Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

جرثومة زرع الخلايا والأنسجة الخصية Xenografting في الفئران

Published: February 6, 2012 doi: 10.3791/3545
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Comparative Biology and Experimental Medicine, University of Calgary
* These authors contributed equally

Summary

ويرد وصف بروتوكولات لجرثومة خلية زرع أنسجة الخصية وxenografting. نتائج زرع الخلايا الجرثومية في الحيوانات المنوية من المانحين المشتقة في الخصيتين المستفيدة وتمثل إعادة فحص وظيفي لتحديد الخلايا الجذعية spermatogonial (SSCs). خصية الانسجة xenografting يستنسخ تطوير خصية وتكوين الحيوانات المنوية من نوع مختلف الجهات المانحة في الفئران المتلقي.

Abstract

وقد وضعت زرع الخلايا الجرثومية الدكتور رالف Brinster وزملاؤه في جامعة ولاية بنسلفانيا في عام 1994، 1،2. وأظهرت هذه الدراسات الرائدة التي microinjection من الخلايا الجرثومية من الفئران المانحة خصبة في الأنيبيبات المنوية من العقم المستفيدة الفئران نتائج في تكوين الحيوانات المنوية والجهات المانحة والمستمدة من إنتاج الحيوانات المنوية من حيوان المتلقي 2. استخدام الذكور المانحة التي تحمل الجينات البكتيرية تحديد β-غالاكتوزيداز سمح الحيوانات المنوية من الجهات المانحة، والمستمدة من انتقال النمط الفرداني المانحة للنسل الحيوانات من قبل المستفيد 1. من المستغرب، بعد زرع في تجويف الأنيبيبات المنوية، وكانت الخلايا الجرثومية المزروعة قادرة على التحرك من مقصورة اللمعية إلى الغشاء القاعدي حيث تقع أمهات المني 3. ومن المسلم به عموما أن SSCs فقط قادرون على استعمار المتخصصة وتكوين الحيوانات المنوية إعادة تأسيس في الخصية المتلقي. الخلية الجرثومية لذلك،زرع يقدم نهجا وظيفية متخصصة لدراسة الخلايا الجذعية في الخصية وتميز المفترضة الخلايا الجذعية spermatogonial. حتى الآن، ويتم استخدام زرع الخلايا الجرثومية لتوضيح الأساسية بيولوجيا الخلايا الجذعية، لإنتاج حيوانات معدلة وراثيا من خلال التلاعب الجيني للخلايا الجرثومية قبل زرع 4،5، لدراسة سيرتولي التفاعل خلية خلية جرثومة 6،7، SSC صاروخ موجه والاستعمار 3، 8، وكذلك التعاون بين بلدان الجنوب الذاتي تجديد والتمايز 9،10.

زرع الخلايا الجرثومية هو أيضا ممكنا في الأنواع الكبيرة 11. في هذه، والتطبيقات الرئيسية هي الحفاظ على الخصوبة، ونشر علم الوراثة النخبة في قطعان الحيوانات، وجيل من الحيوانات المعدلة وراثيا كما في دراسة الحيوانات المنوية والبيولوجيا محكمة أمن الدولة مع هذه التقنية هو لوجستيا أكثر صعوبة وتكلفة مما كانت عليه في القوارض. زرع الخلايا الجرثومية من الأنواع الكبيرة في الأنيبيبات المنوية من نتائج الفئران في colonizatايون الخلايا المانحة وتوسيع spermatogonial، ولكن ليس في التفريق بشكل كامل بسبب عدم التوافق المفترض إلى الخلية المتلقية مقصورة جسدية مع الخلايا الجرثومية من الأنواع بعيد phylogenetically 12. نهج بديل هو زرع الخلايا الجرثومية من الأنواع الكبيرة جنبا إلى جنب مع مقصورة على جسدي المحيطة بها. نحن لاول مرة في عام 2002، أن شظايا صغيرة من نسيج الخصية من الذكور غير ناضج زرعها تحت جلد ظهري من الفئران العوز المناعي قادرون على البقاء على قيد الحياة والخضوع التام لتطوير انتاج الحيوانات المنوية إخصاب المختصة 13. ومنذ ذلك الحين وقد تبين أنسجة الخصية xenografting أن تكون ناجحة في كثير من الأنواع، وبرز بوصفه بديلا قيما لدراسة تطور الخصية والحيوانات المنوية من الحيوانات الكبيرة في الفئران 14.

Protocol

الجزء ألف خلية جرثومة زرع في الفئران

1. إعداد الفئران مستلم

  1. وينبغي أن يكون المستفيدون متسامح مناعيا (إما مطابقة وراثيا للجهات المانحة أو نقص المناعة-) لخلايا الخصية من الجهات المانحة.
  2. وينبغي أن يكون المستفيدون إما طبيعيا خاليا من الحيوانات المنوية (مثل W / W الخامس الفئران) أو المستنفد من الخلايا الجرثومية الذاتية. لا يمكن أن يتحقق جرثومة نضوب الخلية بواسطة أشعة أو أدوية العلاج الكيميائي مثل بوسلفان. في هذا البروتوكول، ونحن تصف طريقة اعداد الفئران المتلقي مع بوسلفان.
  3. علاج المتلقين في 4-6 أسبوع من العمر من خلال حقن الملكية الفكرية من بوسلفان. والجرعة المثالية من بوسلفان هو سلالة التابعة. في سلالات المتلقي استخداما، بجرعة 40-50 مغ / كغ غير كافية لاستنفاد الخلايا الجرثومية الذاتية (على سبيل المثال 44 مغ / كغ بالنسبة للفئران عارية، 50 ملغ / كغ للمتلقي B6/129 F1).
  4. حل بوسلفان مسحوق في DMSO ثم إضافة حجم مساو من الماء المقطر تي معقمس جعل تركيز النهائي من 4 ملغ / مل. إبقاء حل دافئ في 35-40 درجة مئوية قبل استخدامها لتجنب ترسيب بوسلفان. تجاهل حل إذا لوحظ هطول الأمطار.
  5. بعد العلاج بوسلفان، تسمح على الأقل قبل شهر واحد باستخدام المتلقين. ويمكن استخدام المتلقين بين 1 شهر و 3 أشهر بعد بوسلفان العلاج.

2. إعداد الماصات microinjection

  1. اختيار الماصات الزجاجية البورسليكات (أنابيب شعرية) يبلغ قطرها الخارجي 1.0 ملم، وقطرها الداخلي 0.75 مم، وبطول 3 بوصات.
  2. Siliconize الماصات الزجاجية مع Sigmacote، شطف الماصات مع الميثانول وضربة الجافة.
  3. سحب الماصات باستخدام مجتذب ماصة. مختلف الأجهزة مجتذب ماصة لها ظروف مختلفة، لذلك، واختبار بعض الإعدادات. عموما، قد وضع مماثلة لتلك التي تستخدم لصنع الماصات استئصال العمل.
  4. كسر نصائح ماصة تحت مجهر تشريح قبل استخدامها لتحقيق يبلغ قطرها حوالي 50 ميكرومترعلى الحافة.

3. إعداد الخلايا المانحة للزرع

  1. Choise من سلالة من المانحين يعتمد على سؤال التجريبية التي شملتها الدراسة. إذا تم استخدام القياس الكمي لتكون المني ونقطة النهاية، واستخدام الجهات المانحة مع علامة وراثي يمكن تحديدها بسهولة مثل لاك-Z (على سبيل المثال B6.129S7-GT (روسا) 26Sor / J من مختبر جاكسون) أو GFP (على سبيل المثال C57BL/6-Tg ( CAG-EGFP) 1Osb / J من مختبر جاكسون).
  2. تحضير 7 مل من كولاجيناز في DMEM في 1 ملغ / مل، 4 مل من التربسين-EDTA (0.25٪ زائد التربسين EDTA 1MM)، و 2 مل من الدناز في DMEM في 7 ملغ / مل. هذا المبلغ هو لهضم 2 الخصيتين الماوس المانحة.
  3. جمع الخصيتين جو معقم و مطهر وإزالة الغلالة البيضاء لل. انتشار الأنابيب المنوية بلطف مع ملقط غرامة لتسهيل عملية الهضم الأنزيمي.
  4. نقل الأنابيب إلى كولاجيناز، في احتضان 37 درجة مئوية ل5-10 دقيقة، وتستنهض الهمم في كثير من الأحيان.
  5. غسل الأنابيب مرتين من قبل الغزل (200-300 ز لمدة 3 دقائق) وإعادة تعليق في برنامج تلفزيوني ث / س كا 2 + +
  6. اعادة تعليق الأنابيب في التربسين-EDTA ويهز حتى تصبح لزجة وغائم. رصد الهضم من الأنابيب عند 37 درجة مئوية كما يجب أن يحدث في غضون 1-2 دقيقة.
  7. إضافة الدناز ويهز جيدا. احتضان لمدة 1-2 دقيقة.
  8. أضف 3 مل من FBS لوقف عمل الانزيمات.
  9. مرشح التعليق الخلية باستخدام شبكة من النايلون مع حجم المسام 40-70 ميكرون لإزالة خلية / نسيج قطع.
  10. جمع الخلايا في 600 غ لمدة 5 دقائق واعادة تعليق الخلايا في كمية صغيرة من DMEM (<100 ميكرولتر).
  11. عد الخلايا وضبط مستوى الصوت إلى التركيز النهائي المطلوب (عادة 100 × 10 6). الحفاظ على تعليق خلية على الجليد قبل استخدامها.
  12. وسيتم ملء كل خصية الفأر بوسلفان المعاملة مع فقط 10-15 ميكرولتر من التعليق الخلية. بسبب النفايات المحتملة والتسرب، وتهدف إلى أن 30-50 ميكروليتر في الخصية.

4. زرع الداخلي (الشكل 1)

  1. تخدير متلقي بعد البروتوكولات المعتمدة.
  2. مكان في ظهريالاستلقاء وإعداد جراحيا في منطقة البطن. جعل ~ شق خط الوسط 1cm البطن لكشف جدار البطن. رفع جدار البطن باستخدام ملقط صغير عند نقطة خط أبيض لتجنب اصابة غير قصد أعضاء البطن، والمضي قدما لجعل شق ~ 0.5 سم في خط الوسط من جدار البطن لكشف التجويف البريتوني.
  3. استخدام واحد ملقط القزحية لعقد جدار البطن، واستخدام زوج آخر من ملقط القزحية للبحث عن منصات الدهون التي تعلق على البربخ والخصية في التجويف البريتوني. سحب بلطف على وسادة من الدهون حتى يتم exteriorized الخصية والبربخ شريان الخصية ومرئية بوضوح. العمل على واحد الخصية في وقت واحد.
  4. وضع الستارة رقيقة معقم مصنوع من بطاقات مؤشر مشبع تحت وسادة من الدهون / خصية لتحديد أفضل البصرية (اختياري). وثنى كما تعمل على امتصاص السوائل.
  5. إضافة قطرة من صبغة زرقاء التريبان في تعليق خلية وتحميل بعناية في تعليق خلية في الحقائلين أنابيب متصلة حقنة 1 مل. نعلق ماصة سحبت في أنابيب وفرض بلطف تعليق خلية في ماصة عن طريق الضغط على الحقنة.
  6. تحديد القنوات صادر (التي تربط الخصية إلى البربخ) وإزالة بلطف الأنسجة الدهنية حول القنوات. العمل بعناية والقنوات وغشاء من حولهم وشفافة.
  7. إدراج بعناية ماصة في قناة في الحزمة من القنوات صادر، والخيط بلطف ملم قليلة نحو الخصية.
  8. وفي الوقت نفسه تجنب تحريك ماصة حقن، لتصل الى الحقنة، خفض بلطف المكبس من الحقنة للتأكد من أن تعليق يصب في الخصية الشبكة والأنابيب المنوية تبدأ لملء الفراغ.
  9. وينظم معدل الحقن وتدفق تعليق خلية بواسطة الضغط الإبهام. تجنب الزيادة المفاجئة في الضغط؛ رصد حركة التعليق في الأنابيب.
  10. وقف حقن عندما تم شغل تقريبا جميع الأنابيب السطح قبل الخصية يبدأ في BECأومه الدماغية.
  11. عودة الخصية إلى تجويف البطن. كرر الإجراء على الخصية المقابل. خياطة جدار البطن مع خياطة الحرير 6-0 وإغلاق الجرح الجلد مع مقاطع معدنية. مراقبة الفئران على لوحة ظاهرة الاحتباس حتى الشفاء التام.

5. تحليل من الخصيتين مستلم

  1. السماح 2-4 أشهر بعد زرع قبل التحليل.
  2. الموت ببطء الماوس المتلقي وفقا لرعاية الحيوان ومبادئ توجيهية لاستخدام وجمع الخصية والبربخ في برنامج تلفزيوني. عندما استخدمت المانحة المعدلة وراثيا لاك-Z السلالة، ويمكن استخدام البربخ كعنصر تحكم تلطيخ إيجابي كما فعلت الذاتية بيتا غالاكتوزيداز النشاط.
  3. للكشف عن خلايا المانحة بواسطة لاك-Z تلطيخ، إصلاح الخصية لمدة 1-2 ساعة عند 4 في بارافورمالدهيد 4٪ (منهاج العمل) في برنامج تلفزيوني درجة مئوية. شطف 3 × 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في lacZ شطف العازلة.
  4. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حل تلطيخ lacZ. ويمكن ملطخة خصية ككل أو بعد تفريقوالأنابيب.
  5. إصلاح وتخزينها في 10٪ محايد مخزنة الفورمالين. إذا هناك حاجة لاستخدام المقاطع أحمر سريع محايد مثل وصمة عار وصفة طبية.

الجزء باء خارج الرحم في الفئران xenografting

(من Dobrinski وراضي 2008 15، ورودريجيز، سوسا وآخرون. 2011 16).

1. مجموعة من الأنسجة من الجهات المانحة

  1. الحصول على نسيج الخصية بواسطة الإخصاء أو خزعة من ذكر الجهات المانحة.
  2. خصية مكان في برنامج تلفزيوني أو الخزعات إلى ثقافة المتوسط، والحفاظ على ظروف معقمة.
  3. الحفاظ على الأنسجة التي يتم جمعها على الجليد والنقل إلى المختبر.

2. إعداد الأنسجة المانحة

  1. نفذ في نسيج الثقافة غطاء محرك السيارة على الحفاظ على عقم.
  2. غسل كل خصية في المضادات الحيوية PBS المثلج يحتوي على مرتين إلى ثلاث مرات قبل أن ينتقل إلى صحن ثقافة مع برنامج تلفزيوني. في حالة والخزعات، وغسل شظايا خصية مرتين إلى ثلاث مرات مع المثلج ميدي ثقافةأم تحتوي على مضادات حيوية عن طريق الدوران في 150g لمدة 2 دقيقة وresuspending جديدة في الثقافة المتوسطة المثلج.
  3. لالخصيتين سليمة، وإزالة الغلالة الغمدية بجعل محاولة شق على طول السطح وقذف الخصية. إزالة من الهياكل خصية المرفق جميع (الحبل المنوي والبربخ والنسيج الضام). غسل الخصيتين مرة واحدة في برنامج تلفزيوني الباردة، ونقل إلى صحن ثقافة مع برنامج تلفزيوني.
  4. إزالة بعناية الغلالة البيضاء للمن الخصية باستخدام شفرة مشرط ومقص. إذا كانت الخصية صغيرة جدا، ويمكن إزالة الغلالة عن طريق الضغط على أنسجة الخصية من الغلالة من خلال شق صغير مصنوع على نهاية واحدة في حين الضغط على الغلالة مع زوج من ملقط صغير على الطرف الآخر.
  5. اعتمادا على حجم الخصية يمكن أن تكون إما قطع نسيج الخصية كلها الى قطع صغيرة من حوالي 1 - يمكن لل1 2 مم 3 في حجم باستخدام ملقط المنحنية وشفرة مشرط، أو قطع كبيرة من نسيج الخصية يمكن إزالتها من الخصية، وبعد ذلك خفض إلى أصغرقطعة. وينبغي أن يتم كل هذا في ثقافة المتوسط ​​الجليد الباردة وتحت ظروف معقمة في صحن صغير ثقافة (60 X15 ملم).
  6. نقل أجزاء الأنسجة استعدادا لثقافة المتوسط ​​الجليد الباردة في أطباق ثقافة الصغيرة على الجليد حتى التطعيم.

3. الإخصاء من الماوس المتلقي

  1. تخدير الماوس على النحو الوارد أعلاه، وإعداد مجال العمليات الجراحية المعقمة من قبل قص الشعر (ليس من الضروري في الفئران عارية)، ومحو الإيثانول مع 70٪ و حل Betadine.
  2. جعل 0.5 -1 سم الجلد خط الوسط شق بطني لفضح جدار البطن.
  3. فضح بعناية الخصية، والخصية والبربخ الشريان كما هو موضح في PartA، 4،2-4،3.
  4. فصل الذيل من epidydimis من رسن من تشريح حادة.
  5. Ligate الشريان الخصية، والأسهر مع الأوعية الدموية مع الحرير، وقسم الهياكل ligated عن طريق خفض ما بين الخصية وضمد و.
  6. كرر الإجراء لسيكوخصية الثانية.
  7. خياطة جدار البطن مع واحد أو اثنين غرز جراحية.
  8. إغلاق شق الجلد مع مقاطع ميشال واحد أو اثنين.

4. خارج الرحم xenografting

  1. ضع الماوس في الاستلقاء البطني وإعداد حقل معقمة جراحية على ظهرها على النحو الوارد أعلاه.
  2. اعتمادا على مدى العديد من الطعوم هي التي ستدرج لاحقا (عادة 4-8/mouse)، وجعل ~ 0.5 سم شقوق الجلد طويل على كل جانب من خط منتصف الجزء الخلفي من الماوس.
  3. استخدام ملقط لعقد الحدود من شق الجلد، وجعل تجويف تحت الجلد بواسطة إغاظة تمزق النسيج الضام باستخدام مقص.
  4. باستخدام ملقط مكان قزحية قطعة من نسيج الخصية في عمق تجويف تحت الجلد، وعقد على الحدود من شق الجلد مع آخر ملقط القزحية.
  5. إغلاق شق الجلد مع مشبك ميشال واحدة والحفاظ على الماوس على لوحة التسخين حتى يبدأ في التعافي من التخدير.
  6. نقل الماوس إلى قفص مع عزل إضافية والتعاونالاصدار، ورصد حتى الفئران وتعافى تماما.

5. جمع من xenografts الخصية للتحليل وجمع الحيوانات المنوية

  1. الموت ببطء الماوس المضيفة وفقا لرعاية الحيوان ومبادئ توجيهية لاستخدام، وجعل شق الجلد خط الوسط على الجلد مرة أخرى ويمتد من الذيل إلى الرقبة والجلد مفتوحة. هذا الكشف عن الطعوم التي يمكن أن تقع إما على النسيج تحت الجلد أو تعلق على الجلد.
  2. إزالة بعناية ترقيع باستخدام ملقط الزوج وزوج من مقص.
  3. عدد قياسي من حجم الطعوم، والمستعادة والوزن من الطعوم الفردية.
  4. استرداد الحويصلات المنوية من البطن من الفأرة وتسجيل أوزانهم كمؤشر على انتاج هرمون تستوستيرون بواسطة الأنسجة المطعمة.
  5. للتحليل النسيجي
    1. تعليق xenografts إلى قارورة تحتوي على عينة حل بوين (أو مثبت أخرى) في حجم 10X ~ وذلك من طعم أجنبي، ومناسب قارورة التسمية.
    2. احتضانبين عشية وضحاها في الثلاجة تليها غسل ما لا يقل عن 3 مرات في الايثانول 70٪ على فترات من 24 ساعة ويفضل.
    3. والمضي قدما لمعالجة وتضمينها في البارافين.
  6. لتجميع السائل المنوي
    1. غسل xenografts بواسطة غزل عليهم في 300g لمدة 1 دقيقة، وresuspending لهم في المضادات الحيوية التي تحتوي على ثقافة المتوسط.
    2. قطع ترقيع الى قطع صغيرة واللحم المفروم بعناية مع ملقط في نسيج الثقافة التي تحتوي على طبق 3-5 مل من ثقافة المتوسط.
    3. المفروم الأنسجة مرشح من خلال مصفاة ميكرومتر الخلية 40.

نتائج الجزء جيم الممثل

1. جرثومة خلية زرع

ويمكن إذا كانت الخلية المانحة المزروعة تعليق يحتوي على خلايا جذعية spermatogonial تحمل علامة وراثية مثل التحوير LacZ، استعمار SSCs المانحة في الخصية المتلقي تصور بواسطة X-غال تلطيخ مثل قطاعات الزرقاء المميزة لوزارة شؤون المرأةiniferous الأنابيب بعد 2-3 أشهر بعد زرع 3 (الشكل 2A). وينبغي أن يكون مستعمرة راسخة لديها منذ فترة طويلة تمتد زرقاء داكنة من قطاعات مليئة تماما مع اثنين أو أكثر من طبقات من الخلايا الزرقاء أقرب للمركز، والمناطق الملطخة أضعف نسبيا عند كلا الطرفين حيث شبكة من الاقتران، واحدة أو مجموعات صغيرة من الخلايا الزرقاء من الواضح 3 (الشكل 2B). وينبغي أن يكون المقطع العرضي للمنطقة الأزرق الداكن النبيبات المنوية تكشف راسخة ومنظمة تنظيما جيدا مع الحيوانات المنوية الخلايا الجرثومية الزرقاء في مراحل تمايز مختلف (الشكل 2C).

2. خصية الانسجة xenografting

ويرتبط عكسيا جدوى من الأنسجة بعد زرع الخصية مع المرحلة التنموية للالمانحة؛ يتم الحصول على أفضل النتائج عندما يتم استخدام أنسجة من الذكور حديثي الولادة، في حين أن الأنسجة الكبار يدل على اتجاه ارتفاع في التدهور ويموت 17-21. عموما، نجاح طعم أجنبي يتناقص مع الأنسجة المانحة يخضع ليiosis من الموجة الأولى من الحيوانات المنوية. الوقت لتطوير كامل من الأنسجة المانحة غير ناضجة والحيوانات المنوية الكامل هو نوع معين، وغالبا ما تكون أقصر إلى حد ما في المقارنة مع الخصيتين في الموقع. عدد الأنيبيبات المنوية مع الحيوانات المنوية التام غير متغير وفقا للأنواع. بينما في الأغنام والماعز والخنازير أن عدد أكبر من 50٪، في الماشية والقطط هو أقل من 15٪ 14 (الشكل 3).

الشكل 1
الشكل 1. إجراء زرع الخلايا الجرثومية. مكان المتلقين في الاستلقاء الظهري بعد التخدير وإجراء ~ 0.4 بوصة شق البطن خط الوسط (أ). فضح الخصية عن طريق سحب وسادة من الدهون التي تعلق على البربخ والخصية ووضع الستارة رقيقة معقم تحت وسادة من الدهون / خصية لتحديد أفضل البصرية (B). وضع الخصية والبربخ بحيث القنوات صادر دفن في وسادة من الدهون يمكن تمييز (C، D، E). معرفكيان القنوات صادر بلطف وإزالة الأنسجة الدهنية حول القنوات. يمكن وضع قطعة من الورق الملون أو البلاستيك تحت مجاري لأفضل تصور (G). كسر أو طحن غيض ماصة وفقا لحجم القنوات وحمل تعليق خلية في ماصة (H). إدراج بعناية ماصة في قناة في الحزمة من القنوات صادر، والخيط بلطف ملم قليلة نحو الخصية (السهم في H يدل على اتجاه حقن ماصة وخيوط). ويرد خصية مع حقن الناجح في الأنيبيبات المنوية (I). TS: الخصية، الجيش الشعبي: البربخ.

الشكل 2
الشكل 2. ممثل النتائج لزرع الخلية الجرثومية أ) خصية حقن ملطخة X-غال. شرائح الزرقاء في الأنيبيبات المنوية تمثل مستعمرات أنشئت من SSCs المانحة المعدلة وراثيا (LacZ التحوير). B) تضخم أعلى من مستعمرة محكمة أمن الدولة في 3 أشهر في مرحلة ما بعد الزرع. اله منطقة الأزرق الداكن في الوسط تمثل الحيوانات المنوية كاملة والمناطق شاحب اللون الأزرق في نهايات تمثل امتدادا المتزايدة للمستعمرة. ج) قسم نسيجية للالنبيبات المنوية أزرق داكن (3 أشهر بعد زرع) يظهر الحيوانات المنوية منظمة تنظيما جيدا. الحانات النطاق في وباء وجيم هي 200 ميكرومتر و 30 ميكرون، على التوالي. (الأرقام مقتبسة من خلية ANNU القس ديف بيول 2008؛. 24:263-86 وReprod بيول يونيو 1999؛. 60 (6) :1429-36).

الشكل (3)
الشكل 3. xenografting خارج الرحم من أنسجة الخصية غير ناضج من الحيوانات الكبيرة في الفئران العوز المناعي. أجزاء من الخصية المانحة غير ناضج (~ 1 مم 3) زرع تحت جلد ظهري من الفئران العوز المناعي (أ) القدرة على البقاء على قيد الحياة والاستجابة لالجونادوتروبين الماوس. ونتيجة لذلك، يخضع لنسيج الخصية تنمية كاملة، بما في ذلك تكوين الحيوانات المنوية إخصاب المختصة (B). مرة واحدة يتم جمع xenografts الخصية (C)يمكن استخدامها لأغراض التحليل أو للحصول على الحيوانات المنوية (D) عن الحقن المجهري (E) وإنتاج جنين (F). قضبان متساوية 50 ميكرومتر (B، E و F) أو 10 ميكرومتر (D). (معدلة من رودريغيز، سوسا وDobrinksi 2009 14).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

1. جرثومة خلية زرع

جرثومة زرع الخلايا يوفر فحص وظيفي فقط لتأكيد لا لبس فيه من وجود خلايا جذعية spermatogonial (SSCs) في عدد السكان الخلية. يمكن SSCs فقط موطنا لواستعمار محراب محكمة أمن الدولة في الغشاء القاعدي والشروع المانحة المشتقة من الحيوانات المنوية. جعلت جرثومة خلية زرع من الممكن دراسة والتلاعب SSCs على نحو غير مسبوق. وقد استخدمت هذه التقنية لإنتاج حيوانات معدلة وراثيا من خلال التلاعب الجيني للSSCs 4؛ لإلقاء الضوء على نمط والكفاءة وحركية من الاستعمار SSC 3،8؛ لدراسة مسارات الإشارات التي تنظم التعاون بين بلدان الجنوب الذاتي تجديد والتمايز 9،10؛ لتوصيف علامات على سطح SSCs عن هويتهم 22،23؛ لدراسة بيئة ملائمة لSSCs 6،7،24. وعلاوة على ذلك، واستخدمت متبادلة للتحقيق في ما إذا كان زرع النمط الظاهري من infertilitنشأت Y من خلل في خلايا سيرتولي أو في الخلايا الجرثومية 25،26.

لزرعها على العمل بكفاءة، واختيار وعلاج الحيوانات المتلقي هو المهم. وينبغي أن المستفيدين إما مطابقة وراثيا للجهات المانحة أو المناعة قمعها. وينبغي أن المستفيدين تفتقر أيضا الحيوانات المنوية الذاتية: إما بسبب طفرة كما هو الحال في الفئران V W / W، أو يجعل من يعانون من العقم نتيجة لنضوب الخلية الجرثومية بواسطة أشعة أو أدوية العلاج الكيميائي مثل بوسلفان. وعلاوة على ذلك، والتحضير الجيد من الايقاف الخلية المانحة والكفاءة في إجراء زرع مهمة لنجاح هذه التقنية أيضا.

جرثومة زرع الخلايا والقيود الخاصة بها. ليس هناك سريع للقراءة من أجل تحقيق النتائج. تحليل الخصيتين المتلقي يحتاج الى الانتظار على الأقل لمدة شهرين وإعادة الحيوانات المنوية التام في المتلقين وإلا يحدث العقم لمدة شهرين بعد زرع 3. هذا أناSA فحص نوعي أو شبه الكمي، وذلك نتيجة لتغيرات كبيرة في عدد الخلايا المحقونة ودرجة جرثومة المتلقي قمع الخلية. على الرغم من ذلك تم تعديل مفهوم زرع الخلايا الجرثومية لأنواع الحيوانات الأخرى، فإن الإجراء في حد ذاته يختلف من الناحية الفنية، وإلى حد ما أكثر صعوبة في عدم القوارض الأنواع نتيجة للاختلافات تشريحية بين الأنواع 11.

2. خصية الانسجة xenografting

خصية الانسجة xenografting الأعمال عبر العديد من أنواع الثدييات والجهات المانحة هي تقنية بسيطة نسبيا. كما هو الحال في أنواع أخرى من عمليات الزرع، وجمع عاجلا بعد زرع النسيج أكبر فرصة للنجاح. ولذلك والمحافظة عليها والتعامل مع الأنسجة من جمع إلى زرع المهم. ومع ذلك، في تجربتنا نسيج الخصية لا تتطلب معالجة خاصة بخلاف يجري حفظها في مكان بارد. يمكن الحفاظ على نسيج الخصية في درجة حرارة الثلاجة حتى 24 حتي 36 ساعة،ويمكن بعد ذلك أعد شظايا للزرع. وعلاوة على ذلك، يمكن الحفاظ على شظايا من خصية جديدة في ثقافة المتوسط ​​القياسي عند 4 درجة مئوية قبل زرع بين عشية وضحاها من دون تأثير ملحوظ على نتائج تطعيم 27. ويمكن أيضا أن أنسجة الخصية cryopreserved إذا كان المطلوب التخزين على المدى الطويل. وقد أظهرت الدراسات التي أجريت في الماعز 13، 13،27 الخنزير، والقرد 28 التي التجميد والذوبان لاحق من نسيج الخصية لا يؤثر بشكل كبير قدرتها على تطوير وانتاج الحيوانات المنوية خارج الرحم بعد xenografting في الفئران. لا يمكن أن يتحقق الحفظ بالتبريد ناجح من نسيج الخصية بواسطة الآلي للتجميد 28 أو تجميد التقليدية بطيئة في حمام الكحول 13،27، وذلك باستخدام DMSO كما cryoprotectant في معيار نسيج الثقافة المتوسطة التي تحتوي على FBS. للزرع، وإذابة ثم cryopreserved خصية الانسجة بواسطة الأساليب القياسية وغسلها بعد ذلك في مستنبت قبل زرع 27. مرة واحدة في TISوقد تم زرع سو الماوس المتلقي بمثابة مطلوبة 1 في حاضنة الجسم الحي وليس بتدخلات كبيرة. ومع ذلك، في بعض الحالات قد تكون هناك حاجة مكملات مع الجونادوتروبين الخارجية؛ نسيج الخصية في الفترة من 6 أشهر من العمر القرود المطلوبة عن طريق الحقن تحت الجلد الفئران المتلقي مع 10 وحدة دولية من قوات حرس السواحل الهايتية مرتين في الأسبوع لتحقيق كامل في الحيوانات المنوية 6-7 29 شهرا.

كما ذكر أعلاه، يتم الحصول على أفضل النتائج عندما يتم استخدام أنسجة من الذكور حديثي الولادة. نسيج من الذكور في الخلايا الجرثومية التي تال للانتصاف موجودة يظهر الميل إلى المنحطة. ومع ذلك، مع الحيوانات غير ناضجة خلاصة كاملة من التنمية الخصية هو ممكن ولها العديد من التطبيقات السريرية والبحوث. في عملية إعداد سريرية، ويمكن استخدام نسيج الخصية xenografting للحفاظ خصوبة، وخاصة في الذكور غير ناضج في الانتعاش الذي الحيوانات المنوية ليست خيارا. ويمكن جمع قطع صغيرة على شكل عينات للفحص وتجميدها لفترة طويلة الأجل للتخزين. عندما قصرired، يمكن إذابة شظايا والمطعمة 27،28 في الفئران. وثمة بديل آخر هو الحفظ بالتبريد من الحيوانات المنوية التي يتم حصادها من xenografts. أدى Microinjection مع الإضافية المجمدة الحيوانات المنوية من الخصية xenografts خنزير في جيل من أجنة طبيعية شكليا، وإن كان أقل كفاءة مقارنة الخصية، بربخي، أو أنزل المني 27. وقد وضعت بعد الأنسجة، ويمكن جمعها من أجل حصاد الحيوانات المنوية، ويمكن استخدامها لانتاج الحيوانات المنوية الأجنة في المختبر 13،16،30. وجود قيود من هذا، ومع ذلك، هو حقيقة أن الناتج الحيوانات المنوية لا تخضع للنضوج بربخي، وبالتالي تتطلب الحقن المجهري للإخصاب. لذلك، ويقتصر استخدام طعم أجنبي المستمدة من الحيوانات المنوية للإخصاب على الأنواع التي أقيمت فيها الحقن المجهري.

في مجال البحوث وخصية الانسجة xenografting هو بديلا جذابا لدراسة تطور الخصية والحيوانات المنوية من الأنواع الكبيرة في نموذج القوارض. على سبيل المثال،يمكن زرع خصية مانح للمساعدات للفئران متعددة. ويمكن بعد ذلك الفئران المتلقي أن تتعرض للعلاجات المختلفة، و / أو التضحية في نقاط زمنية مختلفة لجمع طعم أجنبي. هذا ليس فقط يزيل آثار المانحة، ولكن أيضا يقلل من عدد الذكور الكبيرة المطلوبة لتجربة خاصة أو الدراسة. هذا مهم بشكل خاص في الحيوانات الكبيرة حيث الدراسات التي تنطوي على العديد من الذكور من الصعب من الناحية اللوجستية ومكلفة، ويمكن أن تحمل القيود الأخلاقية، وخصوصا في المقدمات. ومع ذلك، وتقتصر التطبيقات من نسيج الخصية xenografting كما تلاعب من أنواع معينة من الخلايا قبل زرع ليس من الممكن بسهولة وكفاءة الحيوانات المنوية منخفض في أنواع معينة من الجهات المانحة 14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وقد تم دعم العمل من المختبر الكتاب من قبل وزارة الزراعة الأمريكية / CSREES / NRICGP (2007-35203-18213)؛ المعاهد الوطنية للصحة / NCRR (2 RR17359 R01-06)، المعاهد الوطنية للصحة / معهد علوم الصحة البيئية (1-R21 ES014856 01A2) ويبتكر ألبرتا - حلول الصحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase (type IV) Sigma-Aldrich C5138
Trypsin-EDTA Invitrogen 25200-056
DNaseI Sigma-Aldrich DN25
DMEM Invitrogen 31053-028
Trypan blue stain Invitrogen 15250-061
Nylon mesh cell strainer BD Biosciences 352340 (40µm) 352350 (70µm)
Busulfan Sigma-Aldrich B2635
Thin-Wall Glass Capillaries World Precision Instruments, Inc. TW 100-3
BD intramedic plyethylene tubing (PE100) BD Biosciences CA-63018-725
Ethicon 6-0 Silk Suture Ethicon Inc. 706G
Wound clips BD Biosciences 427631
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2
X-gal Sigma-Aldrich B4252
Potassium Ferrocyanide Sigma-Aldrich P9387
Potassium Ferricyanide Sigma-Aldrich P3667
magnesium chloride Sigma-Aldrich 208337
sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750
N,N-Dimethylformamide Sigma-Aldrich D4551
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich 18896

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brinster, R. L., Avarbock, M. R. Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (24), 11303-11303 (1994).
  2. Brinster, R. L., Zimmermann, J. W. Spermatogenesis following male germ-cell transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (24), 11298-11298 (1994).
  3. Nagano, M., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Pattern and kinetics of mouse donor spermatogonial stem cell colonization in recipient testes. Biology of Reproduction. 60 (6), 1429-1429 (1999).
  4. Nagano, M., Brinster, C. J., Orwig, K. E. Transgenic mice produced by retroviral transduction of male germ-line stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (23), 13090-13090 (2001).
  5. Ryu, B. Y., Orwig, K. E., Oatley, J. M. Efficient generation of transgenic rats through the male germline using lentiviral transduction and transplantation of spermatogonial stem cells. Journal of Andrology. 28 (2), 353-353 (2007).
  6. Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C. Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche. Cell Cycle. 5 (11), 1164-1164 (2006).
  7. Oatley, M. J., Racicot, K. E., Oatley, J. M. Sertoli cells dictate spermatogonial stem cell niches in the mouse testis. Biology of Reproduction. 84 (4), 639-639 (2011).
  8. Nagano, M. C. Homing efficiency and proliferation kinetics of male germ line stem cells following transplantation in mice. Biology of Reproduction. 69 (2), 701-701 (2003).
  9. Kubota, H., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Growth factors essential for self-renewal and expansion of mouse spermatogonial stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (47), 16489-16489 (2004).
  10. Oatley, J. M., Avarbock, M. R., Telaranta, A. I. Identifying genes important for spermatogonial stem cell self-renewal and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (25), 9524-9524 (2006).
  11. Dobrinski, I. Germ cell transplantation and testis tissue xenografting in domestic animals. Animal Reproduction Science. 89 (1-4), 137-137 (2005).
  12. Dobrinski, I., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Transplantation of germ cells from rabbits and dogs into mouse testes. Biology of Reproduction. 61 (5), 1331-1331 (1999).
  13. Honaramooz, A., Snedaker, A., Boiani, M. Sperm from neonatal mammalian testes grafted in mice. Nature. 418 (6899), 778-778 (2002).
  14. Rodriguez-Sosa, J. R., Dobrinski, I. Recent developments in testis tissue xenografting. Reproduction. 138 (2), 187-187 (2009).
  15. Dobrinski, I., Rathi, R. Ectopic grafting of mammalian testis tissue into mouse hosts. Methods in Molecular Biology. 139, Clifton, N.J. 450-450 (2008).
  16. Rodriguez-Sosa, J. R., Schlatt, S., Dobrinski, I. Testicular tissue transplantation for fertility preservation. Fertility Preservation: Emerging Technologies and Clinical Applications. Seli, E., Agarwal, A. , Springer. New York, NY. 331-331 (2011).
  17. Rathi, R., Honaramooz, A., Zeng, W. Germ cell fate and seminiferous tubule development in bovine testis xenografts. Reproduction. 130 (6), 923-923 (2005).
  18. Rathi, R., Honaramooz, A., Zeng, W. Germ cell development in equine testis tissue xenografted into mice. Reproduction. 131 (6), 1091-1091 (2006).
  19. Kim, Y., Selvaraj, V., Pukazhenthi, B. Effect of donor age on success of spermatogenesis in feline testis xenografts. Reproduction, Fertility, and Development. 19 (7), 869-869 (2007).
  20. Arregui, L., Rathi, R., Zeng, W. Xenografting of adult mammalian testis tissue. Animal Reproduction Science. 106 (1-2), 65-65 (2008).
  21. Schlatt, S., Honaramooz, A., Ehmcke, J. Limited survival of adult human testicular tissue as ectopic xenograft. Human Reproduction. 21 (2), 384-384 (2006).
  22. Shinohara, T., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. beta1- and alpha6-integrin are surface markers on mouse spermatogonial stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5504-5504 (1999).
  23. Kanatsu-Shinohara, M., Toyokuni, S., Shinohara, T. CD9 is a surface marker on mouse and rat male germline stem cells. Biology of Reproduction. 70 (1), 70-70 (2004).
  24. Ryu, B. Y., Orwig, K. E., Oatley, J. M. Effects of aging and niche microenvironment on spermatogonial stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (6), 1505-1505 (2006).
  25. Costoya, J. A., Hobbs, R. M., Barna, M. Essential role of Plzf in maintenance of spermatogonial stem cells. Nature Genetics. 36 (6), 653-653 (2004).
  26. Morrow, C. M., Hostetler, C. E., Griswold, M. D. ETV5 is required for continuous spermatogenesis in adult mice and may mediate blood testes barrier function and testicular immune privilege. Annals of the New York Academy of Sciences. 1120, 144-144 (2007).
  27. Zeng, W., Snedaker, A. K., Megee, S. Preservation and transplantation of porcine testis tissue. Reproduction, Fertility and Development. 21 (3), 489-489 (2009).
  28. Jahnukainen, K., Ehmcke, J., Hergenrother, S. D. Effect of cold storage and cryopreservation of immature non-human primate testicular tissue on spermatogonial stem cell potential in xenografts. Human Reproduction. 22 (4), 1060-1060 (2007).
  29. Rathi, R., Zeng, W., Megee, S. Maturation of testicular tissue from infant monkeys after xenografting into mice. Endocrinology. 149 (10), 5288-5288 (2008).
  30. Honaramooz, A., Li, M. W., Penedo, M. C. Accelerated maturation of primate testis by xenografting into mice. Biology of Reproduction. 70 (5), 1500-1500 (2004).

Tags

البيولوجيا التطورية، العدد 60، الخلايا الجذعية Spermatogonial (SSCs)، زرع الخلايا الجرثومية، الحيوانات المنوية، خصية التنمية، والخصية الأنسجة xenografting
جرثومة زرع الخلايا والأنسجة الخصية Xenografting في الفئران
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, L., Rodriguez-Sosa, J. R.,… More

Tang, L., Rodriguez-Sosa, J. R., Dobrinski, I. Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice. J. Vis. Exp. (60), e3545, doi:10.3791/3545 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter