Summary
We beschrijven een protocol voor het gebruik van botmorfogenetische eiwit-7 (BMP-7) of Matrigel om selectief te induceren dendritische groei van de primaire sympathische neuronen los worden gezien van de superieure cervicale ganglia (SCG) van perinatale ratten.
Abstract
De vorm van de dendritische spil bepaalt de totale synaptische ingang een neuron kan ontvangen 1-3, beïnvloedt de samenstelling en verdeling van deze ingangen 4-6. Veranderde patronen van dendritische groei en plasticiteit worden geassocieerd met een verminderde neuro-functie in experimentele modellen 7 en worden verondersteld bij te dragen aan de klinische symptomen waargenomen bij zowel neurologische stoornissen 8-10 en neurodegeneratieve ziekten 11-13. Dergelijke waarnemingen onderstrepen het functionele belang van precies regelen dendritische morfologie, en suggereren dat het identificeren van mechanismen die dendritische groei te beheersen niet alleen inzicht in hoe neuronale connectiviteit wordt geregeld tijdens de normale ontwikkeling te bevorderen, maar kan ook inzicht te geven op nieuwe therapeutische strategieën voor diverse neurologische aandoeningen.
Mechanistische studies van dendritische groei zou aanzienlijk worden vergemakkelijkt door de beschikbaarheid ofa model systeem waarmee neuronen om proefondervindelijk te worden omgeschakeld van een toestand waarin ze niet dendrieten uit te breiden tot een waarin ze een dendritische prieel vergelijkbaar met die van hun in vivo tegenhangers uit te werken. Primaire culturen van sympathische neuronen los worden gezien van de superieure cervicale ganglia (SCG) van perinatale knaagdieren voorziet in een dergelijk model. Wanneer gekweekt in beschreven medium in de afwezigheid van serum en ganglion gliacellen, sympathiek neuronen uit te breiden een proces dat is axonale, en dit unipolaire toestand aanhoudt weken tot maanden in de cultuur 14,15. De toevoeging van een bot morfogenetische proteïnen 7 (BMP-7) 16,17 of Matrigel 18 het kweekmedium activeert deze neuronen te verlengen meerdere processen dat de morfologische, biochemische en functionele criteria voor dendrieten. Sympathische neuronen los van de SCG van perinatale knaagdieren en geteeld onder bepaalde voorwaarden zijn van een homogene populatie van neuronen 19die op uniforme wijze reageren op de dendriet-bevorderend activiteit van Matrigel, BMP-7 en andere BMP's van de decapentaplegic (DPP) en 60A subfamilies 17,18,20,21. Belangrijk Matrigel en BMP-geïnduceerde vorming dendrietmorfologie treedt in de afwezigheid van veranderingen in celoverleving of axonale groei 17,18.
Hier beschrijven we hoe je los culturen van sympathische neuronen afgeleid van de SCG van perinatale ratten, zodat ze kunnen inspelen op de selectieve dendriet-bevorderend activiteit van Matrigel of BMP.
Protocol
1. Voorbereiding van Cultuur Medium (C2 medium)
- Voeg de volgende, in de aangegeven volgorde, in een steriele, disposable 500 ml Erlenmeyer:
Bedragen Bestanddeel Eindconcentratie 190 ml DMEM (lage glucose) N / A 10 ml vetzuur vrij BSA (20mg/ml in DMEM) 50 ug / ml 2,8 ml L-Glutamine 1,4 mM 4 ml insuline / transferrine / selenium (100x) 10 ug / ml insuline 5,5 ug / ml 38,7 transferrine nM selenium 0,4 ml NGF (125 ug / ml) 100 ng / ml 200 ml Ham F-12 N / A - Roer voorzichtig to mix en hoeveelheid van 10 ml per buis in 17 x 100 steriele klikdop buizen.
- Bewaar bij -80 ° C
- Belangrijke opmerkingen:
- Ontdooi NGF onmiddellijk voorafgaand aan gebruik.
- Voordat aliquoting de NGF voorraadoplossing, voorstrijken de binnenmuren van de weefselkweek plastic serologische pipet met eiwit te minimaliseren kleven van NGF aan de kunststof. Gemakkelijkste aanpak is om Pipetteer de DMEM mengsel dat de BSA een paar keer. Spoel de NGF buis meerdere malen met de DMEM mengsel.
- Voeg F-12 laatste omdat vrije cysteine kan disulfidebindingen destabiliseren in de insuline.
- Niet in de vriezer in hoeveelheden van meer dan 10 ml, omdat CAPO vier kristallen kunnen vormen
- Niet in de vriezer ontdooien C2-medium meer dan 2 keer.
2. Voorbereiding van de dekglaasjes
- We hebben gemerkt dat alleen fijne Duitse dekglaasjes consequent werken in dit protocol (zie tabel 1 voor de aanbevolen bron en catalogusnummer).
- Voeg 75-100 ml 70% salpeterzuur tot 300 ml glazen exemplaar flessen met polytetrafluorethyleen (PTFE of Teflon) deksel liners (Fisher catalogus # 09-911-765).
- Het dragen van handschoenen, drop dekglaasjes een voor een in salpeterzuur. Voeg genoeg dekglaasjes een laag niet meer dan 2-3 dekglaasjes dik op de bodem van de fles te maken.
- Schud de containers met de dekglaasjes gedurende 6-8 uur bij kamertemperatuur op een schudapparaat set niet meer dan 185 rpm.
- Werken in een zuurkast, zorgvuldig decanteer het zuur en afvoeren volgens de lokale voorschriften. Een keer Spoel dekglaasjes met ultra-pure weefselkweek-grade water, voeg dan 75-100 ml water in de container. Dekglaasjes, kan gespoeld meerdere keren als het water troebel wordt. Schud bij kamertemperatuur 's nachts op een rondschudapparaat set voor niet meer dan 185 toeren per minuut.
- Herhaal de bovenstaande volgorde van salpeterzuur / weefselkweek-grade water per dag voor een totaal van 3 dagen.
- Schenk de laatsteweefselkweek-grade water en voeg genoeg aceton om nauwelijks dekking van de dekglaasjes.
- Giet dit aceton en afvoeren naar behoren.
- Overdracht dekglaasjes tot een 150 mm glazen petrischaal. Voeg genoeg aceton om nauwelijks dekking van de dekglaasjes. Zorg ervoor dat de dekglaasjes zijn in een enkele laag in de schaal.
- Laat de aceton om 's nachts verdampen in een zuurkast.
- Bak dekglaasjes in een droogoven bij 180 ° C gedurende 1,5 uur steriliseren.
3. Voorbereiding van Dekglaasjes voor Cultuur
- De dag voor de ontleding voeg 1 glas dekglaasje (bereid zoals hierboven beschreven) aan elk putje van een 24 goed weefselkweek plaat met steriele techniek. Voeg 200 ul steriel poly-D-lysine (100 mg / ml in 0,5 M Tris-buffer, pH 8) aan elk putje en opslaan van de plaat bij 4 ° C geroerd.
- De dag van de dissectie, en liefst voor aanvang van de dissectie, zuigen de poly-D-lysine oplossing van elk putje en was elke well 5 keermet een steriele weefselkweek kwaliteit water.
- Voeg 200 ul low-glucose DMEM met elke plaat en op te slaan in 37 ° C incubator. Ongeveer 1 uur voor plating cellen, verwijder lage glucose DMEM en voeg 250 ul C2 medium per well. Winkel platen bij 37 ° C onder 5% CO2 tot cellen bereid worden uitgeplaat.
4. Dissection en isolatie van de Hoge cervicale ganglion
- Gescheiden culturen van sympathische neuronen worden gewoonlijk bereid door dissociatie van superieure cervicale ganglia (SCG) geoogst van prenatale (embryonale dag 19-21) jonge ratten omdat er minder gliacellen. Dit kan echter hetzelfde protocol met succes worden gebruikt met vroege postnatale (1 tot 3 dagen oud) jonge ratten of perinatale muis pups.
- Euthanaseren zwangere ratten via CO 2 inademing. Scheer de buik en was de huid met 70% ethanol. Verwijder de baarmoederhoorns onder steriele omstandigheden en plaats de baarmoederhoorns in een steriele 150 mm petrischaal. Vermijdenschade aan de darmen of andere inwendige organen van de dam tijdens de dissectie.
- Plaats de petrischaal met de pups op een pan met ijs om de embryonale pups verdoven. Ontleden de embryo's vrij zijn van de baarmoeder hoorn en vruchtwater membranen. Snijd het ruggenmerg van elke pup over de middellijn onder de schouder van de pups slapen. Deze scheidt ook de vena cava, die bloedingen vermindert van de halsslagader tijdens dissectie van de SCG. Zodra vrij gesneden van baarmoedertak, plaats embryo's in een steriele Leibovitz L-15 medium (of lucht gebufferd medium) aangevuld met penicilline en streptomycine.
- Plaats de embryo's op hun rug op een 150 mm petrischaal half-gevuld met Sylgard. Met behulp van steriele 20 gauge naalden, speld de borstkas en het hoofd, voorzichtig hyperextending de hals, die dissectie van de SCG vergemakkelijkt.
- Maak een middellijn incisie langs de hals op het niveau van de sleutelbeenderen tot de submandibulaire klieren te onthullen. Verwijder de klieren met fijn pincet (no. 4 of geen. 5 Dumont) om de spierlaag bloot te leggen.
- Gebruik de fijne tang om de m. sternocleidomastoideus in de buurt van het sleutelbeen te snijden. Dan voorzichtig optillen en incisie van de spier omohyoid naast de luchtpijp. Deze spier is zeer dun, dus vermijd het snijden te diep om te vermijden dat het onderliggende halsslagader en SCG. Zodra deze spierlagen worden verwijderd, moet de halsslagader en de nervus vagus duidelijk zichtbaar zijn.
- De SCG ligt net onder de splitsing van de halsslagader. Met behulp van fijne pincet (nr. 4 of nee. 5), bot weg te ontleden weefsel aan beide zijden van de halsslagader naar de ganglion bloot te leggen. Met behulp van 2 mooie tang, pakt u de halsslagader net boven en onder de rostrale en caudale uiteinden van de SCG, respectievelijk, het gedeelte van de halsslagader ligt boven het SCG en de SCG zelf te verwijderen. Het is waarschijnlijk dat de nodose ganglion, gelegen naast de SCG in dit stadium van ontwikkeling ook worden verwijderd deze stap. De nodose ganglia kan identified door zijn ronde vorm en de grote vagale zenuw projecteren van. Deze ligt langs een van de takken van de halsslagader. Daarentegen wordt de SCG amandelvormig en ligt direct onder de splitsing van de halsslagader. Plaats de ontleed weefsel in een steriele 35 mm cultuur schotel met L-15-medium en antibiotica. Verwijder de SCG van alle pups alvorens aan de volgende stappen.
- Met behulp van fijne tang voorzichtig te scheiden van de SCG van de halsslagader en eventueel verwijderd andere weefsels tijdens de dissectie (met name de nervus vagus en nodose ganglion). Gebruik fijne tang om de capsule te verwijderen uit de ganglia. Dit reduceert het aantal niet-neuronale cellen in kweek. Breng de ganglia ander steriel 35 mm schotel met L-15 medium.
- Om de SCG dissociëren verwijderen L-15 medium en vervangen door 2 ml Collagenase (eindconcentratie 1 mg / ml) / Dispase (eindconcentratie 5 mg / ml) calcium en magnesium vrij Balanced Salt Hank's oplossing. Incubatorte op 37 ° C gedurende 40 minuten.
- Breng het SCG in een steriele 15 ml conische centrifugebuis en breng het volume tot 10 ml met L-15 aangevuld met BSA (uiteindelijke concentratie 1-2 mg / ml). Centrifugeer bij 200 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en was eens te meer met L-15 aangevuld met BSA.
- Na de tweede wasbeurt, verwijdert u alle L-15 en resuspendeer de ganglia in ~ 2 ml C2 medium. Vermaal de cellen met behulp van een brand-gepolijst gebogen-tip pipet, zorg ervoor dat de pipet is bekleed met BSA/L15 voordat trituratie te minimaliseren plakken van cellen om het glas. Vermalen 3-4 keer zachtjes. Laat de grote pollen genoegen nemen met ongeveer 1 minuut en breng de celsuspensie om een 15 ml conische buis. Voeg meer C2 media om de resterende SCG en vermalen. Na de verhuur van de bosjes te regelen, overdracht van de celsuspensie van de tweede trituratie aan dat de verzamelde na de eerste tritureren. Herhaal dit proces een paar keer totdat de ganglia zijn meestal gescheiden. Discard resterende klonten na de vierde tritureren.
- Voor cellen los uit een nest van jonge ratten (meestal 12 tot 16 pups), komt het totale volume van medium in de celsuspensie tot 8-10 ml door het toevoegen van extra C2 medium. Voorzichtig resuspendeer de cellen met behulp van een pipet en verwijderen van een kleine hoeveelheid aan de cel dichtheid te bepalen. Het volume van de celsuspensie 2x de celdichtheid in de cultuur gewenste bereiken en, waarbij u de cellen handhaven suspensie aliquot 250 ml celsuspensie per well. Voor morfometrische studies van dendritische groei, hebben we meestal plaat cellen bij lage dichtheid (~ 5 x 10 4 cellen per putje) in 24 well platen.
- Ons laboratorium inleggen SCG culturen in glas Exsiccatoren in plaats van direct in een CO 2 incubator. We doen dit omdat sympathische neuronen gekweekt in serum-vrij medium beter te presteren met een iets hogere CO 2-concentratie (ongeveer 6,5%). Daarnaast hebben we geen gebruik van antibiotica in de our media sinds het remt de uitgroei van neurieten en onderhouden van culturen in de Exsiccatoren lijkt te minimaliseren verspreiding van verontreiniging wordt als het zich ontwikkelt in een subset van culturen. Met behulp van dit systeem hebben we regelmatig onderhouden SCG culturen voor maximaal 8 weken. Eenmaal vergulde, SCG culturen worden geplaatst op het porselein exsiccator plaat in glas Exsiccatoren met steriel water in de bodem. Ongeveer 120 ml CO2 wordt geïnjecteerd in de exsiccator voor afdichting te sluiten en door het gehele exsiccator in een incubator set van 35,5 ° C.
5. Voeding en onderhoud van culturen
- Culturen zijn over het algemeen gevoed 3 keer per week, met de eerste media-uitwisseling optreedt 24 uur na plating. Met behulp van een steriele gebogen-tip pipet, zuig langzaam ongeveer de helft van de media per putje. Met behulp van een schone steriele gebogen-tip pipet, vervangt u het volume van de medium verwijderd met verse C2.
- Om niet-neuronale cellen te elimineren uit de cultuur, de anti-mitotische middel cytosine-D-arabinofuranoside (ARA-C, eindconcentratie 1-2 uM) wordt gewoonlijk toegevoegd aan het kweekmedium tijdens de eerste uitwisseling media (bijvoorbeeld 24 uur na plating) gedurende 48 uur. Deze concentratie van ARA-C is meestal voldoende om alle niet-neuronale cellen te verwijderen. Als er extra ARA-C behandeling nodig is, is het raadzaam om deze elke andere voeding voor toxische effecten op de neuronen een minimum te beperken worden gedaan.
6. Veroorzaken van dendritische groei met Matrigel of BMP-7
- Om dendritische groei te induceren, wordt Matrigel of BMP-7 toegevoegd aan culturen na de niet-neuronale cellen zijn verwijderd en ARA-C niveaus in de culturen zijn aanzienlijk verminderd. Typisch, voegen wij Matrigel of BMP-7 het medium op dag 5 in vitro, maar dendritische groei geïnduceerd worden door Matrigel of BMP-7 op elk gewenst tijdstip in vitro. Matrigel of BMP-7 wordt toegevoegd aan het medium en C2 worden toegevoerd culturen zoals hierboven beschreven.
- Matrigel en BMP-geïnduceerde dendritische groei is het tijden concentratie-afhankelijk. Voor het maximale effect wordt Matrigel toegevoegd C2 bij een uiteindelijke concentratie van 50-75 pg / ml; BMP-7 wordt toegevoegd aan het medium C2 tot een eindconcentratie van 50 ng / ml. Matrigel concentraties van meer dan 100 pg / ml of BMP-7 concentraties hoger dan 100 ng / ml zijn waargenomen met zenuwcellen toxiciteit. Dendritische processen (zoals bepaald door morfologische criteria) blijken ongeveer 48 uur na de eerste blootstelling aan Matrigel of BMP-7 bij maximaal effectieve concentraties. Om robuuste dendritische groei te induceren, zijn culturen gevoerd met BMP-7 bevattend medium bij elke voeding. Dergelijke resultaten zijn verkregen met BMP 2, 4, 5 en 6 bij vergelijkbare concentraties 20,21.
7. Immunocytochemische Analyse van BMP-7-geïnduceerde groei Dendritic
- Wanneer de gewenste mate van dendritische arborization is bereikt, worden vastgesteld culturen met 4% paraformaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer. De beste fixatie is eenchieved door vervanging halve medium in de well met 4% paraformaldehyde en herhalen stap 3-5 maal gedurende 10-15 minuten.
- Spoel culturen door vervanging halve 4% paraformaldehyde met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en herhalen stap driemaal 10 - 15 minuten.
- Verwijder de PBS en voeg 200 ul 0,1% Triton X-100 in PBS in elk putje gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur aan de cellen permeabilize.
- Verwijder Triton oplossing door afzuigen en voeg 200 pl per putje van blokkerende bufferoplossing (PBS aangevuld met 3-5% BSA en 1% geitenmelk serum). Incubeer 20-30 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder de blokkeerbuffer en voeg het primaire antilichaam, met microtubuli geassocieerde proteïne-2 (MAP2) verdund tot 1:2000 - 1:5000 in het blokkeren van buffer. Incubeer kweken gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.
- Verwijder het primaire antilichaam oplossing was de kweken met PBS driemaal 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Incubeer de culturen met het secundaire antilichaam, verdund in PBS aangevuld met 1% BSA voor 1-2 uur bij kamertemperatuur in het donker.
- Verwijder het secundaire antilichaam oplossing was de culturen met PBS driemaal 10-15 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Mount dekglaasjes op glasplaatjes cel naar beneden in een druppel waterig medium montage op de geschikte pH voor het fluorochroom gekoppeld aan de secundaire antilichaam. Houd de dia s nachts bij kamertemperatuur te laten de montage medium droog. Store dia's bij 4 ° C tot beeldvorming.
- Laat de dia's om naar de kamer temp evenwicht voor de beeldvorming. Verwerven van fluorescerende beelden met behulp van een fase-contrast microscoop uitgerust voor epifluorescentie. Meestal kan de gehele dendritische spil van een neuron worden gemaakt met een 20X objectieve en passende filters.
8. Representatieve resultaten
Sympathische neuronen los van de SCG van perinatale rats en gekweekt in de afwezigheid van serum en ganglien gliacellen niet MAP2 immunopositieve processen (figuur 1) uitstrekken, maar typisch zich slechts een axonale proces 14,15. Blootstelling aan BMP-7 (fig. 1) of Matrigel induceert de vorming van talrijke processen dat de morfologische, biochemische en functionele criteria van dendrieten 17,18 voldoen. De dendriet-bevorderend activiteit van zowel Matrigel of BMP-7 is de concentratie-en tijdsafhankelijke 17,18,20. Maximale dendritische groei waargenomen met concentraties Matrigel tussen 50 en 75 ug / ml of BMP-7 tussen 30 en 100 ng / ml en half-maximale effect typisch waargenomen BMP-7 concentraties ~ 2 ng / ml. Kunnen echter significante veranderingen in dendritische groei worden gedetecteerd met BMP-7 concentraties van 300 pg / ml. De reactie dendritische ofwel Matrigel of BMP-7 relatief langzaam, <50% van de neuronen vorming van een tweede proces binnen 24 uur na blootstelling aan een dendrieten-p EVORDEREN agent. Echter binnen de 3 dagen na de eerste BMP-7 blootstelling vrijwel alle neuronen reageren maximaal effectief Matrigel of BMP-7 concentraties. Het aantal dendrieten per neuronen blijft stijgen met de continue blootstelling aan BMP-7, met het merendeel van de wijzigingen die tijdens de eerste 10 dagen van de behandeling. Na 4 weken, BMP-7-behandelde neuronen hebben meestal 6-8 primaire dendrieten dat de secundaire, tertiaire en zelfs kwartaire dendritische takken vertonen 17. Deze stijging van de dendritische prieel treedt in de afwezigheid van enige significante verandering in de axonale groei, en vergelijkbare dendritische reacties kunnen worden uitgelokt met vergelijkbare concentraties van BMP's 2, 4, 5 of 6 20,21. Dendritische groei kan ook worden uitgelokt door co-kweken van sympathische neuronen met endogene ganglien gliacellen 15,22, maar de dendritische respons is aanzienlijk langzamer onder deze omstandigheden.
. Jpg "/>
Figuur 1. BMP-7 bevordert de dendritische groei van de gekweekte sympathische neuronen. Niet-neuronale cellen werden uit SCG kweken door behandeling met anti-mitotische 48 uur begint op dag 2 in vitro. Beginnend op dag 5 in vitro kweken werden behandeld met controle medium (A) of medium aangevuld met BMP-7 bij 50 ng / ml (B). Op dag 11 in vitro (na 5 dagen van BMP behandeling), culturen werden immunostained met mAb tegen MAP2, een eiwit dat voorkomt in de eerste plaats in de dendrieten en neuronale somata. Zoals in representatieve fluorescentie microfiches neuronen gekweekt onder controle omstandigheden missen dendrieten zoals blijkt uit een gebrek aan MAP-2 immunopositieve processen dendrieten (A), in tegenstelling neuronen blootgesteld aan BMP-7 (B) typisch meerdere trechtervormige MAP-2 immunopositieve hebben dendrieten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De voordelen van dit model omvatten: (a) de culturen uit een homogene populatie van sympathische neuronen zonder andere celtypen 17,23, (b) de groeifactor eisen van sympathische neuronen gevestigde, waardoor het gebruik van beschreven medium, en een verscheidenheid aan bepaalde media, en substraten werken goed voor het kweken en onderhouden van sympathische neuronen 23; (c) neuronen in deze culturen uniform te reageren op de dendriet-bevorderend activiteit van Matrigel, BMP-7 en andere BMP's van de DPP en 60A subfamilies 17,18,20,21 en (d) Matrigel of BMP-geïnduceerde vorming dendrietmorfologie treedt in de afwezigheid van veranderingen in celoverleving of axonale groei 17,18. Dit model kan experimenteel bepalen wanneer dendritische groei wordt geactiveerd, waardoor het mogelijk synchroon populaties neuronen verkrijgen bij verschillende stadia van dendritische groei, bijvoorbeeld vóór de vorming van dendrieten tijdens primaire dendritogenesis (de eerste vorming van primaire dendrieten) en tijdens latere stadia van dendritische rijping. De belangrijkste beperkingen van het model zijn de beperkte hoeveelheden RNA en eiwitten die beschikbaar zijn vanaf een typisch dissectie van een nest, dat kunnen beperken biochemische studies, en een aantal problemen in het manipuleren van genexpressie. Recente ontwikkelingen in de technieken voor het uitdrukken van cDNA in primaire neuronale celkweken in hoog tempo het overwinnen van dit laatste nadeel. Er zijn publicaties de rapportage van de succesvolle toepassing van lipide-gebaseerde systemen, nucleofectie en adenovirale vectoren voor gekweekte sympathische neuronen. De gerapporteerde transfectie relatief laag (gewoonlijk tussen 10-20% met lipofectie of nucleofectie en tot 30-50% van virale infectie), die voldoende is voor eindpunten op individuele cel analyses zoals morfologische analyses, maar kan problematisch voor veel biochemische eindpunten.
Factoren that kunnen interfereren met BMP-geïnduceerde groei dendritische in gekweekte neuronen sympathische omvatten kweken neuronen een zeer hoge celdichtheid en met serum in het kweekmedium. Terwijl de reden dat hoge celdichtheid de dendriet-bevorderend activiteit van BMP's is niet bekend verzwakt, is het waarschijnlijk dat het serum van deze activiteit verzwakt omdat BMP's binden gretig aan serumeiwitten. Interessant, serum zelf heeft een zwak dendriet-bevorderende activiteit in gekweekte sympathische neuronen 24, en onze voorlopige gegevens blijkt dat deze activiteit wordt gemedieerd door BMP's, die aanwezig zijn in de meeste, zo niet alle commerciële sera. BMP's zijn ook aanwezig in Matrigel, en waarschijnlijk bemiddelen zijn dendriet-bevorderende activiteit. Een derde factor die de dendriet-bevorderend activiteit van BMP's kunnen van invloed is onzorgvuldige behandeling en opslag van BMP. Bewaar geen BMP voorraad oplossingen bij een concentratie van minder dan 0,1 mg / ml. Het is belangrijk om niet te laten BMP bestand of een werkende oplossingen te worden erg basic en we raden bufoverschrijvingen worden gebruikt om de balans op oplossingen te verdunnen hebben een pH van 4,5 ± 0,05. Krachtig Meng alle oplossingen voordat aliquoting maar niet zo krachtig dat oplossingen schuim, en alleen polypropyleen buizen omdat BMP's hebben de neiging vast te houden aan andere kunststoffen te gebruiken. Niet bewaren fracties in diepvriezers, dat een automatische ontdooiing functie hebben, omdat de fietsen van de temperatuur voldoende is om de activiteit van BMP-7 te vernietigen. Het is sterk aangeraden dat BMP-oplossingen worden bewaard bij -80 ° C en dat vries-dooi een minimum worden beperkt (we niet bevriezen-ontdooien meer dan 2-3 keer). Vergelijkbare voorzorgsmaatregelen moeten worden gebruikt in de behandeling van Matrigel. Ook wordt aanbevolen dat Matrigel langzaam ontdooid bij 4 ° C. Matrigel niet van invloed is dendritische groei wanneer gebruikt voor het voorstrijken ondergronden voorafgaand aan de beplating neuronen, het is alleen effectief wanneer het wordt toegevoegd aan het kweekmedium van de gevestigde neuronale celkweken 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de financiering van de National Institutes of Health (subsidies R21 NS45037 en R01 ES014901).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslips | Bellco Glass | 1943-10012 | 12 mm Round Coverslip #1 Thickness, German glass |
| Bent tip pipets | Bellco Glass | 1273-50003 | |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P0899-100MG | Stock solution 1 mg/ml |
| Distilled water | GIBCO, by Life Technologies | 15230 | |
| Fine forceps Dumont no. 4 and 5 | Fine Science Tools | 11252-30 11241-30 | |
| 20-gauge needles | BD Biosciences | 305176 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Invitrogen | 11415 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | 4176 | 1 mg/ml |
| Dispase | Roche Group | 04942078001 | 5 mg/ml |
| Hank’s balanced salt solution( -Ca,-Mg) | Invitrogen | 14185-052 | |
| DMEM Low glucose | Invitrogen | 11885 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 20 mM |
| Insulin/Transferrin/ Selenium | Invitrogen | 51500-056 | 100X |
| Fatty-acid free BSA | Calbiochem | 126609 | |
| NGF | Harlan Laboratories | 5017 | |
| Ham F-12 nutrient medium (F-12) | Invitrogen | 11765 | |
| Cytosine arabinoside | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | Avoid repeated freeze-thaw cycles |
| BMP-7 | R&D Systems | 345-BP BMP7-07H | BMPs 4, 5 and 6 work equally as well as BMP-7 and are sometimes easier to obtain commercially |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Mouse anti-rat MAP2 antibody | Sternberger Monoclonals Inc. | SMI52 | 1/5000 |
| Alexa Fluor 546 goat-anti-mouse | Invitrogen | A11003 | 1/10000 |
| Mounting media | Molecular Probes, Life Technologies | P7481 |
References
- Purpura, D. P. The Neurosciences: A Study Program. Quarton, Q. C., Melnechuk, T., Schmitt, F. O. , Rockefeller University Press. 372-393 (1967).
- Purves, D. Functional and structural changes in mammalian sympathetic neurons following interruption of their axons. J. Physiol. 252, 429-463 (1975).
- Purves, D. A Trophic Theory of Neural Connections. , Harvard University Press. (1988).
- Miller, J. P., Jacobs, G. A. Relationships between neuronal structure and function. J. Exp. Biol. 112, 129-145 (1984).
- Schuman, E. M. Synapse specificity and long-term information storage. Neuron. 18, 339-342 (1997).
- Sejnowski, T. J. The year of the dendrite. Science. 275, 178-179 (1997).
- Berger-Sweeney, J., Hohmann, C. F. Behavioral consequences of abnormal cortical development: insights into developmental disabilities. Behav. Brain Res. 86, 121-142 (1997).
- Connors, S. L. Fetal mechanisms in neurodevelopmental disorders. Pediatric Neurology. 38, 163-176 (2008).
- Pardo, C. A., Eberhart, C. G. The neurobiology of autism. Brain Pathology (Zurich, Switzerland). 17, 434-447 (2007).
- Zoghbi, H. Y. Postnatal neurodevelopmental disorders: meeting at the synapse. Science. 302, 826-830 (2003).
- de Ruiter, J. P., Uylings, H. B. Morphometric and dendritic analysis of fascia dentata granule cells in human aging and senile dementia. Brain Res. 402, 217-229 (1987).
- Flood, D. G., Coleman, P. D. Hippocampal plasticity in normal aging and decreased plasticity in Alzheimer's disease. Prog. Brain Res. 83, 435-443 (1990).
- Jagadha, V., Becker, L. E. Dendritic pathology: an overview of Golgi studies in man. Can. J. Neurol. Sci. 16, 41-50 (1989).
- Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. I. Conditions under which neurons form axons but not dendrites. Dev. Biol. 128, 324-336 (1988).
- Tropea, M., Johnson, M. I., Higgins, D. Glial cells promote dendritic development in rat sympathetic neurons in vitro. Glia. 1, 380-392 (1988).
- Lein, P. The effects of extracellular matrix and osteogenic protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. Int. J. Dev. Neurosci. 14, 203-215 (1996).
- Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15, 597-605 (1995).
- Lein, P. J., Higgins, D. Laminin and a basement membrane extract have different effects on axonal and dendritic outgrowth from embryonic rat sympathetic neurons in vitro. 136, 330-345 (1989).
- Higgins, D., Lein, P. J., Osterhout, D. J., Johnson, M. I. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , The MIT Press. 177-295 (1991).
- Beck, H. N., Drahushuk, K., Jacoby, D. B., Higgins, D., Lein, P. J. Bone morphogenetic protein-5 (BMP-5) promotes dendritic growth in cultured sympathetic neurons. BMC Neurosci. 2, 12-12 (2001).
- Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neurosci. Lett. 245, 131-134 (1998).
- Lein, P. J. Glia induce dendritic growth in cultured sympathetic neurons by modulating the balance between bone morphogenetic proteins (BMPs) and BMP antagonists. J. Neurosci. 22, 10377-10387 (2002).
- Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D., Johnson, M. I. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 177-205 (1991).
- Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. II. Serum promotes dendritic growth. Dev. Biol. 128, 337-348 (1988).
