Summary
Protokolle für die Keimzelle der Transplantation und Hodengewebe Xenografting werden beschrieben. Germ-Transplantation führt zu Donor-derived Spermatogenese in den Empfängerländern Hoden und eine funktionelle Rekonstitution Assay für die Identifizierung von Spermatogonien-Stammzellen (SSC). Hodengewebe Xenografting reproduziert Hodenentwicklung und Spermatogenese verschiedener Spender Arten in Empfängermäuse.
Abstract
Keimzelle der Transplantation wurde von Dr. Ralph Brinster und Kollegen an der University of Pennsylvania im Jahr 1994 1,2 entwickelt. Diese bahnbrechenden Studien zeigten, dass die Mikroinjektion von Keimzellen von Mäusen fruchtbaren Spender in die Samenleiter des unfruchtbaren Empfängermäuse Ergebnisse in Donor abgeleitete Spermatogenese und Spermien durch den Empfänger Tier 2. Die Nutzung von Spender männlichen Trägern die bakterielle β-Galactosidase-Gen erlaubte die Identifizierung Donor abgeleitete Spermatogenese und Übermittlung des Donor Haplotyp an die Nachkommen durch den Empfänger Tiere 1. Überraschenderweise, nach der Transplantation in das Lumen der Tubuli seminiferi, waren transplantierten Keimzellen in der Lage, von der luminalen Kompartiment zu dem Basalmembran, wo Spermatogonien 3 angeordnet sind zu bewegen. Es ist allgemein anerkannt, dass nur SSCs der Lage, die Nische und wieder herzustellen Spermatogenese in den Hoden zu kolonisieren Empfänger sind. Daher KeimzelleTransplantation bietet einen funktionalen Ansatz, um die Stammzell-Nische in den Hoden zu studieren und zu vermeintlichen Stammsamenzellen charakterisieren. Bis heute ist Keimzelle Transplantation verwendet werden, um grundlegende Stammzellbiologie aufzuklären, um transgene Tiere durch genetische Manipulation der Keimzellen vor der Transplantation 4,5 zu produzieren, zu Sertoli-Zell-Interaktion Keimzelle 6,7, SSC Homing und Kolonisierung 3-Studie 8, sowie SSC Selbsterneuerung und Differenzierung 9,10.
Germ-Transplantation ist auch in großen Spezies 11 machbar. In diesen sind die Hauptanwendungen Erhaltung der Fruchtbarkeit, die Verbreitung von Elite Genetik in Tierpopulationen, und die Erzeugung von transgenen Tieren, wie die Studie der Spermatogenese und SSC Biologie mit dieser Technik ist, logistisch schwieriger und teurer als bei Nagern. Die Transplantation von Keimzellen aus großen Arten in die Samenleiter von Mäusen führt zu colonization von Spenderzellen und Spermatogonien Expansion, aber nicht in ihrer vollen Differenzierung vermutlich aufgrund der Inkompatibilität des Empfängers somatische Zell-Kompartiment mit den Keimzellen von phylogenetisch entfernten Spezies 12. Ein alternativer Ansatz ist die Transplantation von Keimzellen aus großen Arten zusammen mit den sie umgebenden somatischen Fach. Zunächst berichtete im Jahr 2002, dass kleine Fragmente von Hodengewebe aus unreifen Männchen unter die Rückenhaut von immundefizienten Mäusen transplantiert in der Lage, zu überleben und zu unterziehen volle Entwicklung mit der Produktion von Spermien Befruchtung zuständig sind 13. Seitdem Hodengewebe Xenografting hat sich gezeigt, dass bei vielen Arten erfolgreich und entpuppte sich als wertvolle Alternative zu Hodenentwicklung und Spermatogenese der großen Tiere bei Mäusen 14 zu studieren.
Protocol
TEIL A. Germ-Transplantation bei Mäusen
1. Herstellung von Empfängermäuse
- Die Empfänger sollten immunologisch tolerant (entweder genetisch an die Spender oder immundefizienten abgestimmt) an die Spender Hoden-Zellen.
- Die Empfänger sollten entweder von Natur aus frei von Spermatogenese (zB W / W v Mäuse) oder abgereichertes endogener Keimzellen. Germ Zell-Depletion kann durch Bestrahlung oder Chemotherapeutika wie Busulfan erreicht werden. In diesem Protokoll beschreiben wir die Verfahren zur Herstellung von Empfängermäuse mit Busulfan.
- Gönnen Empfänger bei 4-6 Wochen alt durch ip-Injektion von Busulfan. Die optimale Dosis von Busulfan ist Belastung abhängig. In häufigsten verwendeten Rezipientenstämme, ist eine Dosis von 40-50 mg / kg ausreichend ist, um endogenen Keimzellen (zB 44 mg / kg für Nacktmäuse, 50 mg / kg für B6/129 F1 Empfänger). Führen
- Pulver auflösen Busulfan in DMSO und fügen Sie dann ein gleiches Volumen an sterilem destilliertem Wasser to tätigt eine abschließende Konzentration von 4 mg / ml. Halten Sie warme Lösung bei 35-40 ° C zu verwenden, um vor Fällung von Busulfan zu vermeiden. Entsorgen Lösung, wenn Niederschläge zu beobachten ist.
- Nach Busulfan Behandlung, mindestens einen Monat vor der Verwendung die Empfänger zu ermöglichen. Die Empfänger können zwischen 1 Monat und 3 Monate nach der Busulfan Behandlung verwendet werden.
2. Herstellung von Mikroinjektion Pipetten
- Wählen Sie Borosilikatglas Pipetten (Kapillarröhrchen) mit einem 1,0 mm Außendurchmesser, einer 0,75 mm Innendurchmesser, und einer Länge von 3 Zoll.
- Silikonisieren Glaspipetten mit Sigmacote gründlich Pipetten mit Methanol und trocken blasen.
- Ziehen Sie die Pipette mit einer Pipette Abzieher. Verschiedene Pipette Abzieher Maschinen haben unterschiedliche Einstellungen, daher ein paar Einstellungen zu testen. Im Allgemeinen kann ein Setting ähnlich dem, dass zur Herstellung Enukleation verwendeten Pipetten arbeiten.
- Brechen Sie die Pipettenspitzen unter Seziermikroskop vor dem Gebrauch auf einen Durchmesser von etwa 50 um zu erreichenan der Spitze.
3. Herstellung von Spenderzellen für die Transplantation
- Choise von Donor-Stamm ist abhängig von der experimentellen Frage und untersucht. Wenn Quantifizierung der Spermatogenese als Endpunkt benutzt wird, muss der Spender mit einem leicht identifizierbaren genetischen Marker wie Lac-Z (zB B6.129S7-Gt (ROSA) 26Sor / J vom Jackson Laboratory) oder GFP (zB C57BL/6-Tg ( CAG-EGFP) 1Osb / J vom Jackson Laboratory).
- Planen Sie 7 ml Collagenase in DMEM bei 1 mg / ml, 4 ml Trypsin-EDTA (0,25% Trypsin zzgl. 1 mM EDTA), und 2 ml DNase in DMEM bei 7 mg / ml. Dieser Betrag ist für die Verdauung von 2 Spender Mäusehoden.
- Sammle Hoden aseptisch und entfernen Sie die Tunica albuginea. Spread-Hodenkanälchen vorsichtig mit einer feinen Pinzette, um enzymatische Verdauung zu erleichtern.
- Transfer-Tubuli in Kollagenase, bei 37 ° C für 5-10 min, und häufig schütteln inkubieren.
- Waschen Sie Tubuli zweimal durch Spinnen (200-300 g für 3 min) und Resuspendieren in PBS w / o Ca 2 + +
- Resuspendieren Tubuli in Trypsin-EDTA und schütteln, bis sie klebrig und trübe geworden. Überwachen Sie die Verdauung von Tubuli bei 37 ° C, da sollte in 1-2 min auftreten.
- Fügen Sie DNase und gut schütteln. Inkubieren Sie für 1-2 min.
- Zusatz von 3 ml FBS, um die Aktion von Enzymen zu stoppen.
- Einschränken Zellsuspension unter Verwendung eines Nylon Netzkappe mit 40-70 &mgr; m Porengröße zu Zelle / Gewebe Brocken zu entfernen.
- Collect-Zellen bei 600 g für 5 min und erneut zu suspendieren Zellen in einem kleinen Menge von DMEM (<100 ul).
- Zählen von Zellen und die Lautstärke auf einen gewünschten Endkonzentration (in der Regel 100 x 10 6). Halten Sie Zellsuspension auf Eis vor der Verwendung.
- Jeder Busulfan-behandelten Maus Hoden wird mit nur 10-15 ul Zellsuspension gefüllt werden. Aufgrund möglicher Abfall-und Auslaufen, zielen darauf ab, 30-50 ul pro Hoden haben.
4. Transplantation Verfahren (Abbildung 1)
- Betäuben Empfänger nach genehmigten Protokollen.
- Platz in RückenlageLiegen und chirurgisch bereiten den Bauchbereich. Machen Sie einen ~ 1cm Mittellinie Bauchschnitt, um die Bauchdecke entlarven. Heben Sie Bauchdecke mit Hilfe von kleinen Zangen an der Stelle der weißen Linie zu vermeiden, versehentlich verletzt Bauchorgane, und fahren Sie mit einem ~ 0,5 cm lange Inzision in der Mittellinie der Bauchwand, die Bauchhöhle aussetzen zu machen.
- Verwenden Sie eine Pinzette, um die Iris Bauchdecke halten, und verwenden Sie ein anderes Paar von Iris Zange für die Fettpolster an den Nebenhoden und Hoden in der Bauchhöhle zu suchen. Ziehen Sie das Fettpolster heraus, bis der Hoden wird entäußert und die Hoden und Nebenhoden Arterie sind deutlich sichtbar. Arbeit an einem Hoden auf einmal.
- Legen Sie eine dünne sterile Abdeckung von autoklavierten Karteikarten unter dem Fettpolster / Hoden für eine bessere visuelle Identifizierung (optional) gemacht. Der Faltenwurf funktioniert auch, um Flüssigkeit zu absorbieren.
- Einen Tropfen Trypanblau in die Zellsuspension vorsichtig und laden Sie die Zellsuspension in das Polyethylenlene einen Schlauch mit einer 1 ml Spritze verbunden ist. Befestigen Sie die gezogen Pipette in der Rohrleitung und sanft zwingen die Zelle Suspension in der Pipette durch Aufbringen von Druck auf die Spritze auf.
- Identifizieren Sie die Ausführungsgänge (die die Hoden auf den Nebenhoden verbinden) und entfernen Sie vorsichtig Fettgewebe rund um die Kanäle. Arbeiten Sie sorgfältig, wie die Kanäle und die Membran um sie durchscheinend sind.
- Stecken Sie vorsichtig mit der Pipette in einen Kanal im Bündel Ausführungsgänge, sanft fädeln einige mm in Richtung der Hoden.
- Während Vermeidung von bewegten die Injektionspipette, für die Spritze zu erreichen, sanft drücken Sie den Kolben der Spritze um sicherzustellen, dass die Suspension in den Rete testis und Tubuli seminiferi strömt anfangen zu füllen.
- Die Injektionsrate und den Fluss von Zellsuspension wird mit dem Daumen Druck reguliert wird. Vermeiden Sie plötzliche Erhöhung des Drucks; Kontrolle der Beförderung Suspension in Tubuli.
- Stoppen Sie die Injektion wenn fast alle Oberflächen Tubuli gefüllt wurden, bevor die Hoden beginnt become ischämischen.
- Bringen Sie den Hoden in die Bauchhöhle. Wiederholen Sie den Vorgang auf der kontralateralen Hoden. Nähen Sie die Bauchdecke mit 6-0 Seidenfaden und schließen Sie die Haut mit Metall Wundklammern. Überwachen Mäuse auf einem Pad Erwärmung bis zur vollständigen Genesung.
5. Die Analyse der Empfänger Hoden
- Erlauben Sie 2-4 Monate nach der Transplantation vor der Analyse.
- Einschläfern den Empfänger Maus nach Tier in Pflege und Gebrauch Richtlinien und sammeln die Hoden und Nebenhoden in PBS. Wenn ein Lac-Z-transgenen Donor-Stamm verwendet worden ist, kann der Nebenhoden als positive Färbung Kontrolle verwendet werden, da es endogene Beta-Galactosidase-Aktivität aufweist.
- Für den Nachweis von Spenderzellen durch Lac-Z-Färbung, beheben den Hoden für 1-2 Stunde bei 4 ° C in 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS. Spülen Sie 3 x 30 min bei Raumtemperatur in lacZ Pufferspülgang.
- Inkubieren über Nacht bei 37 ° C in LacZ-Färbung Lösung. Hoden kann als Ganzes oder nach dem Dispergieren gefärbt werdendie Tubuli.
- Fix und lagern in 10% neutral gepuffertem Formalin. Sofern Teile benötigt werden, verwenden neutrale schnell rot als Gegenfärbung.
TEIL B. ektopische Xenografting bei Mäusen
(Von Dobrinski und Rathi 2008 15, und Rodriguez-Sosa et al. 2011 16).
1. Sammlung von Spendergewebe
- Erhalten Hodengewebe durch Kastration oder Biopsie von einem Spender männlich.
- Ort Hoden in PBS oder Biopsien in Kulturmedium, die Aufrechterhaltung sterilen Bedingungen.
- Halten Sie das gesammelte Gewebe auf Eis und Transport ins Labor.
2. Herstellung von Spendergewebe
- Führen Sie in der Gewebekulturabzug zur Aufrechterhaltung der Sterilität.
- Waschen Sie jeden Hoden in eiskaltem PBS mit Antibiotika zwei bis drei Mal vor der Übertragung in eine Kultur-Schale mit PBS. Im Falle von Biopsien, waschen Hoden Fragmente zwei-bis dreimal mit eiskaltem Kultur medium die Antibiotika enthalten, durch Drehen bei 150g für 2 min und Resuspendieren in frischem eiskaltem Kulturmedium.
- Für intakte Hoden entfernen Tunica vaginalis durch einen Einschnitt entlang der Oberfläche und extrudieren die Hoden. Entfernen von Hoden aller Anhang Strukturen (Samenstrang, Nebenhoden, Bindegewebe). Waschen Hoden einmal in kaltem PBS und Überführung in eine Kultur-Schale mit PBS.
- Entfernen Sie vorsichtig die Tunica albuginea des Hodens mit einem Skalpell und eine Schere. Wenn der Hoden sehr klein ist, kann die Tunica durch Zusammendrücken des Hodengewebe Stelle von der Tunica durch einen kleinen Einschnitt verfügt am einen Ende, während die Tunica mit einem Paar von kleinen Pinzette am anderen Ende entfernt werden.
- Je nach Größe des Hodens entweder die gesamte Hodengewebe können in kleine Stücke von der Umgebung von 1 zugeschnitten - 2 mm 3 in der Größe unter Verwendung einer gebogenen Pinzette und ein Skalpell-Klinge, oder große Stücke von Hodengewebe kann zunächst aus dem Hoden entfernt werden und dann schneiden in kleinereStück. All dies sollte in eiskaltem Kulturmedium und unter sterilen Bedingungen in einem kleinen Kulturschale (60 x15 mm) erfolgen.
- Übertragen Sie die vorbereiteten Gewebestücke zu eiskaltem Kulturmedium in kleinen Kultur-Gerichte auf Eis, bis Pfropfen.
3. Kastration von Empfängermaus
- Betäuben Maus wie oben vorbereiten und sterile OP-Feld durch Schneiden der Haare (nicht notwendig in Nacktmäusen), Abreiben mit 70% Ethanol und Betadine Lösung.
- Machen Sie einen 0,5 -1 cm ventralen Mittellinie Hautschnitt, um die Bauchdecke entlarven.
- Sorgfältig Setzen Sie den Hoden, die Hoden und Nebenhoden Arterie wie in TeilA, 4,2-4,3 beschrieben.
- Nehmen Sie den Schwanz der epidydimis aus dem Gubernaculum durch stumpfe Präparation.
- Ligieren der A. testicularis und der Samenleiter gemeinsam mit dem Blutgefäß mit Seide, und Abschnitt die ligierten Strukturen durch Schneiden zwischen den Hoden und der Ligatur.
- Wiederholen Sie den Vorgang für das secoND Hoden.
- Nähen Sie die Bauchdecke mit einem oder zwei chirurgischen Nähten.
- Schließen Sie den Hautschnitt mit einem oder zwei Michel-Clips.
4. Ektopische Xenografting
- Positionieren Sie die Maus im ventralen Liegen und bereiten einen sterilen OP-Feld auf dem Rücken wie oben.
- Je nachdem wie viele Transplantate werden ausschliesslich zum eingefügt (in der Regel 4-8/mouse) werden, machen ~ 0,5 cm lange Hautschnitte auf jeder Seite der Mittellinie der Rückseite der Maus.
- Verwenden einer Pinzette, um einen Rand der Hautschnitt zu halten, und machen einen Hohlraum, der durch subkutane Hänseleien auseinander das Bindegewebe mit einer Schere.
- Mit Hilfe einer Pinzette Iris Ort ein Stück Hodengewebe tief in das subkutane Hohlraum, hält die Grenze der Hautschnitt mit einem anderen Iris Zange.
- Schließen Sie den Hautschnitt mit einem Michel-Clip und halten der Maus auf Heizkissen, bis er aus der Narkose zu erholen beginnt.
- Übertragen Sie die Maus an einem Käfig mit zusätzlicher Dämmung und CoVer-und Monitor, bis Mäuse werden vollständig erholt.
5. Sammlung von Hoden Xenotransplantate für Analyse-und Samenzellen der Ernte
- Einschläfern den Host-Maus nach Tierpflege und Leitlinien für die Verwendung, und machen eine Mittellinie Hautschnitt an der Rückseite der Haut ab dem Schwanz an den Hals und offene Haut. Dies macht die Transplantate, die entweder auf dem subkutanen Gewebe lokalisiert werden kann oder an der Haut befestigt.
- Entfernen Sie vorsichtig die Transplantate unter Verwendung eines Paares Zange und eine Schere.
- Rekordzahl von Transplantaten erholt, Größe und Gewicht der einzelnen Transplantate.
- Herumführen Samenblasen aus dem Bauch der Maus und aufzeichnen ihr Gewicht als Hinweis auf Testosteron-Produktion durch die transplantierten Gewebes.
- Für die histologische Analyse
- Suspend-Xenotransplantaten in Probenfläschchen mit Bouin-Lösung (oder andere Fixativ) in einem Volumen ~~~V dass der Xenograft-10x, und Etikett Fläschchen angemessen.
- Bebrütenüber Nacht im Kühlschrank durch Waschen mindestens 3-mal in 70% Ethanol in Abständen von 24 Stunden vorzugsweise gefolgt.
- Gehen Sie für die Bearbeitung und Einbettung in Paraffin.
- Für Spermien Ernte
- Waschen Sie Xenotransplantate durch Spinnen sie sich an 300g für 1 min und Resuspendieren sie in Kulturmedium mit Antibiotika enthielt.
- Schneiden Sie Transplantate in kleine Stücke hacken und vorsichtig mit der Pinzette in einem Gewebe Kulturschale mit 3 bis 5 ml Kulturmedium.
- Filter zerkleinerte Gewebe durch die Zelle 40 um Sieb.
TEIL C. repräsentative Ergebnisse
1. Germ-Transplantation
Wenn die transplantierten Spender-Zell-Suspension enthält Stammsamenzellen Tragen eines genetischen Markers wie des LacZ-Transgen, Kolonisierung der Spender SSCs in den Empfängerländern Hoden kann durch X-gal-Färbung sichtbar gemacht, wie markanten blauen Segmente des SEMiniferous Tubuli nach 2-3 Monate nach der Transplantation 3 (Abbildung 2A). Eine gut etablierte Kolonie sollte eine lange dunkelblaue Strecke komplett gefüllt Segmente mit zwei oder mehr Schichten von blauen Zellen näher an das Zentrum, und relativ schwächer gefärbte Bereiche an beiden Enden haben, wo ein Netzwerk von einzelnen, gepaart oder kleine Gruppen von blauen Zellen ist ersichtlich, 3 (Abbildung 2B). Ein Querschnitt des dunkelblauen Samenkanälchens Region zeigen sollte, gut etablierte und gut organisierte Spermatogenese mit blauen Keimzellen in verschiedenen Stadien Differenzierung (Abbildung 2C).
2. Hodengewebe Xenografting
Die Lebensfähigkeit der Hodengewebe nach der Transplantation ist invers mit der Entwicklungsstufe des Spenders korreliert; das beste Ergebnis wird erzielt, wenn Gewebe von männlichen Neugeborenen verwendet wird, während die adulten Gewebe zeigt eine hohe Tendenz zu degenerieren und sterben 17-21. Im allgemeinen nimmt Xenograft Erfolg als Spendergewebe durchläuft michiosis von der ersten Welle der Spermatogenese. Zeit bis zur vollen Entwicklung der unreifen Spendergewebe und komplette Spermatogenese ist artspezifisch, und oft etwas kürzer im Vergleich mit Hoden in situ. Die Zahl der Hodenkanälchen mit vollständiger Spermatogenese ist variabel je nach Tierart. Während bei Schafen, Ziegen und Schweine, dass Teilnummer größer als 50% ist, in Rinder und Katzen ist es weniger als 15% 14 (Abbildung 3).
Abbildung 1. Keimzelle Transplantation Verfahren. Platz Empfänger in Rückenlage nach der Narkose und eine ~ 0,4-Zoll-Mittellinie Bauchschnitt (A). Expose Hoden durch die Rücknahme des Fettpolster an den Nebenhoden und Hoden und legen Sie eine dünne sterile Abdeckung unterhalb des Fettpolster / Hoden für eine bessere visuelle Identifizierung (B). Positionieren Sie den Hoden und Nebenhoden, so dass die Ausführungsgänge in das Fettpolster begraben erkennbar sind (C, D, E). IdentifikationUnternehmen die Ausführungsgänge und entfernen Sie vorsichtig Fettgewebe rund um die Kanäle. Ein Stück farbiges Papier oder Kunststoff können unter die Kanäle für eine bessere Visualisierung (G) abgegeben werden. Break oder schleifen die Pipettenspitze nach Anspruch der hat eine Größe von den Kanälen und Last Zellsuspension in die Pipette (H). Stecken Sie vorsichtig mit der Pipette in einen Kanal im Bündel Ausführungsgänge, sanft fädeln einige mm in Richtung der Hoden (der Pfeil in H zeigt die Richtung der Pipette Injektion und Gewindeschneiden). Ein Hoden mit erfolgreichen Injektion in den Samenleiter wird (I) gezeigt. Ts: Hoden, EP: Nebenhoden.
Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse für Keimzell-Transplantation A) einen injiziert Testis mit X-gal gefärbt. Die blauen Segmente der Samenleiter darstellen etablierten Kolonien aus transgenen Spenders SSCs (LacZ-Transgen). B) Stärkere Vergrößerung eines SSC Kolonie 3 Monate nach der Transplantation. The dunkelblau Region in der Mitte stellt komplette Spermatogenese und die hellblauen Regionen an den Enden repräsentieren wachsenden Ausdehnung der Kolonie. C) einem histologischen Schnitt des dunkelblauen Samenkanälchens (3 Monate nach der Transplantation) zeigt gut organisiert Spermatogenese. Maßstabsbalken in B und C sind 200 um und 30 um jeweils. (Zahlen aus Annu Rev Cell Dev. Biol. angepasst 2008;. 24:263-86 und Biol Reprod Juni 1999;. 60 (6) :1429-36).
Abbildung 3. Ektopische Xenografting von unreifen Hodengewebe von Großtieren in immundefizienten Mäusen. Fragmente von unreifen Hoden Spender (~ 1 mm 3) unter die Rückenhaut von immundefizienten Mäusen (A) transplantiert werden können, um zu überleben und reagieren auf Maus Gonadotropine. Als ein Ergebnis erfährt Testisgewebe komplette Entwicklung, einschließlich der Bildung der Befruchtung zuständigen Spermien (B). Sobald Hoden Xenotransplantate werden gesammelt (C)sie können für die Analyse oder zu Spermien (D) für ICSI (E) und Embryo-Erzeugungseinheiten (F) zu erhalten verwendet werden. Bars gleich 50 um (B, E und F) oder 10 um (D). (Geändert von Rodriguez-Sosa und Dobrinksi 2009 14).
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Discussion
1. Germ-Transplantation
Keimzell-Transplantation bietet die einzig funktionierende Assay für eindeutige Bestätigung der Gegenwart von spermatogonialen Stammzellen (SSC) in einer Zellpopulation. Nur SSCs können nach Hause zu besiedeln und die SSC-Nische an der Basalmembran und initiieren Donor-derived Spermatogenese. Keimzelle der Transplantation war es möglich, zu studieren und zu manipulieren SSCs in beispielloser Weise. Die Technik wurde genutzt, um transgene Tiere durch genetische Manipulation von SSCs 4 zu erzeugen; um das Muster, Effizienz und Kinetik der SSC Kolonisation 3,8 aufzuklären; um die Signalwege, die SSC Selbsterneuerung und Differenzierung regulieren 9,10 studieren, zu charakterisieren Oberflächenmarker auf SSCs für ihre Identifizierung 22,23;, um die Nische für Umwelt SSCs 6,7,24 studieren. Darüber hinaus hat wechselseitige Transplantation eingesetzt worden, um zu untersuchen, ob ein Phänotyp der infertility stammt aus einem Defekt in Sertoli-Zellen oder in Keimzellen 25,26.
Für die Transplantation effizient zu arbeiten, ist Wahl und Behandlung der Empfängertiere wichtig. Die Empfänger sollten entweder genetisch an die Spender oder immunsupprimierten abgestimmt werden. Die Empfänger sollten fehlt es auch an endogenen Spermatogenese: entweder aufgrund einer Mutation, wie in W / W v Mäuse oder unfruchtbar gemacht als Resultat von Keimbildung Zell-Depletion durch Bestrahlung oder Chemotherapeutika wie Busulfan. Darüber hinaus sind eine gute Vorbereitung von Spender-Zellsuspensionen und Fertigkeiten in der Transplantationsmedizin Verfahren für den Erfolg der Technik als auch wichtig.
Germ-Transplantation hat seine eigenen Grenzen. Es gibt keine schnellen Auslesen für die Ergebnisse. Die Analyse der Empfänger Hoden muss warten Sie mindestens 2 Monate als Wiederherstellung der vollständigen Spermatogenese in den ansonsten unfruchtbaren Empfänger passiert, 2 Monate nach der Transplantation 3. Es isa qualitative oder semi-quantitativen Assay aufgrund zu großen Schwankungen in Zelle Teilnummer injizierten und Grad der Empfänger Keimzell-Suppression. Obwohl das Konzept der Keimzelle der Transplantation hat sich auf andere Tierarten angepasst worden, ist das Verfahren selbst technisch anders und etwas anspruchsvoller in Nicht-Nagetieren als Folge der anatomischen Unterschiede zwischen den Spezies 11.
2. Hodengewebe Xenografting
Hodengewebe Xenografting Arbeiten über viele Säugetier-Arten und Spender ist eine relativ einfache Technik. Wie auch in anderen Arten von Transplantationen, die früher nach der Entnahme wird das Gewebe das größere Chance auf Erfolg transplantiert. Daher ist die Erhaltung und den Umgang mit dem Gewebe von der Abholung bis zur Transplantation wichtig. Allerdings ist nach unserer Erfahrung Hodengewebe keine spezielle Behandlung, die nicht gekühlt aufbewahrt werden. Hodengewebe kann bei Kühlschranktemperatur gehalten werden bis zu 24 bis 36 h,und klicken Sie dann Fragmente können zur Transplantation hergestellt werden. Darüber hinaus können Fragmente von frischen Hoden im Standard-Kulturmedium bei 4 ° C über Nacht vor der Transplantation werden, ohne eine merkliche Wirkung auf das Ergebnis Pfropfen 27 aufrechterhalten. Hodengewebe können auch kryokonserviert, wenn langfristige Lagerung gewünscht wird. Studium der Ziege 13, Schwein 13,27, 28 und Affen haben gezeigt, dass das Einfrieren und spätere Auftauen von Hodengewebe keinen signifikanten Einfluss auf seine Fähigkeit zu entwickeln und zu produzieren Spermien nach ektopischer Xenografting bei Mäusen. Erfolgreiche Kryokonservierung von Hodengewebe können durch automatisierte Gefrierschutzmittel 28 oder konventionellen langsamen Einfrieren in einem Alkohol-Bad 13,27, unter Verwendung von DMSO als Gefrierschutzmittel in Standard-Gewebekultur-Medium mit FBS erreicht werden. Für die Transplantation, wird kryokonservierten Testisgewebe dann durch Standardverfahren aufgetaut und anschließend in Kulturmedium vor der Transplantation 27 gewaschen. Sobald das tisSue wurde transplantiert der Empfänger der Maus dient als eine In-vivo-Inkubator und ohne größere Eingriffe erforderlich sind. Jedoch kann in einigen Fällen ist die Supplementierung mit exogenen Gonadotropinen kann gefordert werden; Hodengewebe aus 6-Monate alten Rhesusaffen erforderlich Einspritzen Empfängermäuse subkutan mit 10 IU hCG zweimal wöchentlich bis auf volle Spermatogenese bei 6-7 Monate 29 zu erreichen.
Wie oben erwähnt, wird das beste Ergebnis erhalten wird, wenn Gewebe von männlichen Neugeborenen verwendet wird. Gewebe aus Männern, in denen postmeiotische Keimzellen vorhanden sind, zeigt eine Tendenz zu degenerieren. Jedoch mit ausgewachsenen Tieren komplette Wiederholung der Hoden Entwicklung möglich ist und hat zahlreiche klinische und wissenschaftliche Anwendungen. In einer klinischen Umgebung, können Hodengewebe Xenografting für Fruchtbarkeit Konservierung verwendet werden, vor allem in unreifen männlichen Samenzellen, in denen Erholung ist keine Option. Kleine Stücke in Form von Biopsien können gesammelt und für die langfristige Lagerung eingefroren werden. Wenn desIRED, können die Fragmente aufgetaut und werden gepfropft in Mäuse 27,28. Eine weitere Alternative ist die Kryokonservierung der Spermien, die aus Xenotransplantate geerntet wird. Mikroinjektion mit Snap-gefrorenen Spermien aus Hoden Schwein Xenotransplantate führte Generation der morphologisch normalen Embryonen, allerdings auf einem niedrigeren Wirkungsgrad im Vergleich zu den Hoden, Nebenhoden oder Ejakulation 27. Nach Gewebe entwickelt hat, kann es zum Ernten von Spermien gesammelt und Sperma können verwendet werden, um Embryonen in vitro 13,16,30 zu erzeugen. Eine Einschränkung hierbei ist jedoch, ist die Tatsache, dass erhaltenen Spermien nicht unterziehen Nebenhoden Reifung und erfordern daher ICSI für die Befruchtung. Daher wird die Verwendung von Xenotransplantat-abgeleiteten Spermien für die Befruchtung, um Arten, bei denen ICSI festgestellt wurde, beschränkt.
In der Forschung ist Hodengewebe Xenografting eine attraktive Alternative zu Hodenentwicklung und Spermatogenese der großen Arten in einem Tiermodell zu studieren. Zum Beispiel kann eineinzigen Spender Hoden kann an mehrere Mäuse transplantiert werden. Empfängermäuse kann dann auf verschiedene Behandlungen, und / oder zu verschiedenen Zeitpunkten für Xenograft Sammlung geopfert ausgesetzt werden. Das erspart nicht nur Geber-Effekte, sondern reduziert auch die Zahl der großen Männer für ein bestimmtes Experiment oder Studien erforderlich. Dies ist besonders wichtig bei großen Tieren, wo zahlreiche Studien, bei denen Männchen sind logistisch schwierig und teuer, und kann ethische Einschränkungen führen, insbesondere bei Primaten. Allerdings sind Anwendungen von Hodengewebe Xenografting als Manipulation von spezifischen Zelltypen beschränkt vor der Transplantation ist nicht leicht möglich und Effizienz der Spermatogenese ist in bestimmten Donorspezies 14 niedrig.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Arbeiten Sie auf der Autoren Labor wurde von USDA / CSREES / NRICGP (2007-35203-18213) unterstützt worden; NIH / NCRR (2 RR17359 R01-06), NIH / NIEHS (1 R21 ES014856-01A2) und Alberta Innovates - Health Solutions.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase (type IV) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| DNaseI | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| DMEM | Invitrogen | 31053-028 | |
| Trypan blue stain | Invitrogen | 15250-061 | |
| Nylon mesh cell strainer | BD Biosciences | 352340 (40µm) 352350 (70µm) | |
| Busulfan | Sigma-Aldrich | B2635 | |
| Thin-Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW 100-3 | |
| BD intramedic plyethylene tubing (PE100) | BD Biosciences | CA-63018-725 | |
| Ethicon 6-0 Silk Suture | Ethicon Inc. | 706G | |
| Wound clips | BD Biosciences | 427631 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma-Aldrich | P3667 | |
| magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 208337 | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | 18896 |
References
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