vellykket injeksjon i seminiferous tubuli vises (I). TS: testis, Ep: bitestikkel.
Figur 2. Representative resultater for bakterie celle transplantasjon A) en injisert testis farget med X-gal. De blå segmenter av sædproduserende tubuli representerer etablerte kolonier fra transgene donor SSCs (LacZ transgene). B) Høyere forstørrelse av en SSC koloni på tre måneder etter transplantasjonen. The mørk blå regionen i sentrum representerer hele spermatogenesen og de lyseblå regionene i endene representerer økende forlengelse av kolonien. C) En histologisk seksjon av den mørke blå seminiferous tubule (3 mnd etter transplantasjonen) viser godt organisert spermatogenesen. Skala barer i B og C er 200 mikrometer og 30 mikrometer, henholdsvis. (Tall tilpasset fra årlig Rev Cell Dev Biol 2008;. 24:263-86 og Biol Reprod 1999 juni;. 60 (6) :1429-36).
Figur 3. Ektopisk xenografting av umoden testikkel vev fra store dyr i immunsvikt mus. Fragmenter av umodne donor testikkel (~ 1 mm 3) transplantert under dorsal huden på immunsvikt mus (A) er i stand til å overleve og reagere på mus gonadotropiner. Som et resultat, gjennomgår testikkel vev komplett utvikling, inkludert dannelsen av befruktning kompetent sperm (B). Når testikkel xenografts samles (C)de kan brukes til analyse eller for å få sperm (D) for ICSI (E) og embryo produksjon (F). Barer like 50 mikrometer (B, E og F) eller 10 mm (D). (Modifisert fra Rodriguez-Sosa og Dobrinksi 2009 14).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1. Bakterie celle transplantasjon
Bakterie celle transplantasjon gir den eneste funksjonelle analysen for utvetydig bekreftelse av tilstedeværelse av spermatogonial stamceller (SSCs) i en celle befolkning. Bare SSCs kan hjem til og kolonisere SSC nisje på basalmembran og initiere donor-derived spermatogenesen. Bakterie celle transplantasjon gjorde det mulig å studere og manipulere SSCs på en enestående måte. Teknikken har blitt brukt til å produsere transgene dyr gjennom genetisk manipulering av SSCs 4; å belyse mønsteret, effektivitet og kinetikk av SSC kolonisering 3,8, for å studere signalveier som regulerer SSC selvfornyelse og differensiering 9,10; å karakterisere overflate markører på SSCs for deres identifikasjon 22,23, til å studere nisje miljøet for SSCs 6,7,24. Videre har gjensidig transplantasjon vært ansatt for å undersøke om en fenotype av infertility stammer fra en defekt i sertolicellene eller i kjønnsceller 25,26.
For transplantasjon skal fungere effektivt, er valg og behandling av mottaker dyr viktig. Mottakere bør enten genetisk tilpasset givere eller immun-undertrykt. Mottakeren bør også mangler endogent spermatogenesen: enten skyldes en mutasjon som i W / W v mus, eller gjort ufruktbar som følge av bakterie celle uttømming av bestråling eller cellegifter som busulfan. Dessuten en god forberedelse av donor cellesuspensjoner og ferdigheter i transplantasjon prosedyre er viktig for suksessen av teknikken også.
Bakterie celle transplantasjon har sine egne begrensninger. Det er ingen rask lese-out for resultater. Analysen av mottakerlandene testiklene må vente minst to måneder som reetablering av komplett spermatogenesen i de ellers infertile mottakerne skjer to måneder etter transplantasjon tre. Det jegSA kvalitativ eller semi-kvantitative analysen på grunn av store variasjoner i celle nummer injiserte og grad av mottaker bakterie celle undertrykkelse. Selv om konseptet med bakterie celle transplantasjon har blitt tilpasset til andre dyrearter, er selve inngrepet teknisk annerledes og noe mer utfordrende i ikke-gnagere som følge av anatomiske forskjeller på tvers av arter 11.
2. Testis vev xenografting
Testikkel vev xenografting arbeider på tvers av mange pattedyr donor arter og er en relativt enkel teknikk. Som i andre typer transplantasjoner, jo raskere etter innsamling vevet blir transplantert det større sjanse for suksess. Derfor er bevaring og håndtering av vev fra samlingen til transplantasjon viktig. Men i vår erfaring testikkel vev ikke krever spesiell håndtering andre enn holdes nedkjølt. Testikkel vev kan opprettholdes ved kjøleskapstemperatur opptil 24-36 timer,og så fragmenter kan være forberedt på transplantasjon. Videre kan fragmenter av ferske testikler bli opprettholdt i standard kultur medium ved 4 ° C over natten før transplantasjon uten en merkbar effekt på transplantasjon utfallet 27. Testikkel vev kan også cryopreserved dersom langtidslagring er ønsket. Studier utført i geit 13, gris 13,27, og ape 28 har vist at frysing og påfølgende tining av testikkel vev påvirker ikke vesentlig dens evne til å utvikle og produsere sædceller etter ektopisk xenografting i mus. Vellykket nedfrysing av testikkel vev kan oppnås ved automatiske frysing 28 eller konvensjonell slow-frysing i en alkohol bad 13,27, bruke DMSO som cryoprotectant i standard vevskultur medium med FBS. For transplantasjon, er cryopreserved testikkel vev deretter tint med standard metode og deretter vasket i kultur medium før transplantasjon 27. Når tisSue har blitt transplantert mottakeren musen fungerer som en in vivo kuvøse og ingen større inngrep er nødvendig. Men i noen tilfeller tilskudd med eksogene gonadotropiner kan være nødvendig, testis vev fra 6-måneder gamle rhesusaper nødvendig å injisere mottakerlandene mus subkutant med 10 IE hCG to ganger i uken for å oppnå fullt spermatogenese på 6-7 måneder 29.
Som nevnt ovenfor, er det beste resultatet oppnås når vev fra nyfødte guttebarn blir brukt. Vev fra menn som postmeiotic kjønnsceller er tilstede viser en tendens til å utarte. Men med umodne dyr komplett gjentagelse av testikkel utvikling er mulig, og har en rekke kliniske og forskning. I en klinisk setting, kan testikkel vev xenografting brukes for fruktbarhet bevaring, spesielt i umodne menn der sæden utvinning er ikke et alternativ. Små brikker i form av biopsier kan samles og fryses for langtidslagring. Når desired, kan fragmentene tines og podet inn i mus 27,28. Et annet alternativ er nedfrysing av spermier som er høstet fra xenografts. Mikroinjeksjon med snap-frossen sperm fra gris testikkel xenografts resulterte i produksjon av morfologisk normale embryo, men på et lavere effektivitet i forhold til testikulær, epididymal, eller ejakulert sperm 27. Etter vev har utviklet, kan det hentes for høsting sperm og sperm kan brukes til å produsere embryoer in vitro 13,16,30. En begrensning av dette, er imidlertid det faktum at resulterende sædceller ikke gjennomgår epididymal modning og krever derfor ICSI for befruktning. Derfor er bruk av xenograft-avledet sæd for befruktning begrenset til arter der ICSI er etablert.
I forskning er testikkel vev xenografting et attraktivt alternativ for å studere testis utvikling og spermatogenesen av store arter i en gnager modell. For eksempel, ensingle donor testikkel kan transplanteres til flere mus. Mottaker mus kan da bli utsatt for ulike behandlinger, og / eller ofret ved ulike tidspunkt for xenograft samling. Dette ikke bare eliminerer donor effekter, men også reduserer antall store hanner som kreves for en bestemt eksperiment eller studere. Dette er spesielt viktig i store dyrene der studier som involverer mange menn er logistikkmessig vanskelig og kostbart, og kan bære etiske begrensninger, spesielt i primater. Imidlertid er anvendelser av testikkel vev xenografting begrenset som manipulering av spesifikke celletyper før transplantasjon er ikke lett mulig og effektivitet av spermatogenesen er lav i visse donor arter 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Arbeid fra forfattere laboratoriet har vært støttet av USDA / CSREES / NRICGP (2007-35203-18213); NIH / NCRR (2 R01 RR17359-06), NIH / NIEHS (1 R21 ES014856-01A2) og Alberta innovates - Helse Solutions.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase (type IV) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| DNaseI | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| DMEM | Invitrogen | 31053-028 | |
| Trypan blue stain | Invitrogen | 15250-061 | |
| Nylon mesh cell strainer | BD Biosciences | 352340 (40µm) 352350 (70µm) | |
| Busulfan | Sigma-Aldrich | B2635 | |
| Thin-Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW 100-3 | |
| BD intramedic plyethylene tubing (PE100) | BD Biosciences | CA-63018-725 | |
| Ethicon 6-0 Silk Suture | Ethicon Inc. | 706G | |
| Wound clips | BD Biosciences | 427631 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma-Aldrich | P3667 | |
| magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 208337 | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | 18896 |
References
- Brinster, R. L., Avarbock, M. R. Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (24), 11303-11303 (1994).
- Brinster, R. L., Zimmermann, J. W. Spermatogenesis following male germ-cell transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (24), 11298-11298 (1994).
- Nagano, M., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Pattern and kinetics of mouse donor spermatogonial stem cell colonization in recipient testes. Biology of Reproduction. 60 (6), 1429-1429 (1999).
- Nagano, M., Brinster, C. J., Orwig, K. E. Transgenic mice produced by retroviral transduction of male germ-line stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (23), 13090-13090 (2001).
- Ryu, B. Y., Orwig, K. E., Oatley, J. M. Efficient generation of transgenic rats through the male germline using lentiviral transduction and transplantation of spermatogonial stem cells. Journal of Andrology. 28 (2), 353-353 (2007).
- Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C. Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche. Cell Cycle. 5 (11), 1164-1164 (2006).
- Oatley, M. J., Racicot, K. E., Oatley, J. M. Sertoli cells dictate spermatogonial stem cell niches in the mouse testis. Biology of Reproduction. 84 (4), 639-639 (2011).
- Nagano, M. C. Homing efficiency and proliferation kinetics of male germ line stem cells following transplantation in mice. Biology of Reproduction. 69 (2), 701-701 (2003).
- Kubota, H., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Growth factors essential for self-renewal and expansion of mouse spermatogonial stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (47), 16489-16489 (2004).
- Oatley, J. M., Avarbock, M. R., Telaranta, A. I. Identifying genes important for spermatogonial stem cell self-renewal and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (25), 9524-9524 (2006).
- Dobrinski, I. Germ cell transplantation and testis tissue xenografting in domestic animals. Animal Reproduction Science. 89 (1-4), 137-137 (2005).
- Dobrinski, I., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Transplantation of germ cells from rabbits and dogs into mouse testes. Biology of Reproduction. 61 (5), 1331-1331 (1999).
- Honaramooz, A., Snedaker, A., Boiani, M. Sperm from neonatal mammalian testes grafted in mice. Nature. 418 (6899), 778-778 (2002).
- Rodriguez-Sosa, J. R., Dobrinski, I. Recent developments in testis tissue xenografting. Reproduction. 138 (2), 187-187 (2009).
- Dobrinski, I., Rathi, R. Ectopic grafting of mammalian testis tissue into mouse hosts. Methods in Molecular Biology. 139, Clifton, N.J. 450-450 (2008).
- Rodriguez-Sosa, J. R., Schlatt, S., Dobrinski, I. Testicular tissue transplantation for fertility preservation. Fertility Preservation: Emerging Technologies and Clinical Applications. Seli, E., Agarwal, A. , Springer. New York, NY. 331-331 (2011).
- Rathi, R., Honaramooz, A., Zeng, W. Germ cell fate and seminiferous tubule development in bovine testis xenografts. Reproduction. 130 (6), 923-923 (2005).
- Rathi, R., Honaramooz, A., Zeng, W. Germ cell development in equine testis tissue xenografted into mice. Reproduction. 131 (6), 1091-1091 (2006).
- Kim, Y., Selvaraj, V., Pukazhenthi, B. Effect of donor age on success of spermatogenesis in feline testis xenografts. Reproduction, Fertility, and Development. 19 (7), 869-869 (2007).
- Arregui, L., Rathi, R., Zeng, W. Xenografting of adult mammalian testis tissue. Animal Reproduction Science. 106 (1-2), 65-65 (2008).
- Schlatt, S., Honaramooz, A., Ehmcke, J. Limited survival of adult human testicular tissue as ectopic xenograft. Human Reproduction. 21 (2), 384-384 (2006).
- Shinohara, T., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. beta1- and alpha6-integrin are surface markers on mouse spermatogonial stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5504-5504 (1999).
- Kanatsu-Shinohara, M., Toyokuni, S., Shinohara, T. CD9 is a surface marker on mouse and rat male germline stem cells. Biology of Reproduction. 70 (1), 70-70 (2004).
- Ryu, B. Y., Orwig, K. E., Oatley, J. M. Effects of aging and niche microenvironment on spermatogonial stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (6), 1505-1505 (2006).
- Costoya, J. A., Hobbs, R. M., Barna, M. Essential role of Plzf in maintenance of spermatogonial stem cells. Nature Genetics. 36 (6), 653-653 (2004).
- Morrow, C. M., Hostetler, C. E., Griswold, M. D. ETV5 is required for continuous spermatogenesis in adult mice and may mediate blood testes barrier function and testicular immune privilege. Annals of the New York Academy of Sciences. 1120, 144-144 (2007).
- Zeng, W., Snedaker, A. K., Megee, S. Preservation and transplantation of porcine testis tissue. Reproduction, Fertility and Development. 21 (3), 489-489 (2009).
- Jahnukainen, K., Ehmcke, J., Hergenrother, S. D. Effect of cold storage and cryopreservation of immature non-human primate testicular tissue on spermatogonial stem cell potential in xenografts. Human Reproduction. 22 (4), 1060-1060 (2007).
- Rathi, R., Zeng, W., Megee, S. Maturation of testicular tissue from infant monkeys after xenografting into mice. Endocrinology. 149 (10), 5288-5288 (2008).
- Honaramooz, A., Li, M. W., Penedo, M. C. Accelerated maturation of primate testis by xenografting into mice. Biology of Reproduction. 70 (5), 1500-1500 (2004).
