Summary

حفز النمو في الخلايا العصبية شجيري متعاطف مثقف

Published: March 21, 2012
doi:

Summary

وصفنا على بروتوكول لاستخدام البروتين مخلق العظام-7 (BMP-7) أو Matrigel للحث على انتقائية نمو الخلايا العصبية الجذعية في متعاطف الابتدائية فصلها عن العقد في عنق الرحم متفوقة (SCG) من الفئران قبل الولادة.

Abstract

شكل شجرة شجيري يحدد مساهمة مجموع متشابك إحدى الخلايا العصبية يمكن أن تحصل 1-3، ويؤثر على أنواع وتوزيع هذه المدخلات و 4-6. وترتبط أنماط المتغيرة للنمو الشجيرية واللدونة وظيفة السلوك العصبي مع ضعف في نماذج تجريبية ويعتقد أنها تساهم في الأعراض السريرية التي لوحظت في كل من اضطرابات النمو العصبي 8-10 وأمراض الاعصاب 11-13. هذه الملاحظات تؤكد أهمية الوظيفية للتنظيم على وجه التحديد مورفولوجيا شجيري، وتشير إلى أن تحديد الآليات التي تتحكم في نمو شجيري لن تقدم فقط فهم كيفية اتصال الخلايا العصبية وينظم خلال التطور الطبيعي، ولكن يمكن أيضا أن تقدم فكرة عن الاستراتيجيات العلاجية رواية عن الأمراض العصبية المختلفة.

وسيتم دراسات الميكانيكية للنمو شجيري سهل إلى حد كبير من قبل س توفراتحاد كرة القدم النظام النموذجي الذي يسمح الخلايا العصبية تحول تجريبيا من الدولة التي لا تمتد إلى واحد في التشعبات التي وضع شجرة شجيري مماثلة لنظيراتها في الجسم الحي. الثقافات الأولية من الخلايا العصبية متعاطف فصلها عن العقد في عنق الرحم متفوقة (SCG) من القوارض فترة ما حول الولادة تقديم مثل هذا النموذج. عندما زرعها في وسط المحددة في حالة عدم وجود الخلايا الدبقية المصل والعقدية، الخلايا العصبية متعاطف توسيع نطاق عملية واحدة التي هي محور عصبي، وهذه حالة القطب الواحد يستمر لأسابيع أو أشهر في ثقافة 14،15. ومع ذلك، فإن إضافة أي التخلق عظم بروتين-7 (BMP-7) 16،17 أو Matrigel 18 إلى ثقافة المتوسط ​​يطلق هذه الخلايا العصبية لتوسيع عمليات متعددة تلبي المورفولوجي، ومعايير الكيمياء الحيوية والوظيفية للالتشعبات. الخلايا العصبية متعاطف فصلها عن SCG من القوارض فترة ما حول الولادة، وتنمو في ظل ظروف محددة ويبلغ عدد سكانها متجانسة من الخلايا العصبية 19التي تستجيب بشكل موحد على النشاط التغصنات المعززة للمن Matrigel، BMP-7 وغيرها من أفضل الممارسات الإدارية decapentaplegic (النيابة العامة) و 60A تحت العوائل 17،18،20،21. الأهم من ذلك، Matrigel وBMP التي يسببها التغصنات تشكيل يحدث في حالة عدم وجود تغييرات في بقاء الخلية أو نمو محواري 17،18.

هنا، نحن تصف كيفية إعداد الثقافات فصلها من الخلايا العصبية متعاطف المستمدة من SCG من الفئران قبل الولادة، بحيث تستجيب لنشاط التغصنات المعززة للانتقائية من Matrigel أو أفضل الممارسات الإدارية.

Protocol

1. إعداد متوسط ​​الثقافة (C2 متوسطة) يضاف ما يلي، وفقا للترتيب في القائمة، ل، القابل للتصرف العقيمة 500 مل دورق مخروطي: كمية عنصر نهائي تركيز</strong…

Discussion

من مزايا هذا النموذج ما يلي: (أ) وتتألف من ثقافات السكان متجانسة من الخلايا العصبية متعاطف خالية من أنواع الخلايا الأخرى 17،23، (ب) متطلبات عامل نمو الخلايا العصبية هي متعاطفة راسخة، والذي يسمح باستخدام تعريف المتوسطة، ومجموعة متنوعة من وسائل الاعلام تعريف، وركا?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من خلال تمويل من المعاهد الوطنية للصحة (منح R21 NS45037 وES014901 R01).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
Glass coverslips Bellco 1943-10012 12 mm Round Coverslip #1 Thickness, German glass
Bent tip pipets Bellco 1273-50003  
Poly-D-lysine Sigma P0899-100MG Stock solution 1 mg/ml
Distilled water Gibco 15230  
Fine forceps Dumont no. 4 and 5 Fine Science Tools (FST) 11252-30 11241-30  
20-gauge needles Becton Dickinson 305176  
Leibovitz’s L-15 medium Invitrogen 11415  
Collagenase Worthington 4176 1 mg/ml
Dispase Roche 04942078001 5 mg/ml
Hank’s balanced salt solution( -Ca,-Mg) Invitrogen 14185-052  
DMEM Low glucose Invitrogen 11885  
L-Glutamine Invitrogen 25030 20 mM
Insulin/Transferrin/ Selenium Invitrogen 51500-056 100X
Fatty-acid free BSA Calbiochem 126609  
NGF Harlan Bioproducts 5017  
Ham F-12 nutrient medium (F-12) Invitrogen 11765  
Cytosine arabinoside Sigma C1768  
Matrigel BD Biosciences 356234 Avoid repeated freeze-thaw cycles
BMP-7 R&D Systems Curis, Inc. 345-BP BMP7-07H BMPs 4, 5 and 6 work equally as well as BMP-7 and are sometimes easier to obtain commercially
Paraformaldehyde Sigma P6148  
Triton X-100 Fisher BP151-500  
Mouse anti-rat MAP2 antibody Sternberg Monoclonals Inc. SMI52 1/5000
Alexa Fluor 546 goat-anti-mouse Invitrogen A11003 1/10000
Mounting media Prolong Antifade kit Molecular Probes P7481  

Table 1. Materials.

References

  1. Purpura, D. P., Quarton, Q. C., Melnechuk, T., Schmitt, F. O. . The Neurosciences: A Study Program. , 372-393 (1967).
  2. Purves, D. Functional and structural changes in mammalian sympathetic neurons following interruption of their axons. J. Physiol. 252, 429-463 (1975).
  3. Purves, D. . A Trophic Theory of Neural Connections. , (1988).
  4. Miller, J. P., Jacobs, G. A. Relationships between neuronal structure and function. J. Exp. Biol. 112, 129-145 (1984).
  5. Schuman, E. M. Synapse specificity and long-term information storage. Neuron. 18, 339-342 (1997).
  6. Sejnowski, T. J. The year of the dendrite. Science. 275, 178-179 (1997).
  7. Berger-Sweeney, J., Hohmann, C. F. Behavioral consequences of abnormal cortical development: insights into developmental disabilities. Behav. Brain Res. 86, 121-142 (1997).
  8. Connors, S. L. Fetal mechanisms in neurodevelopmental disorders. Pediatric Neurology. 38, 163-176 (2008).
  9. Pardo, C. A., Eberhart, C. G. The neurobiology of autism. Brain Pathology (Zurich, Switzerland). 17, 434-447 (2007).
  10. Zoghbi, H. Y. Postnatal neurodevelopmental disorders: meeting at the synapse. Science. 302, 826-830 (2003).
  11. de Ruiter, J. P., Uylings, H. B. Morphometric and dendritic analysis of fascia dentata granule cells in human aging and senile dementia. Brain Res. 402, 217-229 (1987).
  12. Flood, D. G., Coleman, P. D. Hippocampal plasticity in normal aging and decreased plasticity in Alzheimer’s disease. Prog. Brain Res. 83, 435-443 (1990).
  13. Jagadha, V., Becker, L. E. Dendritic pathology: an overview of Golgi studies in man. Can. J. Neurol. Sci. 16, 41-50 (1989).
  14. Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. I. Conditions under which neurons form axons but not dendrites. Dev. Biol. 128, 324-336 (1988).
  15. Tropea, M., Johnson, M. I., Higgins, D. Glial cells promote dendritic development in rat sympathetic neurons in vitro. Glia. 1, 380-392 (1988).
  16. Lein, P. The effects of extracellular matrix and osteogenic protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. Int. J. Dev. Neurosci. 14, 203-215 (1996).
  17. Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15, 597-605 (1995).
  18. Lein, P. J., Higgins, D. Laminin and a basement membrane extract have different effects on axonal and dendritic outgrowth from embryonic rat sympathetic neurons in vitro. 136, 330-345 (1989).
  19. Higgins, D., Lein, P. J., Osterhout, D. J., Johnson, M. I., Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cells. , 177-295 (1991).
  20. Beck, H. N., Drahushuk, K., Jacoby, D. B., Higgins, D., Lein, P. J. Bone morphogenetic protein-5 (BMP-5) promotes dendritic growth in cultured sympathetic neurons. BMC Neurosci. 2, 12-12 (2001).
  21. Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neurosci. Lett. 245, 131-134 (1998).
  22. Lein, P. J. Glia induce dendritic growth in cultured sympathetic neurons by modulating the balance between bone morphogenetic proteins (BMPs) and BMP antagonists. J. Neurosci. 22, 10377-10387 (2002).
  23. Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D., Johnson, M. I., Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cells. , 177-205 (1991).
  24. Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. II. Serum promotes dendritic growth. Dev. Biol. 128, 337-348 (1988).

Play Video

Cite This Article
Ghogha, A., Bruun, D. A., Lein, P. J. Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons. J. Vis. Exp. (61), e3546, doi:10.3791/3546 (2012).

View Video