Summary
Protokoll för könsceller transplantation och testiklar xenografting vävnad beskrivs. Könsceller transplantation resultat i givar-derived spermatogenes i mottagarländerna testiklar och representerar en funktionell beredning analys för identifiering av spermatogonial stamceller (SSC). Testikel vävnaden xenografting återger testiklar utveckling och spermatogenes av olika givare arter i mottagande möss.
Abstract
Könscell transplantation har utvecklats av Dr Ralph Brinster och kollegor vid University of Pennsylvania i 1994 1,2. Dessa banbrytande studier visade att mikroinjektion av könsceller från bördiga donatormöss i sädeskanalerna av alla infertila mottagande möss resulterar i givaren härlett spermatogenes och spermieproduktion av mottagaren djuret 2. Användningen av donatordjur bär den bakteriella β-galaktosidasgenen möjliggjorde identifiering av givare härrörande spermatogenes och överföring av givare haplotypen till avkomman med mottagande djur 1. Helt överraskande, efter transplantation in i lumen av sädeskanalernas tubuli, voro transplanterade könscellerna kunna röra sig från den luminala avdelningen till den källaren membranet där spermatogonier är belägna 3. Det är allmänt godtas att förordningen enbart SSC: er är i stånd att kolonisera den nisch-och återupprätta spermatogenesen hos de mottagande testikel. Därför könscelltransplantation ger ett funktionellt synsätt för att studera den nisch stamceller i testiklarna och för att karakterisera förmodade spermatogonial stamceller. Till datum, är grodden celltransplantation användas för att belysa grundläggande biologi stamcell, att producera transgena djur igenom genetisk manipulering av könsceller före transplantation 4,5, för att studera Sertolicellen-grodden cell-interaktion 6,7, Rymdbolaget homing och kolonisering 3, 8, samt SSC självförnyelse och differentiering 9,10.
Könscell transplantation är också möjligt i stora arter 11. I dessa är de huvudsakliga användningsområdena är bevarandet av fertilitet, spridning av elit genetik i djurpopulationer, och generering av transgena djur som studiet av spermatogenes och SSC biologi med denna teknik är logistiskt svårare och dyrare än hos gnagare. Transplantation av könsceller från stora arter i sädeskanalerna av möss leder till colonization av donerade celler och spermatogonial expansion, men inte i sin fulla differentiering förmodligen på grund av inkompatibilitet mellan mottagaren somatiska cellen fack med könscellerna från fylogenetiskt avlägsna arter 12. Ett alternativt tillvägagångssätt är transplantation av könsceller från stora arter tillsammans med sin omgivning somatisk avdelning. Vi rapporterade först i 2002, att små fragment av testiklarna vävnad från omogna män transplanterade under dorsal huden immundefekta möss kan överleva och genomgå en fullständig utveckling med produktion av befruktning kompetent sperma 13. Sedan dess har testiklarna vävnad xenografting har visat sig vara framgångsrik i många arter och framträdde som ett värdefullt alternativ för att studera testiklar utveckling och spermatogenes av stora djur i möss 14.
Protocol
DEL A. könsceller transplantation hos möss
1. Beredning av mottagande möss
- Mottagarna ska vara immunologiskt toleranta (antingen genetiskt anpassade till givare eller immunbrist) till cellerna donator testiklar.
- Mottagarna ska antingen vara naturligt saknar spermatogenesen (t.ex. W / W v möss) eller utarmat av endogena könsceller. Hos könsceller utarmning kan uppnås genom att bestrålning eller kemoterapeutiska droger såsom Busulfan. I detta protokoll, beskriver vi metod för framställning av mottagande möss med busulfan.
- Behandla mottagare på 4-6 veckor ålder genom ip injektion av busulfan. Den optimala dosen av Busulfan är-stam beroende av. I vanligen använda mottagarländerna-stammar, är en dos av 40-50 mg / kg tillräcklig för att utarma endogena könsceller (t.ex. 44 mg / kg för nakna möss, 50 mg / kg för B6/129 F1-mottagarna).
- Lös Busulfan pulver i DMSO och sedan lägga till en lika stor volym sterilt destillerat vatten to göra en slutlig koncentration av 4 mg / ml. Hålla lösning varm vid 35-40 ° C före användning så att undvika utfällning av busulfan. Kassera lösningen om fällning observeras.
- Efter Busulfanbehandling, att minst en månad innan du använder mottagare. Mottagare kan användas mellan 1 månad och 3 månader efter Busulfan behandling.
2. Beredning av mikroinjektion pipetter
- Välja borsilikat glaspipetter (kapillärrören) med en 1,0 mm ytterdiameter, en 0,75 mm inre diameter, och en längd av 3 inches.
- Siliconize glaspipetter med Sigmacote, skölj pipetter med metanol och föna.
- Dra pipetterna med en pipett avdragare. Olika pipetten kläpp maskiner har olika inställningar, därför testa några inställningar. I allmänhet, får en inställning som liknar det som används för framställning av enucleation pipetter arbeta.
- Bryta de pipettspetsarna inom ramen dissekerande mikroskop före användning för att uppnå en diameter av ungefär 50 | imvid spetsen.
3. Beredning av givarceller för transplantation
- Val av givare stammen är beroende av den studerade experimentella frågan. Om så kvantifiering av spermatogenesen används som endpointen, använd för långivare med en lätt identifierbar genetisk markör såsom till Lac-Z-(t.ex. B6.129S7-Gt (ROSAs) 26Sor / J från Jackson Laboratory) eller GFP (t.ex. C57BL/6-Tg ( CAG-EGFP-) 1Osb / J från Jackson Laboratory).
- Förbereda 7 ml av kollagenas i DMEM vid 1 mg / ml, 4 ml av trypsin-EDTA-(0,25% trypsin plus 1 mM EDTA), och 2 ml av DNas i DMEM vid 7 mg / ml. Denna mängd är för att smälta 2 testiklar givare mus.
- Samla testiklar aseptiskt och ta bort tunica albuginea. Spread sädeskanalerna försiktigt med fin pincett för att underlätta enzymatisk nedbrytning.
- Överföringsavgifterna tubuli in i kollagenas, inkubera vid 37 ° C under 5-10 min, och skaka kraftigt hela ofta.
- Tvätta tubuli två gånger genom spinning (200-300 g under 3 min) och på nytt-suspenderande i PBS w / o-Ca-2 + +
- Återsuspendera tubuli i trypsin-EDTA och skaka tills de blir klibbiga och grumlig. Övervaka den digestion av tubuli vid 37 ° C så som det ska inträffa inom 1-2 minuter.
- Lägg DNas och skaka väl. Inkubera i 1-2 min.
- Tillsätt 3 ml av FBS för att stoppa inverkan av enzymer.
- Filtret cellsuspension med användning av en nylon-mesh med 40-70 | im porstorlek för att ta bort celler / vävnader bitar.
- Samla in celler vid 600 g under 5 min och på nytt-tillfälligt avbrytande av celler i en liten mängd av DMEM (<100 il).
- Räkna celler och justera volymen till önskad slutlig koncentration (vanligen 100 x 10 6). Hålla cell-suspension på is före användning.
- Varje Busulfan-behandlade mus testiklar kommer att fyllas med endast 10-15 il cellsuspension. På grund av risken avfall och läckage, siktar på att ha 30-50 fil per testikel.
4. Transplantation förfarande (figur 1)
- Söva mottagare efter godkända protokoll.
- Placera i dorsalTILLBAKALUTAD STÄLLNING och kirurgiskt förbereda det abdominala område. Gör en ~ 1 cm mittlinje buksnitt att exponera bukväggen. Lyft bukväggen genom små pincett vid den punkt där den vita linjen för att undvika misstag skada bukorganen och fortsätt att göra en ~ 0,5 cm snitt vid mittlinjen av bukväggen att exponera bukhålan.
- Använda en iris pincett för att hålla bukväggen, och använda ett annat par iris pincett för att söka efter fettkuddarna knutna till bitestiklarna och testiklarna i bukhålan. Dra försiktigt ut fettkudden tills testiklarna är exterioriserades och testikel artären och bitestiklarna är klart synliga. Arbeta framför en testikel vid en gången.
- Placera en tunn steril duk tillverkad av autoklaverade indexkort under fettkudden / testiklar för bättre visuell identifiering (tillval). Den drapering arbetar även att absorbera vätska.
- Tillsätt en droppe av Trypan Blue-färgämne in i cellen suspensionen och försiktigt läsa in den cellsuspensionen in i den polyelene slang ansluten till en 1 ml spruta. Bifoga den drog pipetten in i rör och försiktigt tvinga den cellsuspensionen in i pipetten genom att applicera tryck till sprutan.
- Identifiera efferenta kanalerna (som ansluter testiklarna till epididymis) och ta försiktigt bort fettvävnad runt kanalerna. Arbeta noga när kanalerna och membranet runt dem är genomskinliga.
- Försiktigt in pipetten i en kanal i bunten av efferenta kanaler försiktigt trä några mm mot testiklarna.
- Samtidigt som man undviker att flytta injektionspipetten, nå för sprutan försiktigt trycka kolven i sprutan för att säkerställa att suspensionen strömmar in i rete testis och sädeskanalerna börja fylla.
- Den injektionen betygsätta och flöde av cellsuspension är reglerat genom tummen tryck. Undvik plötslig ökning i tryck, övervaka förflyttningar suspension i tubuli.
- Stoppa injektionen när nästan alla ytor tubuli har fyllts innan testiklarna börjar becOme ischemisk.
- Återgå den testikel för att den abdominala håligheten. Upprepa proceduren på kontralaterala testikeln. Sutur bukväggen med 6-0 silkesutur och stäng huden med clips metall sår. Övervaka möss på en värmande dyna tills full återhämtning.
5. Analys av de mottagande testiklarna
- Låt 2-4 månader efter transplantationen före analys.
- Euthanize mottagaren musen beroende på djuromsorg och riktlinjer användning och samla testiklarna och bitestiklarna in i PBS. När en till Lac-Z-transgen donator-stammen har använts, kan den bitestikeln användas som en positiv färgning-kontroll som den inte har endogen beta-galaktosidas-aktivitet.
- För detektion av givarceller genom att till Lac-Z--färgning, fixa den testikel under 1-2 timme vid 4 ° C i 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS. Skölj 3 x 30 min vid rumstemperatur i lacZ-skölj buffert.
- Inkubera över natten vid 37 ° C i lacZ-färglösningen. Testikel kan färgas i sin helhet eller efter dispergeringtubuli.
- Fixa och lagra i 10% neutral buffrad formalin. Om delar behövs använder neutralt snabbt röd som motfärgning.
DEL B. Ektopisk xenografting i möss
(Från Dobrinski-och Rathi 2008 15, och Rodriguez-Sosa m.fl.. 2011 16).
1. Insamling av donatorvävnad
- Skaffa testiklarna vävnad genom kastrering eller biopsi från en donator hane.
- Placera testis i PBS eller biopsier i odlingsmedium, upprätthålla sterila förhållanden.
- Håll in vävnaden på is och transport till laboratoriet.
2. Beredning av donatorvävnad
- Prestera i den vävnad kulturen huv för att upprätthålla sterilitet.
- Tvätta varje testikel i is-kall PBS innehållande antibiotika två till tre gånger innan överföring till en kultur-skålen med PBS. I fallet med biopsier, tvätta testikel fragment två till tre gånger med iskall kulturen Medium innehållande antibiotika genom spinning vid 150g för 2 min och återsuspendering i färskt is-kallt odlingsmedium.
- För intakta testiklar, ta bort tunica vaginalis genom att göra ett snitt längs med ytan och pressa testiklarna. Ta bort från testikel alla bilaga strukturer (sädesledare, epididymis, bindväv). Tvätta testiklar gång i kall PBS och överför till en kultur-skålen med PBS.
- Tag försiktigt bort den Tunica albuginea av det testikel genom att använda ett skalpellblad och en par av sax. Om den testikel är mycket liten, kan tunica tas bort genom att klämma den testikulär vävnaden ut ur av tunica genom ett litet snitt gjord på ena änden medan du håller tunica med en par av små peang på den andra änden.
- Beroende på storleken av det testikel antingen hela testikeln vävnaden kan skäras upp i små bitar av runt 1 - 2 mm 3 i storlek med användning av krökta pincett och en skalpell blade, eller stora bitar av testikel vävnad kan 1:a tas bort från testikel och sedan skuren i mindrestycken. Allt detta bör ske i iskallt odlingsmedium och under sterila förhållanden i en liten odlingsskål (60 x15 mm).
- Överför förberedda vävnadsfragment till iskall odlingsmedium i små odling-rätter på is tills ympning.
3. Kastrering av mottagarens mus
- Söva ner mus såsom ovan och förbereda sterilt kirurgiska området genom att klippa den håret (inte nödvändigt i nakna möss), avtorkning med 70% Etanol och Betadine-lösning.
- Gör en 0,5 -1 cm ventral mittlinje snitt i huden för att exponera bukväggen.
- Försiktigt exponera testiklarna, den testikel artären och bitestiklar som beskrivs i PARTA, 4,2-4,3.
- Lossa svansen av bitestikel från gubernaculum genom trubbig dissektion.
- Ligera testikel artären och vas deferens tillsammans med blodkärlet med siden, och avsnitt de ligerade strukturer genom att skära mellan testiklarna och ligaturen.
- Upprepa proceduren för Second testis.
- Suturera den abdominala vägg med en eller två kirurgiska stygn.
- Stänga den huden incisionen med en eller två Michel klippen.
4. Ektopisk xenografting
- Placera musen i ventrala VILA och förbereda ett sterilt kirurgiskt fält på ryggen som ovan.
- Beroende på hur många transplantaten är som ska infogas (i allmänhet 4-8/mouse), göra ~ 0,5 cm långa hud snitt på varje sida av den mitten linje av baksidan av den musen.
- Använd pincett för att hålla en gräns av huden snittet, och gör en subkutan hålighet som retas isär bindväven med sax.
- Använda en iris pincett ställe en bit testikel vävnad djupt in i subkutana hålrummet och håller gränsen av huden snittet med en annan iris pincett.
- Stäng huden snitt med en Michel klämma och hålla musen på värmedyna tills den börjar återhämta sig från anestesi.
- Överför musen till en bur med tilläggsisolering och samarbetever och bildskärmen tills möss återhämtat sig helt.
5. Insamling av testikel xenografter för analys och spermier skörd
- Euthanize värdmusen enligt djurets vård och riktlinjer använder, och gör en mittlinje hudsnitt på ryggen huden löper från svansen till halsen och öppna hud. Den här exponerar de transplantaten som kan vara belägna antingen på den subkutana vävnaden eller fäst till huden.
- Tag försiktigt bort de transplantaten som använder en pair pincett och ett par sax.
- Rekordmånga transplantat återvinns, storlek och vikt de enskilda transplantat.
- Hämta sädesblåsorna från buken av musen och registrera deras vikt som en indikation av testosteron produktion av den transplanterade vävnaden.
- För histologisk analys
- Tillfälligt upphäva xenografter in i prov som ampull innehållande Bouins-lösning (eller annan fixativ) i en volym på ~ för 10x den hos den xenotransplantatet, och etiketten injektionsflaska på lämpligt sätt.
- Inkuberaöver natten i kylskåp följt av tvättning minst 3 gånger i 70% etanol vid intervaller av 24 timmar företrädesvis.
- Fortsätt för bearbetning och inbäddning i paraffin.
- För spermier skörd
- Tvätta xenografter genom spinning av dem vid en 300g för 1 min och återsuspendera dem i odlingsmedium innehållande antibiotika.
- Skärs grafter i små bitar och skrädde omsorgsfullt den med pincetten i en vävnads odlingsskål innehållande 3 - 5 ml av odlingsmedium.
- Filtrera malet vävnad genom 40 m cellfilter.
DEL C. Representativa resultat
1. Germ celltransplantation
Om så det transplanterade donatorcellen suspension innehåller spermatogonial stamceller celler som bär en genetisk markör såsom den LacZ-transgenen, kolonisering av donerande SSC: er i de mottagande testikeln kan visualiseras genom X-gal--färgning som distinkta blåa segmenten på den seminiferous tubuli efter att ha 2-3 månad tidiga post-operativa 3 (Figur 2A). En väl etablerad koloni ska ha en lång mörkblå sträcka av helt fyllda segment med två eller flera skikt av blå celler närmare centrum, och relativt svagare regioner färgade i båda ändar där ett nätverk av enstaka parade, eller små grupper av blå celler är skenbar 3 (figur 2B). Ett tvärsnitt av den mörkblå sädeskanalens tubuli regionen bör avslöja väl etablerade och välorganiserade spermatogenesen med blå könsceller vid olika differentiering stadier (Figur 2C).
2. Testis vävnad xenografting
Den livskraft testiklar vävnad efter transplantation omvänt korrelerad med utvecklingsstadiet av givaren, det bästa resultatet uppnås när vävnad från nyfödda hanar används, medan vuxen vävnad uppvisar en hög tendens att urarta och dö 17-21. Generellt minskar xenotransplantat framgång som donatorvävnad genomgår migiosis av den första vågen av spermatogenesen. Tid till full utveckling av omogna donatorvävnad och fullständig spermatogenesen är artspecifik, och ofta något kortare jämfört med testiklar på plats. Antalet sädeskanalerna med fullständig spermatogenesen varierar beroende på art. Även i får, getter och grisar det antalet är större än 50%, hos nötkreatur och katter är det mindre än 15% 14 (Figur 3).
Klura 1. Könsceller transplantation förfarande. Placera mottagare i ryggen VILA efter anestesi och gör en ~ 0,4-tums mittlinje buken snitt (A). Exponera testiklar genom att dra fettkudden ansluten till bitestiklarna och testiklarna och placera en tunn steril duk under fettkudden / testiklar för bättre visuell identifiering (B). Positionera den testikel-och bitestikeln, så att de efferenta trummorna begravda i det fett dynan är urskiljningsbart (C, D, E). -Idenhet de efferenta kanalerna och ta försiktigt bort fettvävnad runt kanalerna. En bit färgat papper eller plast kan placeras under kanalerna för bättre visualisering (G). Gå sönder eller slipa den pipettspetsen i enlighet med storleken av de ledningar och lastcell suspension in i den pipett (H). Försiktigt in pipetten i en kanal i bunten av efferenta kanaler försiktigt trä några mm mot testiklarna (pilen i H visar riktningen för pipetten injektion och gängning). En testikel med framgångsrik injektion i sädeskanalerna visas (I). TS: Testikel; Ep: epididymis.
Siffra 2. Representativa resultat könsceller transplantation A) En injicerade testiklar färgats med X-gal. De blå segmenten av sädeskanalerna representerar etablerade kolonier från transgena givare SSC (LacZ transgen). B) Högre förstoringsgrad av ett SSC koloni vid 3 månad efter transplantation. Thett e mörkt blå-regionen i centrum representerar komplett spermatogenesen och de bleka blå regioner vid ändarna representerar växande förlängning av den kolonin. C) En histologisk del av mörkblå sädeskanalens tubuli (3 månader efter transplantation) visar välorganiserad spermatogenesen. Skala barer i B och C är 200 pm och 30 pm, respektive. (Figurerna anpassad från Ännu Rev Cell-Dev Biol 2008;. 24:263-86 och Biol Reprod 1999 Jun;. 60 (6) :1429-36).
Siffra 3. Ektopisk xenografting av omogna testiklar vävnad från stora djur till immundefekta möss. Fragment av omogna givare testikeln (~ 1 mm 3) transplanteras under dorsal huden immundefekta möss (A) kunna överleva och svara på mus gonadotropiner. Som ett resultat genomgår testiklarna vävnad komplett utveckling, inklusive bildandet av befruktning kompetent sperma (B). När testikel xenografter samlas (C)de kan användas för analys eller för att erhålla spermier (D) för ICSI (E) och embryo produktion (F). Barer lika stora 50 ^ m (B, E och F) eller 10 xm (D). (Modifierad från Rodriguez-Sosa och Dobrinksi 2009 14).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1. Germ celltransplantation
Germ celltransplantation tillhandahåller den enda funktionell-analysen för otvetydig bekräftelse av närvaron av spermatogonial stamceller (SSC: er) i en cellpopulation. Endast SSC kan hem till och kolonisera SSC nisch vid basalmembranet och initiera donator-derived spermatogenesen. Könscell transplantation gjort det möjligt att studera och manipulera SSC på ett aldrig tidigare skådat sätt. Tekniken har använts för att framställa transgena djur genom genetisk manipulation av SSC 4, för att belysa mönstret, effektivitet och kinetik för SSC kolonisering 3,8, för att studera de signalvägar som reglerar SSC självförnyelse och differentiering 9,10, för att karaktärisera ytmarkörer på SSC för deras identifiering 22,23, för att studera den nisch miljö för SSC 6,7,24. Vidare har reciprok transplantationen varit anställd för att undersöka huruvida en fenotyp av infertility kom från en defekt i Sertoli celler eller i könsceller 25,26.
För transplantation ska fungera effektivt, är val och behandling av mottagande djur viktig. Mottagarna bör antingen genetiskt anpassade till givare eller immunsupprimerade. Mottagarna bör också sakna endogena spermatogenesen: antingen på grund av en mutation som i W / W v möss, eller görs infertil som ett resultat av könscell utarmning av strålning eller kemoterapeutiska läkemedel såsom busulfan. För övrigt, en bra förberedelse av suspensioner donator-cell-och kvalifikationsprovningar som i transplantation procedur är viktiga för framgången med den teknik som väl.
Könscell transplantation har sina egna begränsningar. Det finns ingen snabb läs-out för resultat. Analysen av mottagande testiklarna måste vänta minst två månad återupprättande av fullständig spermatogenes i övrigt infertila mottagarna som händer två månader efter transplantation 3. Det jagSA kvalitativ eller semikvantitativ analys på grund av stora variationer i antalet celler injicerade och graden av mottagarens könsceller förtryck. Även om begreppet könsceller transplantation har anpassats till andra djurarter, är själva förfarandet tekniskt annorlunda och lite mer utmanande i icke-gnagare som ett resultat av de anatomiska skillnaderna mellan arter 11.
2. Testis vävnad xenografting
Testis vävnad xenografting produktioner i hela många däggdjurs-donerande arten och är en relativt enkel teknik. Liksom i andra typer av transplantationer, vävnaden ju tidigare efter insamling transplanteras desto större chans att lyckas. Därför är bevarande och hantering av vävnad från insamling till transplantation viktigt. Men enligt vår erfarenhet testiklarna vävnaden inte kräver speciella annan hantering än att förvaras i kyla. Testis vävnad kan upprätthållas vid kylskåpstemperatur upp till 24 till 36 hr,och sedan fragmenten kan framställas för transplantation. Dessutom, kan fragment av färska testikel att bibehållas i standard odlingsmedium vid 4 ° C över natten teknikens transplantationen utan att en märkbar effekt på den ympning utfallet 27. Testikel vävnad kan också kryokonserveras om långtidslagring önskas. Studier utförda i get 13, svin 13,27, och apa 28 har visat att frysning och efterföljande upptining av testiklar vävnad inte påverkar signifikant sin förmåga att utveckla och producera spermier efter ektopisk xenografting hos möss. Framgångsrik kryokonservering av testikel vävnad kan uppnås genom att automatiserad-frysning 28 eller konventionell långsam-frysning i ett alkohol badet 13,27, med användning av DMSO som kryoskyddsmedel i standard vävnadsodlingsmedium innehållande FBS. För transplantation, är kryokonserverad testikel vävnad klicka sedan tinas med hjälp av standardmetoder och tvättades därefter i odlingsmedium före transplantation 27. När tissue har transplanterats det mottagande mus tjänar som en in vivo-inkubator och inga större interventioner är obligatoriska. I vissa fall tillskott med exogena gonadotropiner kan krävas, testiklar vävnad från 6-månader gamla rhesusapor krävs injicera recipientmöss subkutant med 10 IE hCG två gånger i veckan för att uppnå full spermatogenes på 6-7 månader 29.
Såsom nämnts ovan, är den bästa utfallet erhålls när vävnad från nyfödda hanar används. Vävnad från hanar i vilket postmeiotic könsceller är närvarande visar en tendens att degenererad. Men med växande djur helt rekapitulation av testiklarna utveckling är möjlig och har många kliniska och forskningsansökningar. I en klinisk miljö, kan testiklarna vävnad xenografting användas för bevarande av fertilitet, särskilt i omogna män som spermier återvinning är inte ett alternativ. Små bitar i form av biopsier kan samlas in och frysas för långsiktig lagring. När desIRED, kan de fragment skall upptinas och inympade i möss 27,28. En annan alternativ är den kryokonservering av det spermier som skördas från xenotransplantat. Mikroinjektion med snabbfrystes spermier från gris testikel xenografter resulterade i generering av morfologiskt normala embryon, även om en lägre effektivitet i jämförelse med testikel, epididymal eller utlösning sperma 27. Efter vävnad har utvecklats, kan det samlas in för skörd sperma och spermier kan användas för att producera embryon in vitro 13,16,30. En begränsning av detta är dock det faktum att resultatet spermier inte genomgår epididymal mognad och kräver därför ICSI för befruktning. Därför användning av xenograft härledd spermier för befruktning begränsas till arter där ICSI har fastställts.
Inom forskningen är testiklarna vävnad xenografting ett attraktivt alternativ för att studera testiklar utveckling och spermatogenes av stora arter i ett gnagarmodell. Till exempel, ettenda donator testiklar kan transplanteras till flera möss. Mottagande möss kan därefter exponeras på olika behandlingar, och / eller offrade vid olika tidpunkter för xenotransplantatet insamling. Detta inte bara eliminerar givare effekter, men också minskar antalet stora hannar som krävs för en viss experiment eller studier. Detta är särskilt viktigt i stora djur där studier på ett stort antal män är logistiskt svårt och dyrt, och kan bära etiska begränsningar, särskilt i primater. Dock tillämpningar av testikel vävnad xenografting begränsad eftersom manipulation av specifika celltyper före transplantation inte är lätt möjligt och effektivitet spermatogenesen är låg i vissa givare arter 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Arbete från författarna laboratoriet har fått stöd av USDA / CSREES / NRICGP (2007-35203-18213) NIH / NCRR (2 R01 RR17359-06), NIH / NIEHS (1 R21 ES014856-01A2) och Alberta innovativt - Health Solutions.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase (type IV) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| DNaseI | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| DMEM | Invitrogen | 31053-028 | |
| Trypan blue stain | Invitrogen | 15250-061 | |
| Nylon mesh cell strainer | BD Biosciences | 352340 (40µm) 352350 (70µm) | |
| Busulfan | Sigma-Aldrich | B2635 | |
| Thin-Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW 100-3 | |
| BD intramedic plyethylene tubing (PE100) | BD Biosciences | CA-63018-725 | |
| Ethicon 6-0 Silk Suture | Ethicon Inc. | 706G | |
| Wound clips | BD Biosciences | 427631 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma-Aldrich | P3667 | |
| magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 208337 | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | 18896 |
References
- Brinster, R. L., Avarbock, M. R. Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (24), 11303-11303 (1994).
- Brinster, R. L., Zimmermann, J. W. Spermatogenesis following male germ-cell transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (24), 11298-11298 (1994).
- Nagano, M., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Pattern and kinetics of mouse donor spermatogonial stem cell colonization in recipient testes. Biology of Reproduction. 60 (6), 1429-1429 (1999).
- Nagano, M., Brinster, C. J., Orwig, K. E. Transgenic mice produced by retroviral transduction of male germ-line stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (23), 13090-13090 (2001).
- Ryu, B. Y., Orwig, K. E., Oatley, J. M. Efficient generation of transgenic rats through the male germline using lentiviral transduction and transplantation of spermatogonial stem cells. Journal of Andrology. 28 (2), 353-353 (2007).
- Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C. Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche. Cell Cycle. 5 (11), 1164-1164 (2006).
- Oatley, M. J., Racicot, K. E., Oatley, J. M. Sertoli cells dictate spermatogonial stem cell niches in the mouse testis. Biology of Reproduction. 84 (4), 639-639 (2011).
- Nagano, M. C. Homing efficiency and proliferation kinetics of male germ line stem cells following transplantation in mice. Biology of Reproduction. 69 (2), 701-701 (2003).
- Kubota, H., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Growth factors essential for self-renewal and expansion of mouse spermatogonial stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (47), 16489-16489 (2004).
- Oatley, J. M., Avarbock, M. R., Telaranta, A. I. Identifying genes important for spermatogonial stem cell self-renewal and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (25), 9524-9524 (2006).
- Dobrinski, I. Germ cell transplantation and testis tissue xenografting in domestic animals. Animal Reproduction Science. 89 (1-4), 137-137 (2005).
- Dobrinski, I., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Transplantation of germ cells from rabbits and dogs into mouse testes. Biology of Reproduction. 61 (5), 1331-1331 (1999).
- Honaramooz, A., Snedaker, A., Boiani, M. Sperm from neonatal mammalian testes grafted in mice. Nature. 418 (6899), 778-778 (2002).
- Rodriguez-Sosa, J. R., Dobrinski, I. Recent developments in testis tissue xenografting. Reproduction. 138 (2), 187-187 (2009).
- Dobrinski, I., Rathi, R. Ectopic grafting of mammalian testis tissue into mouse hosts. Methods in Molecular Biology. 139, Clifton, N.J. 450-450 (2008).
- Rodriguez-Sosa, J. R., Schlatt, S., Dobrinski, I. Testicular tissue transplantation for fertility preservation. Fertility Preservation: Emerging Technologies and Clinical Applications. Seli, E., Agarwal, A. , Springer. New York, NY. 331-331 (2011).
- Rathi, R., Honaramooz, A., Zeng, W. Germ cell fate and seminiferous tubule development in bovine testis xenografts. Reproduction. 130 (6), 923-923 (2005).
- Rathi, R., Honaramooz, A., Zeng, W. Germ cell development in equine testis tissue xenografted into mice. Reproduction. 131 (6), 1091-1091 (2006).
- Kim, Y., Selvaraj, V., Pukazhenthi, B. Effect of donor age on success of spermatogenesis in feline testis xenografts. Reproduction, Fertility, and Development. 19 (7), 869-869 (2007).
- Arregui, L., Rathi, R., Zeng, W. Xenografting of adult mammalian testis tissue. Animal Reproduction Science. 106 (1-2), 65-65 (2008).
- Schlatt, S., Honaramooz, A., Ehmcke, J. Limited survival of adult human testicular tissue as ectopic xenograft. Human Reproduction. 21 (2), 384-384 (2006).
- Shinohara, T., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. beta1- and alpha6-integrin are surface markers on mouse spermatogonial stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5504-5504 (1999).
- Kanatsu-Shinohara, M., Toyokuni, S., Shinohara, T. CD9 is a surface marker on mouse and rat male germline stem cells. Biology of Reproduction. 70 (1), 70-70 (2004).
- Ryu, B. Y., Orwig, K. E., Oatley, J. M. Effects of aging and niche microenvironment on spermatogonial stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (6), 1505-1505 (2006).
- Costoya, J. A., Hobbs, R. M., Barna, M. Essential role of Plzf in maintenance of spermatogonial stem cells. Nature Genetics. 36 (6), 653-653 (2004).
- Morrow, C. M., Hostetler, C. E., Griswold, M. D. ETV5 is required for continuous spermatogenesis in adult mice and may mediate blood testes barrier function and testicular immune privilege. Annals of the New York Academy of Sciences. 1120, 144-144 (2007).
- Zeng, W., Snedaker, A. K., Megee, S. Preservation and transplantation of porcine testis tissue. Reproduction, Fertility and Development. 21 (3), 489-489 (2009).
- Jahnukainen, K., Ehmcke, J., Hergenrother, S. D. Effect of cold storage and cryopreservation of immature non-human primate testicular tissue on spermatogonial stem cell potential in xenografts. Human Reproduction. 22 (4), 1060-1060 (2007).
- Rathi, R., Zeng, W., Megee, S. Maturation of testicular tissue from infant monkeys after xenografting into mice. Endocrinology. 149 (10), 5288-5288 (2008).
- Honaramooz, A., Li, M. W., Penedo, M. C. Accelerated maturation of primate testis by xenografting into mice. Biology of Reproduction. 70 (5), 1500-1500 (2004).
