Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

حفز النمو في الخلايا العصبية شجيري متعاطف مثقف

Published: March 21, 2012 doi: 10.3791/3546
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular Biosciences, University of California, Davis

Summary

وصفنا على بروتوكول لاستخدام البروتين مخلق العظام-7 (BMP-7) أو Matrigel للحث على انتقائية نمو الخلايا العصبية الجذعية في متعاطف الابتدائية فصلها عن العقد في عنق الرحم متفوقة (SCG) من الفئران قبل الولادة.

Abstract

شكل شجرة شجيري يحدد مساهمة مجموع متشابك إحدى الخلايا العصبية يمكن أن تحصل 1-3، ويؤثر على أنواع وتوزيع هذه المدخلات و 4-6. وترتبط أنماط المتغيرة للنمو الشجيرية واللدونة وظيفة السلوك العصبي مع ضعف في نماذج تجريبية 7، ويعتقد أنها تساهم في الأعراض السريرية التي لوحظت في كل من اضطرابات النمو العصبي 8-10 وأمراض الاعصاب 11-13. هذه الملاحظات تؤكد أهمية الوظيفية للتنظيم على وجه التحديد مورفولوجيا شجيري، وتشير إلى أن تحديد الآليات التي تتحكم في نمو شجيري لن تقدم فقط فهم كيفية اتصال الخلايا العصبية وينظم خلال التطور الطبيعي، ولكن يمكن أيضا أن تقدم فكرة عن الاستراتيجيات العلاجية رواية عن الأمراض العصبية المختلفة.

وسيتم دراسات الميكانيكية للنمو شجيري سهل إلى حد كبير من قبل س توفراتحاد كرة القدم النظام النموذجي الذي يسمح الخلايا العصبية تحول تجريبيا من الدولة التي لا تمتد إلى واحد في التشعبات التي وضع شجرة شجيري مماثلة لنظيراتها في الجسم الحي. الثقافات الأولية من الخلايا العصبية متعاطف فصلها عن العقد في عنق الرحم متفوقة (SCG) من القوارض فترة ما حول الولادة تقديم مثل هذا النموذج. عندما زرعها في وسط المحددة في حالة عدم وجود الخلايا الدبقية المصل والعقدية، الخلايا العصبية متعاطف توسيع نطاق عملية واحدة التي هي محور عصبي، وهذه حالة القطب الواحد يستمر لأسابيع أو أشهر في ثقافة 14،15. ومع ذلك، فإن إضافة أي التخلق عظم بروتين-7 (BMP-7) 16،17 أو Matrigel 18 إلى ثقافة المتوسط ​​يطلق هذه الخلايا العصبية لتوسيع عمليات متعددة تلبي المورفولوجي، ومعايير الكيمياء الحيوية والوظيفية للالتشعبات. الخلايا العصبية متعاطف فصلها عن SCG من القوارض فترة ما حول الولادة، وتنمو في ظل ظروف محددة ويبلغ عدد سكانها متجانسة من الخلايا العصبية 19التي تستجيب بشكل موحد على النشاط التغصنات المعززة للمن Matrigel، BMP-7 وغيرها من أفضل الممارسات الإدارية decapentaplegic (النيابة العامة) و 60A تحت العوائل 17،18،20،21. الأهم من ذلك، Matrigel وBMP التي يسببها التغصنات تشكيل يحدث في حالة عدم وجود تغييرات في بقاء الخلية أو نمو محواري 17،18.

هنا، نحن تصف كيفية إعداد الثقافات فصلها من الخلايا العصبية متعاطف المستمدة من SCG من الفئران قبل الولادة، بحيث تستجيب لنشاط التغصنات المعززة للانتقائية من Matrigel أو أفضل الممارسات الإدارية.

Protocol

1. إعداد متوسط ​​الثقافة (C2 متوسطة)

  1. يضاف ما يلي، وفقا للترتيب في القائمة، ل، القابل للتصرف العقيمة 500 مل دورق مخروطي:
    كمية عنصر نهائي تركيز
    190 مل DMEM (انخفاض الجلوكوز) N / A
    10 مل الأحماض الدهنية الحرة BSA (20mg/ml في DMEM) 50 ميكروغرام / مل
    2.8 مل L-الجلوتامين 1.4 ملم
    4 مل الانسولين / ترانسفيرين / السيلينيوم (100X) 10 ميكروغرام / مل الانسولين 5.5 ميكروغرام / مل ترانسفيرين 38.7 نانومتر السيلينيوم
    0.4 مل NGF (125 ميكروغرام / مل) 100 نانوغرام / مل
    200 مل لحم الخنزير F-12 N / A
  2. تي بلطف عبابس مزيج وقسامة مل 10 في أنبوب في 17 × 100 عقيمة أنابيب قبعة مبكرة.
  3. تخزين في -80 درجة مئوية
  4. ملاحظات هامة:
    • ذوبان الجليد NGF مباشرة قبل الاستعمال.
    • قبل aliquoting الحل الأوراق المالية NGF، precoat الجدران الداخلية للزراعة الأنسجة الماصة المصلية البلاستيكية التي تحتوي على البروتين للحد من الخلاف من نيسان الخليج للبلاستيك. أسهل أسلوب هو العمل على ماصة الخليط DMEM التي تحتوي على عدة مرات جيش صرب البوسنة. شطف الأنبوب NGF عدة مرات مع خليط DMEM.
    • إضافة F-12 الماضي بسبب السيستين الحرة قد يزعزع استقرار السندات كبريتيد في الأنسولين.
    • لا تجمد في حجم أكبر من 10 مل لكابو 4 يمكن أن تشكل بلورات
    • لا تجميد ذوبان الجليد C2 المتوسطة أكثر من 2 مرات.

2. إعداد Coverslips زجاج

  1. لقد وجدنا أن فقط غرامة coverslips زجاج الألمانية تعمل باستمرار في هذا البروتوكول (انظر الجدول رقم 1 لمصدر أوصىد فهرس العدد).
  2. إضافة 75-100 مل من حمض النتريك 70٪ الى 300 مل زجاجة عينة الزجاج مع بولي تترافلوروإيثيلين المتشددين غطاء (PTFE أو تفلون) (فيشر كتالوج # 09-911-765).
  3. ارتداء القفازات، وانخفاض coverslips واحدا تلو الآخر في حل حامض النتريك. إضافة coverslips بما يكفي لجعل طبقة لا يزيد عن 2-3 coverslips سميك في قاع الإناء.
  4. هز بلطف الحاويات مع coverslips لمدة 6-8 ساعات في درجة حرارة الغرفة على مجموعة شاكر المداري لمدة لا تتجاوز 185 دورة في الدقيقة.
  5. العمل في غطاء محرك السيارة دخان، صب بعناية الحامض والتصرف وفقا للوائح المحلية. شطف coverslips مرة واحدة مع فائق مياه النقية ثقافة الصف الأنسجة، ثم تضاف 75-100 مل من الماء إلى الحاوية. ويمكن شطف Coverslips عدة مرات إذا كان الماء يصبح غائما. هز بلطف في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها على مجموعة شاكر المداري لمدة لا أكثر من 185 دورة في الدقيقة.
  6. تكرار تسلسل أعلى من حمض النتريك / زراعة الأنسجة في الصف المياه يوميا أي ما مجموعه 3 أيام.
  7. صب هذا الأسيتون والتصرف بشكل صحيح.
  8. نقل coverslips على طبق من الزجاج بيتري 150 ملم. إضافة الأسيتون يكفي لتغطية بالكاد coverslips. ضمان coverslips هي في طبقة واحدة في صحن.
  9. السماح للالأسيتون لتتبخر بين عشية وضحاها في غطاء الدخان.
  10. coverslips يخبز في فرن تجفيف في 180 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة للتعقيم.

3. إعداد Coverslips للثقافة

  1. في اليوم السابق للتشريح، إضافة 1 ساترة زجاج (أعدت على النحو المبين أعلاه) إلى كل بئر من 24 لوحة ثقافة جيدا الأنسجة باستخدام تقنية معقمة. إضافة 200 ميكروليتر من محلول بولي-D-يسين عقيم (100 ملغ / مل في تريس العازلة 0،5 متر، ودرجة الحموضة 8) على كل بئر وتخزين لوحة عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
  2. في يوم من تشريح، وبشكل مثالي قبل البدء في تشريح، نضح الحل بولي-D-يسين من كل بئر وغسل همنظمة العمل ضد الجوع أيضا 5 مرات مع ماء معقم درجة الأنسجة ثقافة.
  3. إضافة 200 ميكروليتر منخفضة الجلوكوز DMEM على كل صفيحة، ومتجر في 37 درجة مئوية الحاضنة. حوالي 1 ساعة قبل الخلايا تصفيح، وإزالة منخفضة الجلوكوز DMEM وإضافة 250 متوسطة C2 ميكرولتر لكل بئر. لوحات متجر في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO 2 حتى الخلايا على استعداد ليكون مطلي.

4. تشريح وعزل للعقدة في عنق الرحم العليا

  1. عادة ما يتم إعداد الثقافات فصلها من الخلايا العصبية متعاطف من قبل تفكك العقد عنق الرحم متفوقة (SCG) تحصد من قبل الولادة (أيام الجنينية 19-21) الفئران الوليدة لأن هناك عددا أقل من الخلايا الدبقية. ومع ذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول نفسه بنجاح في وقت مبكر مع الجراء بعد الولادة الفئران (1 إلى 3 أيام من العمر) أو الجراء الماوس فترة ما حول الولادة.
  2. الموت ببطء الفئران الحوامل عن طريق الاستنشاق 2 CO. حلق البطن وغسل الجلد مع الايثانول 70٪. إزالة قرون الرحم تحت ظروف معقمة ووضع قرون الرحم في 150 مم عقيمطبق بتري. تجنب إتلاف الأمعاء أو الأعضاء الداخلية الأخرى من السد خلال تشريح.
  3. وضع طبق بيتري مع الجراء على وعاء من الثلج لتخدير الجراء الجنينية. تشريح الأجنة خالية من قرن الرحم والأغشية الذي يحيط بالجنين. قطع الحبل الشوكي من كل الجرو على طول خط الوسط تحت الكتف إلى الموت ببطء الجراء. هذا أيضا يقطع الوريد الأجوف، مما يقلل من نزيف من الشريان السباتي خلال تشريح SCG. تشريح مرة واحدة خالية من قرن الرحم والأجنة مكان في وسط معقم L-15 ليبوفيتز (أو أي وسيط الهواء مخزنة) استكمال البنسلين والستربتومايسين.
  4. وضع الأجنة على ظهورهم على طبق بيتري 150 ملم نصف مليئة Sylgard. استخدام إبر معقمة قياس 20، دبوس الصدر والرأس، hyperextending بلطف على رقبته، مما يسهل تشريح SCG.
  5. جعل شق خط الوسط على طول العنق في مستوى الترقوة للكشف عن الغدد تحت الفك السفلي. إزالة الغدد النقيبز غرامة ملقط (رقم 4 أو لا. دومونت 5) لكشف طبقة العضلات.
  6. استخدام ملقط غرامة لقطع عضلة القصية الترقوية الخشائية بالقرب من الترقوة. ثم رفع بلطف وشق العضلة اللامية الكتفية بجوار القصبة الهوائية. هذه العضلة هي رقيقة جدا، لذا تجنب قطع عميق جدا لتجنب تمزق الشريان السباتي الكامنة وSCG. حالما تتم إزالة هذه الطبقات في العضلات، ويجب على الشريان السباتي والعصب المبهم تكون مرئية بوضوح.
  7. وSCG يقع أسفل والتشعب من الشريان السباتي. باستخدام ملقط غرامة (رقم 4 أو رقم 5)، تخفف من حدة تشريح الأنسجة بعيدا من كلا الجانبين من الشريان السباتي لفضح عقدة. باستخدام 2 ملقط غرامة، فهم الشريان السباتي فوق فقط ودون نهايات منقاري والذيلية من SCG، على التوالي، لإزالة قسم من الشريان السباتي الكذب فوق SCG فضلا عن SCG نفسها. فمن المحتمل أن سيتم أيضا العقدة العقداء، والتي تقع الى جانب SCG في هذه المرحلة من التنمية، ويمكن إزالتها في هذه الخطوة. في العقد العقداءيمكن تحديدها عن طريق شكلها المستدير والعصب المبهم إسقاط كبير منه. هذا وتقع على طول واحد من فروع الشريان السباتي. في المقابل، واللوز وSCG الشكل وتقع مباشرة تحت والتشعب من الشريان السباتي. وضع الأنسجة تشريح في معقم 35 مم طبق ثقافة تحتوي على L-15 متوسطة والمضادات الحيوية. إزالة SCG من جميع الجراء قبل التقدم إلى الخطوات التالية.
  8. باستخدام ملقط غرامة، فصل بلطف SCG من الشريان السباتي وأي الأنسجة الأخرى إزالتها أثناء تشريح (وخاصة العصب المبهم والعقدة العقداء). استخدام ملقط غرامة لإزالة كبسولة من العقد. هذا يقلل بدرجة كبيرة من عدد من الخلايا nonneuronal في الثقافة. تحويل العقد إلى آخر صحن معقم 35 ملم تحتوي على L-15 متوسطة.
  9. أن يفرق بين SCG، إزالة L-15 متوسطة واستبدالها مع كولاجيناز مل 2 (تركيز النهائي 1 ملغ / مل) / Dispase (التركيز النهائي 5 ملغ / مل) في الكالسيوم والمغنيسيوم خالية من هانك وملح متوازنحل. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
  10. نقل SCG إلى عقيم أنبوب 15 مل الطرد المركزي مخروطي الشكل، وتقديم حجم ما يصل الى 10 مل مع L-15 تستكمل مع جيش صرب البوسنة (تركيز النهائي 1-2 ملغ / مل). الطرد المركزي في ز X 200 في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف وتغسل مرة أخرى مع L-15 تستكمل مع جيش صرب البوسنة.
  11. بعد غسل الثاني، إزالة كافة L-15 وresuspend على العقد في مل 2 ~ متوسطة C2. يسحن الخلايا باستخدام النار مصقول عازمة معلومات سرية ماصة، تأكد وهي مغلفة ماصة مع BSA/L15 قبل سحن لتقليل التصاق الخلايا على الزجاج. يسحن 3-4 مرات بلطف. السماح للكتل كبيرة لتسوية حوالي 1 دقيقة ونقل تعليق خلية لأنبوب 15 مل مخروطي. إضافة المزيد من وسائل الاعلام C2 إلى SCG المتبقية ويسحن. بعد السماح للكتل تسوية، ونقل تعليق خلية من سحن الثانية لتلك التي تم جمعها بعد سحن الأولى. كرر هذه العملية عدة مرات حتى العقد هي الأكثرفصل لاي. تجاهل أي كتل المتبقية بعد سحن الرابع.
  12. لخلايا فصلها عن لتر واحد من الفئران الوليدة (عادة 12-16 الجراء)، ليصبح إجمالي حجم المتوسطة في تعليق خلية إلى 8-10 مل وذلك بإضافة C2 المتوسط. resuspend بلطف الخلايا باستخدام ماصة وإزالة قسامة صغير لتحديد كثافة الخلية. ضبط حجم التعليق الخلية لتحقيق بمقدار 2X كثافة الخلية المطلوب في الثقافة، ومن ثم، وتأكد من المحافظة على الخلايا في التعليق، قسامة 250 مل من تعليق خلية لكل بئر. للدراسات المورفومترية من نمو شجيري، ونحن لوحة الخلايا عادة في منخفض الكثافة (~ 5 × 10 4 خلايا لكل بئر) في 24 لوحات جيدة.
  13. مختبرنا incubates الثقافات SCG في desiccators زجاج بدلا من مباشرة في حاضنة 2 CO. ونحن نفعل ذلك لأن الخلايا العصبية متعاطف نمت في مصل الدم خالية من متوسط ​​أداء أفضل مع التركيز على ارتفاع طفيف CO 2 (ما يقرب من 6.5٪). وبالإضافة إلى ذلك نحن لا نستخدمالمضادات الحيوية في وسائل إعلامنا لأنه يحول دون نمو neurite والثقافات المحافظة في desiccators يبدو للحد من انتشار التلوث اذا ما طورت في مجموعة فرعية من الثقافات. باستخدام هذا النظام، ونحافظ بشكل روتيني الثقافات SCG لمدة تصل إلى 8 أسابيع. توضع مطلي مرة واحدة، الثقافات SCG على الخزف لوحة مجفف في desiccators زجاج تحتوي على الماء المعقم في القاع. يتم حقن ما يقارب 120 مل من CO 2 في مجفف قبل ختم انها اغلقت ووضع مجفف كامل في مجموعة حاضنة للدرجة مئوية 35.5

5. التغذية والمحافظة على الثقافات

  1. ويتم تغذية عموما الثقافات 3 مرات في الأسبوع، مع تبادل وسائل الاعلام 1 تحدث بعد 24 ساعة من الطلاء. باستخدام ماصة عازمة معلومات سرية عقيم، بلطف سحب ما يقرب من نصف وسائل الإعلام لكل بئر. باستخدام النظيفة المعقمة عازمة معلومات سرية ماصة، يستعاض عن حجم متوسط ​​مع إزالة C2 الطازجة.
  2. للقضاء على عدم العصبية الخلايا من الثقافة، ومكافحةوأضاف وكيل وعادة ما الإنقسامية السيتوزين-D-arabinofuranoside (ARA-C، وتركيز النهائي 1-2 ميكرومتر) إلى ثقافة المتوسط ​​في تبادل وسائل الاعلام 1 (على سبيل المثال، بعد 24 ساعة من الطلاء) لمدة 48 ساعة. هذا التركيز من ARA-C وعادة ما يكفي لإزالة جميع الخلايا غير العصبية. إذا كان مطلوبا إضافية ARA-C المعاملة، فمن المستحسن أن يتم ذلك كل هذه التغذية الأخرى للحد من آثار سامة على الخلايا العصبية.

6. حفز النمو شجيري مع Matrigel أو BMP-7

  1. للحث على نمو شجيري، يضاف Matrigel أو BMP-7 على الثقافات بعد أن تم القضاء على عدم العصبية الخلايا وتتضاءل إلى حد كبير ARA-C المستويات في الثقافات. عادة، نضيف Matrigel أو BMP-7 إلى المتوسطة في 5 أيام في المختبر، ولكن يمكن أن يتسبب فيها نمو شجيري بواسطة Matrigel أو BMP-7 وأضاف في أي لحظة زمن في التجارب المختبرية. يضاف Matrigel أو BMP-7 إلى المتوسطة C2 ويتم تغذية الثقافات على النحو المبين أعلاه.
  2. Matrigel وdendriti BMP التي يسببهاج النمو هو الوقت والتي تعتمد على التركيز. القصوى للآثار، يضاف إلى Matrigel C2 بتركيز نهائي من 50-75 ميكروغرام / مل، يضاف BMP-7 إلى المتوسطة C2 بتركيز نهائي من 50 نانوغرام / مل. تركيزات Matrigel من أكبر من 100 ميكروغرام / مل أو BMP-7 تركيزات أكبر من 100 نانوغرام / مل وقد لوحظ أن تسبب تسمم الخلايا العصبية. شجيري العمليات (على النحو الذي تحدده المعايير الشكلية) أصبح من الواضح ما يقرب من 48 ساعة بعد التعرض الأولي إلى Matrigel أو BMP-7 بتركيزات فعالة الى اقصى حد ممكن. للحث على نمو قوي شجيري، ويتم تغذية الثقافات مع BMP-7 التي تحتوي على المتوسط ​​في كل التغذية. وقد تم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام أفضل الممارسات الإدارية 2 و 4 و 5 و 6 في تجمعات مماثلة 20،21.

7. Immunocytochemical تحليل النمو شجيري BMP-7-يسببها

  1. عندما تم تحقيقه على مدى المطلوب من تشجر شجيري، يتم إصلاح الثقافات باستخدام بارافورمالدهيد 4٪ في 0.1 العازلة الفوسفات M. وبويتحقق من خلال استبدال تثبيت بتوقيت شرق الولايات المتحدة من نصف المتوسط ​​في البئر مع بارافورمالدهيد 4٪، وتكرار هذه الخطوة 3-5 مرات أكثر من 10-15 دقيقة.
  2. شطف الثقافات من خلال استبدال نصف بارافورمالدهيد 4٪ مع المالحة الفوسفات مخزنة (PBS) وتكرار هذه الخطوة ثلاث مرات على مدى 10 - 15 دقيقة.
  3. إزالة كل برنامج تلفزيوني وإضافة 200 ميكروليتر تريتون 0.1٪ X-100 في برنامج تلفزيوني على كل بئر لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة إلى permeabilize الخلايا.
  4. إزالة تريتون حل بواسطة طموح وإضافة 200 ميكروليتر لكل بئر من عرقلة حل العازلة (PBS تستكمل مع جيش صرب البوسنة 3-5٪ و 1٪ مصل الماعز). احتضان لمدة 20-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. إزالة عازلة تمنع وإضافة الأجسام المضادة الأولية، أنيبيب المرتبطة بروتين-2 (MAP2) المخفف في 1:2000 - 1:5000 في عرقلة العازلة. احتضان الثقافات لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  6. إزالة حل الأجسام المضادة الأولية، وغسل الثقافات مع ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني على مدى 15 دقيقة في غرفة المزاجature.
  7. تستكمل احتضان الثقافات مع الجسم المضاد الثانوي المخفف في برنامج تلفزيوني مع جيش صرب البوسنة 1٪ لمدة 1-2 ساعات في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  8. إزالة حل الأجسام المضادة الثانوية، ويغسل مع الثقافات ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني على مدى 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  9. coverslips جبل على الزجاج ينزلق إلى أسفل الجانب خلية في قطرة من مائي وسط تصاعد في درجة الحموضة المناسبة للملون تألقي المفتاحية للأجسام المضادة الثانوية. الحفاظ على الشرائح في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها للسماح للمتوسط ​​تركيب الجافة. الشرائح مخزن في 4 درجات مئوية حتى التصوير.
  10. السماح للشرائح لكي تتوازن إلى درجة حرارة الغرفة قبل التصوير. الحصول على صور فلوري باستخدام مجهر مرحلة التباين مجهزة لepifluorescence. عادة، يمكن أن استولت على جذع شجيري كامل من خلية عصبية واحدة باستخدام هدفا 20X والمرشحات المناسبة.

8. ممثل النتائج

متعاطف الخلايا العصبية فصلها عن SCG من الفئران قبل الولادة، وتنمو في ظل غياب الخلايا الدبقية العقدية المصل وفشل لتوسيع العمليات MAP2 immunopositive (الشكل 1)، ولكن بدلا من ذلك، تمتد عادة إلا عملية واحدة محواري 14،15. التعرض لBMP-7 (الشكل 1) أو Matrigel الحث على تشكيل العديد من العمليات التي تحقق المعايير الشكلية، والكيمياء الحيوية والوظيفية من التشعبات 17،18. النشاط التغصنات المعززة إما Matrigel أو BMP-7 هو تركيز و17،18،20 المعتمدة على الزمن. وقد لوحظ نمو شجيري القصوى باستخدام تركيزات من Matrigel بين 50 و 75 ميكروغرام / مل أو BMP-7 بين 30 و 100 ويلاحظ عادة نانوغرام / مل، والآثار نصف القصوى بتركيزات BMP-7 من نانوغرام 2 ~ / مل. ومع ذلك، يمكن أن يتم الكشف عن تغييرات كبيرة في نمو شجيري مع BMP-7 تركيزات منخفضة تصل إلى 300 جزء من الغرام / لتر. استجابة شجيري إما Matrigel أو BMP-7 بطيء نسبيا، مع <50٪ من الخلايا العصبية تشكيل العملية الثانيةفي غضون 24 ساعة بعد التعرض لاما وكيل التغصنات المعززة. لكن، في غضون 3 أيام بعد التعرض لها BMP-7، عمليا كل الخلايا العصبية تستجيب لMatrigel فعال الحد الأقصى أو تركيزات BMP-7. عدد التشعبات في الخلايا العصبية في تزايد مستمر مع التعرض المستمر لBMP-7، مع أكثر من التغيير الذي يحدث خلال الأيام ال 10 الأولى من العلاج. بعد 4 أسابيع، BMP-7-المعالجة الخلايا العصبية وعادة ما يكون 6-8 التشعبات الأساسي الذي يحمل الثانوية، والفروع الشجيرية العالي ورباعي حتى 17. هذه الزيادة في شجرة شجيري يحدث في غياب أي تغيير كبير في نمو محور عصبي، ويمكن المقارنة أثارت ردود شجيري باستخدام تركيزات مماثلة من أفضل الممارسات الإدارية 2، 4، 5 أو 6 20،21. ويمكن أيضا أن يكون نمو شجيري التي تسببها شارك في زراعة الخلايا العصبية متعاطفة مع الخلايا الدبقية العقدية 15،22 الذاتية، إلا أن استجابة شجيري أبطأ بشكل ملحوظ في ظل هذه الظروف.

الشكل 1. BMP-7 يشجع نمو الخلايا العصبية الجذعية في متعاطف مثقف. تم القضاء على الخلايا غير العصبية من SCG الثقافات عن طريق العلاج مع الإنقسامية المضادة للساعة 48 في بداية يوم 2 في المختبر. تبدأ في 5 أيام في المختبر، وعولج الثقافات مع إما متوسطة سيطرة (A) أو المتوسطة تستكمل مع BMP-7 في 50 نانوغرام / مل (B). العثور على البروتين في يوم 11 في المختبر (بعد 5 أيام من العلاج BMP)، وimmunostained الثقافات مع خريطة موقع ضد MAP2، في المقام الأول في التشعبات وsomata العصبية. كما هو مبين في photomicrographs مضان ممثل، الخلايا العصبية نمت في ظل ظروف تفتقر إلى سيطرة التشعبات كما يدل على ذلك عدم وجود خارطة-2 التشعبات عمليات immunopositive (A)، في المقابل، الخلايا العصبية تتعرض لBMP-7 (B) وعادة ما يكون مدبب عدة MAP-2 immunopositive التشعبات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

من مزايا هذا النموذج ما يلي: (أ) وتتألف من ثقافات السكان متجانسة من الخلايا العصبية متعاطف خالية من أنواع الخلايا الأخرى 17،23، (ب) متطلبات عامل نمو الخلايا العصبية هي متعاطفة راسخة، والذي يسمح باستخدام تعريف المتوسطة، ومجموعة متنوعة من وسائل الاعلام تعريف، وركائز تعمل بشكل جيد لنمو الخلايا العصبية والحفاظ على متعاطف 23؛ (ج) الخلايا العصبية في هذه الثقافات استجابة بشكل موحد للنشاط التغصنات المعززة للمن Matrigel، BMP-7 وغيرها من أفضل الممارسات الإدارية الحزب الديمقراطي التقدمي و 60A تحت العوائل 17،18،20،21، و (د) Matrigel أو BMP التي يسببها التغصنات تشكيل يحدث في حالة عدم وجود تغييرات في بقاء الخلية أو نمو محواري 17،18. هذا النموذج يسمح للسيطرة التجريبية عندما يتم تشغيل نمو شجيري، والتي تجعل من الممكن الحصول على السكان متزامنة من الخلايا العصبية في مراحل مختلفة من نمو شجيري، على سبيل المثال، السابقة مباشرة لتشكيل التشعبات، خلال الغصن الأساسيitogenesis (التشكيل الأولي من التشعبات الابتدائي)، وخلال مراحل لاحقة من النضج شجيري. القيود الأكثر أهمية للنموذج تتضمن كميات محدودة من RNA والبروتين المتاحة من تشريح نموذجي من القمامة واحد، والتي قد تحد من الدراسات البيوكيميائية، وبعض الصعوبة في التلاعب الجيني. التطورات الحديثة في التقنيات للتعبير عن [كدنا] في الخلية العصبية الأولية الثقافات والتغلب على هذا العيب الأخير بسرعة. هناك منشورات الإبلاغ عن التطبيق الناجح لنظم التوصيل القائمة على الدهون، nucleofection، وناقلات الفيروسة الغدانية إلى الخلايا العصبية متعاطف مثقف. الكفاءات ترنسفكأيشن ذكرت منخفضة نسبيا (تتراوح عادة بين 10-20٪ مع lipofection أو nucleofection و٪ لتصل إلى 30-50 مع العدوى الفيروسية)، وهو كاف بالنسبة لنهايات بناء على تحليل الخلية الفردية، مثل تحليل الصرفي، ولكن قد يكون إشكالية بالنسبة لنهايات كثيرة البيوكيميائية.

العوامل ثاتي يمكن أن تتداخل مع BMP الناجم عن نمو الخلايا العصبية الجذعية في متعاطف مثقف وتشمل زراعة الخلايا العصبية في مناطق ذات كثافة عالية جدا والخلية بما في ذلك المصل في وسائل الإعلام ثقافة. في حين أن سبب ذلك ارتفاع كثافة الخلية خفف من النشاط التغصنات المعززة للمن لا يعرف أفضل الممارسات الإدارية، فمن المرجح أن المصل خفف هذا النشاط لأفضل الممارسات الإدارية ربط بشوق إلى بروتينات مصل الدم. ومن المثير للاهتمام، المصل نفسها لديها ضعيفة التغصنات المعززة للنشاط الخلايا العصبية في متعاطف مثقف 24 عاما، والبيانات المتوفرة لدينا الأولية تشير إلى أن تتوسط هذا النشاط من قبل أفضل الممارسات الإدارية، والتي هي موجودة في معظم إن لم يكن جميع الأمصال التجارية. أفضل الممارسات الإدارية موجودة أيضا في Matrigel، والتوسط من المرجح لها التغصنات المعززة للنشاط. وهناك عامل ثالث يمكن أن تؤثر على نشاط التغصنات المعززة للمن أفضل الممارسات الإدارية ومناولتها وتخزينها من أفضل الممارسات الإدارية. لا تقم بتخزين مخزون حلول BMP عند تركيز أقل من 0.1 ملغ / مل. من المهم ألا ندع BMP الأوراق المالية أو حلول العمل لتصبح أساسية جدا، ونحن نوصي بأن BUFنظام تقاعد الموظفين الاتحاديين تستخدم لتخفيف حلول الأوراق المالية لديها درجة الحموضة من 4.5 ± 0.05. خلط جميع الحلول بقوة قبل aliquoting ولكن ليس بقوة بحيث. حلول رغوة، واستخدام أنابيب البولي بروبلين فقط لأن أفضل الممارسات الإدارية يميلون إلى التمسك اللدائن الأخرى لا تخزن في المجمدات aliquots التي لديها ميزة تذويب التلقائي لأن رياضة الدراجات من درجات الحرارة كافية لتدمير نشاط BMP-7. وينصح بشدة أن تكون مخزنة في BMP حلول -80 درجة مئوية، وأنه تجميد لاذابة أن يكون الحد الأدنى (ونحن لا تجميد ذوبان الجليد أكثر من 2-3 مرات). وينبغي استخدام الاحتياطات مماثلة في التعامل مع Matrigel. أيضا، فمن المستحسن أن يتم إذابة Matrigel ببطء في 4 درجات مئوية. وسوف Matrigel لا يحفز نمو شجيري عند استخدامها لركائز precoat قبل الخلايا العصبية تصفيح، بل هي فعالة فقط عندما تضاف إلى ثقافة المتوسط ​​من إنشاء مزارع الخلايا العصبية 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من خلال تمويل من المعاهد الوطنية للصحة (منح R21 NS45037 وES014901 R01).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass coverslips Bellco Glass 1943-10012 12 mm Round Coverslip #1 Thickness, German glass
Bent tip pipets Bellco Glass 1273-50003
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P0899-100MG Stock solution 1 mg/ml
Distilled water GIBCO, by Life Technologies 15230
Fine forceps Dumont no. 4 and 5 Fine Science Tools 11252-30 11241-30
20-gauge needles BD Biosciences 305176
Leibovitz’s L-15 medium Invitrogen 11415
Collagenase Worthington Biochemical 4176 1 mg/ml
Dispase Roche Group 04942078001 5 mg/ml
Hank’s balanced salt solution( -Ca,-Mg) Invitrogen 14185-052
DMEM Low glucose Invitrogen 11885
L-Glutamine Invitrogen 25030 20 mM
Insulin/Transferrin/ Selenium Invitrogen 51500-056 100X
Fatty-acid free BSA Calbiochem 126609
NGF Harlan Laboratories 5017
Ham F-12 nutrient medium (F-12) Invitrogen 11765
Cytosine arabinoside Sigma-Aldrich C1768
Matrigel BD Biosciences 356234 Avoid repeated freeze-thaw cycles
BMP-7 R&D Systems 345-BP BMP7-07H BMPs 4, 5 and 6 work equally as well as BMP-7 and are sometimes easier to obtain commercially
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
Mouse anti-rat MAP2 antibody Sternberger Monoclonals Inc. SMI52 1/5000
Alexa Fluor 546 goat-anti-mouse Invitrogen A11003 1/10000
Mounting media Molecular Probes, Life Technologies P7481

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Purpura, D. P. The Neurosciences: A Study Program. Quarton, Q. C., Melnechuk, T., Schmitt, F. O. , Rockefeller University Press. 372-393 (1967).
  2. Purves, D. Functional and structural changes in mammalian sympathetic neurons following interruption of their axons. J. Physiol. 252, 429-463 (1975).
  3. Purves, D. A Trophic Theory of Neural Connections. , Harvard University Press. (1988).
  4. Miller, J. P., Jacobs, G. A. Relationships between neuronal structure and function. J. Exp. Biol. 112, 129-145 (1984).
  5. Schuman, E. M. Synapse specificity and long-term information storage. Neuron. 18, 339-342 (1997).
  6. Sejnowski, T. J. The year of the dendrite. Science. 275, 178-179 (1997).
  7. Berger-Sweeney, J., Hohmann, C. F. Behavioral consequences of abnormal cortical development: insights into developmental disabilities. Behav. Brain Res. 86, 121-142 (1997).
  8. Connors, S. L. Fetal mechanisms in neurodevelopmental disorders. Pediatric Neurology. 38, 163-176 (2008).
  9. Pardo, C. A., Eberhart, C. G. The neurobiology of autism. Brain Pathology (Zurich, Switzerland). 17, 434-447 (2007).
  10. Zoghbi, H. Y. Postnatal neurodevelopmental disorders: meeting at the synapse. Science. 302, 826-830 (2003).
  11. de Ruiter, J. P., Uylings, H. B. Morphometric and dendritic analysis of fascia dentata granule cells in human aging and senile dementia. Brain Res. 402, 217-229 (1987).
  12. Flood, D. G., Coleman, P. D. Hippocampal plasticity in normal aging and decreased plasticity in Alzheimer's disease. Prog. Brain Res. 83, 435-443 (1990).
  13. Jagadha, V., Becker, L. E. Dendritic pathology: an overview of Golgi studies in man. Can. J. Neurol. Sci. 16, 41-50 (1989).
  14. Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. I. Conditions under which neurons form axons but not dendrites. Dev. Biol. 128, 324-336 (1988).
  15. Tropea, M., Johnson, M. I., Higgins, D. Glial cells promote dendritic development in rat sympathetic neurons in vitro. Glia. 1, 380-392 (1988).
  16. Lein, P. The effects of extracellular matrix and osteogenic protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. Int. J. Dev. Neurosci. 14, 203-215 (1996).
  17. Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15, 597-605 (1995).
  18. Lein, P. J., Higgins, D. Laminin and a basement membrane extract have different effects on axonal and dendritic outgrowth from embryonic rat sympathetic neurons in vitro. 136, 330-345 (1989).
  19. Higgins, D., Lein, P. J., Osterhout, D. J., Johnson, M. I. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , The MIT Press. 177-295 (1991).
  20. Beck, H. N., Drahushuk, K., Jacoby, D. B., Higgins, D., Lein, P. J. Bone morphogenetic protein-5 (BMP-5) promotes dendritic growth in cultured sympathetic neurons. BMC Neurosci. 2, 12-12 (2001).
  21. Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neurosci. Lett. 245, 131-134 (1998).
  22. Lein, P. J. Glia induce dendritic growth in cultured sympathetic neurons by modulating the balance between bone morphogenetic proteins (BMPs) and BMP antagonists. J. Neurosci. 22, 10377-10387 (2002).
  23. Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D., Johnson, M. I. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 177-205 (1991).
  24. Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. II. Serum promotes dendritic growth. Dev. Biol. 128, 337-348 (1988).

Tags

علم الأعصاب، العدد 61، العظام morphogenetic البروتين (أفضل الممارسات الإدارية)، Matrigel، التغصنات، dendritogenesis، التشكل الخلايا العصبية، الخلايا العصبية متعاطف
حفز النمو في الخلايا العصبية شجيري متعاطف مثقف
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ghogha, A., Bruun, D. A., Lein, P.… More

Ghogha, A., Bruun, D. A., Lein, P. J. Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons. J. Vis. Exp. (61), e3546, doi:10.3791/3546 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter