Summary
Wir beschreiben ein Protokoll für die Verwendung Knochenmorphogenetischem Protein-7 (BMP-7) oder Matrigel, um selektiv zu induzieren dendritisches Wachstum in Original-sympathischen Neuronen dissoziiert von der oberen Halsganglien (SCG) der perinatalen Ratten.
Abstract
Die Form der dendritischen Dorn bestimmt die gesamte synaptischen Eingang ein Neuron erhält 1-3 können, und beeinflusst die Art und Verteilung dieser Eingänge 4-6. Veränderte Muster des dendritischen Wachstums und Plastizität sind mit beeinträchtigter Funktion neurobehavioral in experimentellen Modellen 7 zugeordnet und werden gedacht, um zu klinischen Symptomen in beiden neurologische Entwicklungsstörungen 8-10 und 11-13 neurodegenerativen Erkrankungen beobachtet beitragen. Solche Beobachtungen unterstreichen die funktionelle Bedeutung der exakt regulieren dendritische Morphologie, und legen nahe, dass Identifizierung von Mechanismen, dendritische Wachstum steuern nicht nur das Verständnis für, wie neuronale Konnektivität wird während der normalen Entwicklung geregelt, kann aber auch einen Einblick auf neue therapeutische Strategien für die verschiedensten neurologischen Erkrankungen.
Mechanistische Untersuchungen von dendritischen Wachstum würde durch die Verfügbarkeit o erleichtert werdenfa-Modell, das Neuronen experimentell aus einem Zustand, in dem sie nicht zu einer Verlängerung Dendriten auf, in dem sie einen dendritischen Dorn vergleichbar mit der von ihren Pendants in vivo erarbeiten geschaltet werden können. Primäre Kulturen von sympathischen Neuronen losgelöst von der überlegenen zervikalen Ganglien (SCG) der perinatalen Nager bieten ein solches Modell. Wenn in einem definierten Medium in Abwesenheit von Serum-und Ganglien-Glia-Zellen kultiviert werden, zu erweitern sympathischen Neuronen einen einzigen Vorgang, der axonalen ist, und dieser Zustand hält für unipolare Wochen bis Monate in Kultur 14,15. Jedoch löst die Zugabe von entweder Knochenmorphogenetischem Protein-7 (BMP-7) oder 16,17 Matrigel 18 mit dem Kulturmedium diese Neuronen, mehrere Prozesse, die die morphologische, biochemische und funktionelle Kriterien für Dendriten erstrecken. Sympathischen Neuronen losgelöst von der SCG der perinatalen Nagetiere und unter definierten Bedingungen gewachsen sind eine homogene Population von Neuronen 19, die gleichmäßig auf die Dendriten-Aktivität von Matrigel, BMP-7 und anderen BMPs der decapentaplegisch (dpp) und 60A Unterfamilien 17,18,20,21 reagieren. Wichtig ist, tritt Matrigel-und BMP-induzierte Dendritbildung in der Abwesenheit von Änderungen der das Überleben der Zelle oder axonalen Wachstums 17,18.
Hier beschreiben wir, wie Sie dissoziierten Kulturen sympathischer Neurone aus dem SCG der perinatalen Ratten abgeleitet, so dass sie in Reaktion auf die selektive Dendriten-Aktivität von Matrigel oder BMPs sind.
Protocol
1. Vorbereitung von Kulturmedium (C2-Medium)
- Fügen Sie den folgenden, in der Reihenfolge aufgeführt, zu einer sterilen Einweg 500 ml Erlenmeyerkolben:
Betrag Komponente Endkonzentration 190 ml DMEM (low Glukose) N / A 10 ml fettsäurefrei BSA (20mg/ml in DMEM) 50 ug / ml 2,8 ml L-Glutamin 1,4 mM 4 ml Insulin / Transferrin / Selen (100x) 10 ug / ml Insulin 5,5 ug / ml Transferrin 38,7 nM Selen 0,4 ml NGF (125 pg / ml) 100 ng / ml 200 ml Ham F-12 N / A - Vorsichtig schwenken to Mix und aliquote 10 ml pro Röhrchen in 17 x 100 sterile Schnappdeckel Röhren.
- Bei -80 ° C
- Wichtige Hinweise:
- Auftauen NGF unmittelbar vor dem Gebrauch.
- Vor Aliquotieren die NGF-Stammlösung, Precoat die Innenwände der Gewebekultur-Plastik serologische Pipette mit Protein zu minimieren Verkleben von NGF an dem Kunststoff. Einfachste Ansatz besteht darin, die DMEM Mischung, welche die BSA mehrmals pipettieren. Man spült die NGF mehrfaches mit dem DMEM Mischung.
- Fügen Sie F-12 zuletzt, weil freies Cystein kann Disulfidbindungen in dem Insulin zu destabilisieren.
- Nicht in Mengen einfrieren größer als 10 ml, weil CaPO 4 Kristalle bilden können,
- Nicht einfrieren und auftauen C2 Medium mehr als 2 mal.
2. Vorbereitung der Deckgläschen
- Wir haben festgestellt, dass nur feine deutsche Deckgläsern konsequent arbeiten in diesem Protokoll (siehe Tabelle 1 für empfohlene Quell-und Katalog-Nummer).
- Fügen Sie 75-100 ml 70% Salpetersäure auf 300 ml Glas-Probe Flaschen mit Polytetrafluorethylen (PTFE oder Teflon) Deckel-Liner (Fisher Katalog # 09-911-765).
- Das Tragen von Handschuhen, Deckgläser Tropfen eins nach dem anderen in die Salpetersäure-Lösung. Fügen Sie genug Deckgläser, um eine Schicht nicht mehr als 2-3 Deckgläser dick auf dem Boden des Glases zu machen.
- Schütteln Sie die Behälter mit den Deckgläsern für 6-8 Stunden bei Raumtemperatur auf einem Schüttler Satz für nicht mehr als 185 Umdrehungen pro Minute.
- Arbeiten in einem Abzug vorsichtig dekantiert man die Säure und entsorgen nach den örtlichen Bestimmungen. Spülen Sie Deckgläschen einmal mit ultrareinem Gewebekultur-grade Wasser, dann fügen Sie 75-100 ml Wasser in den Behälter. Deckgläser kann mehrmals gespült werden, wenn das Wasser trüb wird. Vorsichtig über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Schüttler Satz für nicht mehr als 185 rpm schütteln.
- Wiederholen Sie diese Schritte aus Salpetersäure / Gewebekultur-grade Wasser täglich für insgesamt 3 Tage.
- Man dekantiert die endgültigeGewebekultur-grade Wasser und fügen Sie genug Aceton zu bedecken gerade knapp die Deckgläser.
- Dekantieren dieses Aceton und richtig entsorgen.
- Übertragen auf ein Deckgläschen 150 mm Glas-Petrischale. Fügen Sie genug Aceton zu bedecken gerade knapp die Deckgläser. Sicherstellen, dass die Deckgläser sind in einer einzigen Schicht in der Schale.
- Lassen Sie das Aceton über Nacht verdunsten in einem Abzug.
- Bake Deckgläsern in einem Trockenofen bei 180 ° C für 1,5 Stunden zu sterilisieren.
3. Vorbereitung der Deckgläser für Kultur
- Am Tag vor der Dissektion, fügen Sie ein Deckglas (hergestellt wie oben beschrieben) in jede Vertiefung einer 24 Well-Gewebekulturplatte mit steriler Technik. Geben Sie 200 ul sterilem Poly-D-Lysin-Lösung (100 mg / ml in 0,5 M Tris-Puffer, pH 8) in jede Vertiefung und speichern Sie die Platte bei 4 ° C über Nacht.
- Der Tag der Dissektion, und im Idealfall vor Beginn der Dissektion, saugen Sie den Poly-D-Lysin-Lösung aus jeder Vertiefung und Waschen Sie jede Vertiefung 5 malmit sterilen Gewebe-Kultur reines Wasser.
- Geben Sie 200 ul DMEM mit niedrigem Glucosegehalt auf jeder Platte und Speicher in 37 ° C Inkubator. Etwa 1 Stunde vor dem Beschichten Zellen, entfernen DMEM mit niedrigem Glucosegehalt und 250 ul C2 Medium pro Vertiefung. Shop-Platten bei 37 ° C unter 5% CO 2, bis die Zellen sind bereit zu sein vernickelt.
4. Dissection und Isolierung des Ganglion cervicale superius
- Dissoziierten Kulturen von sympathischen Neuronen sind in der Regel durch Dissoziation von cervicale superius Ganglien (SCG) von pränatalen geerntet (embryonaler Tag 19-21) Rattenjungen vorbereitet, weil es weniger Gliazellen sind. Dies kann jedoch dasselbe Protokoll erfolgreich mit frühen postnatalen (1 bis 3 Tage alt) Rattenjungen oder perinataler Maus Welpen verwendet werden.
- Einschläfern trächtigen Ratten über CO 2-Inhalation. Rasieren Sie den Bauch und waschen Sie die Haut mit 70% Ethanol. Entfernen Sie die Uterushörner unter sterilen Bedingungen und platzieren Sie die Uterushörner in einem sterilen 150 mm Petrischale. VermeidenSchäden an den Därmen oder anderen inneren Organen des Damms während der Dissektion.
- Legen Sie die Petrischale mit den Welpen auf einen Topf mit Eis, um die embryonale Jungtiere zu betäuben. Sezieren die Embryonen frei von der Uterushorn und Fruchtwasser Membranen. Schneiden Sie das Rückenmark eines jeden Welpen entlang der Mittellinie unter der Schulter, um die Welpen einschläfern. Dies gilt auch durchtrennt die Vena Cava, die Blutung reduziert aus der Halsschlagader beim Präparieren der SCG. Sobald freipräpariert des Uterushorns, Ort Embryonen in einem sterilen Leibovitz L-15-Medium (oder einem Luft-gepuffertem Medium) mit Penicillin und Streptomycin ergänzt.
- Legen Sie die Embryonen auf dem Rücken auf einer 150 mm Petrischale mit Sylgard zur Hälfte gefüllt. Mit einer sterilen 20-Gauge-Nadel, Pin Brustkorb und Kopf, sanft Überstreckung des Halses, die Dissektion der SCG erleichtert.
- Machen Sie einen Einschnitt an der Mittellinie entlang des Halses auf der Ebene der Schlüsselbeine, die submandibularis offenbaren. Entfernen Sie die Drüsen mit einer feinen Pinzette (no. Nr. 4 oder Nr.. Dumont 5) zum Freilegen der Muskelschicht.
- Verwenden Sie die feinen Pinzette, um den M. sternocleidomastoideus in der Nähe des Schlüsselbeins zu schneiden. Dann heben Sie vorsichtig einschneiden und den M. omohyoideus neben der Luftröhre. Dieser Muskel ist sehr dünn, so vermeiden Schneiden zu tief, um nicht zu zerreißen die zugrunde liegende Arteria carotis und SCG. Sobald diese Muskel-Schichten entfernt werden, sollte der Arteria carotis und der Vagus-Nerv deutlich sichtbar sein.
- Die SCG liegt knapp unterhalb der Gabelung der Halsschlagader. Mit feinen Pinzette (Nr. 4 oder Nr.. 5), stumpf zu zerlegen Gewebe von beiden Seiten der Halsschlagader das Ganglion freizulegen. Mit zwei feinen Pinzetten, fassen Sie die Halsschlagader nur oberhalb und unterhalb der rostralen und kaudalen Enden der SCG, bzw. um den Abschnitt der Halsschlagader, die oberhalb der SCG sowie die SCG selbst zu entfernen. Es ist wahrscheinlich, dass das Ganglion nodosum, die neben der SCG in diesem Stadium der Entwicklung befindet, wird auch bei diesem Schritt entfernt werden. Die Ganglien nodosum kann identifiéd durch seine runde Form und die große Vagusnerv, der von es. Dies liegt an einem der Zweige der Halsschlagader. Im Gegensatz dazu wird der SCG mandelförmig und liegt direkt unter der Gabelung der Halsschlagader. Setzen Sie den sezierten Gewebes in ein steriles 35 mm Kulturschale mit L-15-Medium und Antibiotika. Entfernen Sie den SCG aus aller Welpen vor voran, um die nächsten Schritte.
- Mit einer feinen Pinzette vorsichtig trennen den SCG aus der Halsschlagader und alle anderen Gewebe entfernt während der Dissektion (insbesondere der Vagusnerv und Ganglion nodosum). Verwenden feinen Pinzette, um die Kapsel von den Ganglien zu entfernen. Dies reduziert die Anzahl von nicht-neuronalen Zellen in Kultur. Übertragen Sie die Ganglien zu einem anderen sterilen 35-mm-Schale mit L-15-Medium.
- Um die SCG distanzieren, entfernen Sie die L-15-Medium und ersetzen mit 2 ml Collagenase (Endkonzentration 1 mg / ml) / Dispase (Endkonzentration 5 mg / ml) in Calcium-und Magnesium-freie Hanks balanced salt solution. Incubate bei 37 ° C für 40 Minuten.
- Übertragen Sie die SCG in ein steriles 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen und bringe das Volumen auf 10 ml mit L-15 mit BSA (Endkonzentration 2.1 mg / ml) ergänzt. Zentrifuge bei 200 × g bei Raumtemperatur für 5 Minuten. Überstand verwerfen und waschen Sie noch einmal mit L-15 mit BSA ergänzt.
- Nach dem zweiten Waschen, entfernen Sie alle L-15 und resuspendieren Sie das Ganglien in ~ 2 ml Medium C2. Man reibt die Zellen unter Verwendung eines feuerpolierte gebogenen Spitze Pipette, vergewissern Sie die Pipette mit BSA/L15 beschichtet wird, bevor Verreibung zu minimieren Anhaften von Zellen auf das Glas. Man reibt sanft 3-4 mal. Lassen Sie die großen Klumpen für ca. 1 Minute absetzen und übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml konischen Röhrchen. Fügen Sie weitere C2 Medien auf die verbleibende SCG und verreiben. Nach Trocknung der Klumpen absetzen, übertragen Sie die Zellsuspension aus der zweiten Verreibung zu, dass nach der ersten Verreibung gesammelt. Wiederholen Sie diesen Vorgang mehrmals, bis die Ganglien meist dissoziiert sind. Discard alle verbleibenden Klumpen nach dem vierten Verreibung.
- Für Zellen, losgelöst von einem Wurf von jungen Ratten (in der Regel 12 bis 16 Welpen), bringt das Gesamtvolumen des Mediums in der Zell-Suspension auf 8-10 ml durch Hinzufügen zusätzlicher C2 Medium. Erythrozyten vorsichtig resuspendieren mit einer Pipette entfernen und eine kleine Teilmenge, um die Zelldichte zu bestimmen. Stellen Sie die Lautstärke der Zellsuspension zu 2X die Zelldichte in der Kultur gewünscht zu erreichen, und dann, sicher zu sein, um die Zellen in Suspension, 250 ml Aliquot der Zellsuspension pro Vertiefung zu halten. Für morphometrische Studien des dendritischen Wachstums wir in der Regel Platte Zellen mit geringer Dichte (~ 5 × 10 4 Zellen pro Vertiefung) in 24-Well-Platten.
- Unser Labor bebrütet SCG Kulturen in Exsikkatoren Glas und nicht direkt in einem CO 2-Inkubator. Wir tun dies, weil sympathischen Neuronen in serumfreiem Medium gezüchtet bessere Leistung mit einem etwas höheren CO 2-Konzentration (etwa 6,5%). Darüber hinaus verwenden wir keine Antibiotika in der our Medien, da es das Neuritenwachstum und Aufrechterhaltung Kulturen in den Exsikkator inhibiert scheint die Ausbreitung der Kontamination zu minimieren, wenn sie in einer Untergruppe von Kulturen entwickelt. Mit diesem System, wir routinemäßig pflegen SCG Kulturen für bis zu 8 Wochen. Einmal vergoldet, SCG Kulturen werden auf dem Porzellan Exsikkator Platte in Glas Exsikkatoren mit sterilem Wasser in den Boden gelegt. Ungefähr 120 ml CO 2 in den Exsikkator Vor dem Verschließen zu und Anordnen des gesamten Exsikkator in einen Inkubator Satz bei 35,5 ° C injiziert
5. Fütterung und Pflege der Kulturen
- Kulturen werden in der Regel 3 mal pro Woche gefüttert, mit dem ersten Austausch von Medien vorkommenden 24 Stunden nach der Beschichtung. Mit einem sterilen gebogenen Spitze Pipette vorsichtig etwa die Hälfte der Medien pro Well zurückzutreten. Mit einem sauberen sterilen gebogenen Spitze Pipette, ersetzen Sie das Volumen des Mediums mit frischem C2 entfernt.
- Um nicht-neuronalen Zellen aus der Kultur zu beseitigen, die Anti-mitotischen Wirkstoff cytosine-D-arabinofuranosid (ARA-C, Endkonzentration 1-2 um) ist typischerweise mit dem Kulturmedium in der ersten Medienaustausch-/-speicherungsvorrichtung (z. B. 24 Stunden nach dem Ausplattieren) für 48 Stunden zugegeben. Diese Konzentration von Ara-C ist in der Regel ausreichend, um alle nicht-neuronalen Zellen zu entfernen. Wenn zusätzliche ARA-C Behandlung erforderlich ist, empfiehlt es sich, dass diese jede andere Fütterung eine toxische Wirkung auf die Neuronen zu minimieren getan werden.
6. Induktion von dendritischen Wachstums mit Matrigel oder BMP-7
- Um das dendritische Wachstum zu induzieren, wird Matrigel oder BMP-7 zu den Kulturen zugegeben, nachdem nicht-neuronalen Zellen eliminiert wurden und ARA-C-Spiegel in den Kulturen werden deutlich reduziert. Normalerweise fügen wir Matrigel oder BMP-7 an dem Medium am Tag 5 in vitro, aber das dendritische Wachstum kann durch Matrigel oder BMP-7 zu jedem Zeitpunkt in vitro zugesetzt induziert werden. Matrigel oder BMP-7 ist mit dem C2 zugesetzt und Kulturen zugeführt werden, wie oben beschrieben.
- Matrigel-und BMP-induzierte dendritischen Wachstums ist an der Zeitund konzentrationsabhängig. Für die maximale Wirkung wird Matrigel bis C2 in einer Endkonzentration von 50-75 g / ml zugegeben, BMP-7 ist mit dem C2-Medium bei einer Endkonzentration von 50 ng / ml zugegeben. Matrigel Konzentrationen von mehr als 100 pg / ml oder BMP-7-Konzentrationen von mehr als 100 ng / ml festgestellt wurden, um neuronale Toxizität verursachen können. Dendritische Prozesse (wie von morphologischen Kriterien bestimmt) werden etwa 48 Stunden nach der ersten Exposition gegen Matrigel oder BMP-7 bei maximal wirksamen Konzentrationen deutlich. Um robuste dendritischen Wachstum zu induzieren, werden Kulturen mit BMP-7-haltigem Medium bei jeder Fütterung zugeführt. Gleiche Ergebnisse wurden unter Verwendung von BMPs 2, 4, 5 und 6 in vergleichbaren Konzentrationen 20,21.
7. Immunzytochemische Analyse der BMP-7 induzierte Wachstum Dendritische
- Wenn die gewünschte Ausmaß der dendritischen Verzweigung erreicht worden ist, werden Kulturen fixiert mit 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer. Die beste Fixierung ist einechieved durch Ersetzen des halben Medium in gut mit 4% Paraformaldehyd und Wiederholen dieses Schritts 3-5 mal über 10-15 Minuten.
- Spülen Kulturen durch Ersetzen des halben 4% Paraformaldehyd mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) und Wiederholen dieses Schritts dreimal über 10 - 15 Minuten.
- Entfernen Sie das gesamte PBS und mit 200 ul 0,1% Triton X-100 in PBS in jede Vertiefung für 5 Minuten bei Raumtemperatur, um die Zellen permeabilisiert.
- Nehmen Sie Triton-Lösung durch Absaugen und mit 200 ul pro Vertiefung Blocking-Puffer (PBS mit 5.3% BSA und 1% Ziegenserum ergänzt). Inkubieren für 20-30 Minuten bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie die Blocking-Puffer und fügen Sie den primären Antikörper, Mikrotubuli-assoziierten Protein-2 (MAP2) bei 1:2000 verdünnt - 1:5000 in Blocking-Puffer. Inkubieren Kulturen für 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C
- Entfernen Sie die primäre Antikörper-Lösung, Waschen der Kulturen mit PBS dreimal über 15 Minuten bei Raumtemperatur.
- Inkubieren der Kulturen mit dem sekundären Antikörper, verdünnt in PBS mit 1% BSA für 1-2 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln.
- Die sekundäre Antikörperlösung und wasche die Kulturen dreimal mit PBS über 10-15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln.
- Berg Deckgläser auf Objektträger Zelle nach unten in einen Tropfen der wässrigen Medium auf der geeigneten pH für die Fluorochrom markiert an den sekundären Antikörper. Halten Sie die Folien bei Raumtemperatur über Nacht, damit der Einbau halbtrocken. Objektträger bei 4 ° C bis Bildgebung.
- Die Objektträger auf Raumtemperatur, bevor bildgebende Gleichgewicht zu bringen. Erwerben fluoreszierenden Bildern mit einem Phasenkontrast-Mikroskop für Epifluoreszenz ausgestattet. Typischerweise kann der gesamte dendritischen Dorn eines einzelnen Neurons gefangen mit einem 20x-Objektiv und entsprechenden Filtern werden.
8. Repräsentative Ergebnisse
Sympathischen Neuronen losgelöst von der SCG der perinatalen rats gewachsen und in der Abwesenheit von Serum und Ganglien-Gliazellen nicht, MAP2 immunpositiven Verfahren (1) erstrecken, sondern typischerweise nur eine einzige erstrecken axonalen Verfahren 14,15. Die Exposition gegenüber BMP-7 (Abb. 1) oder Matrigel induziert die Bildung von zahlreichen Prozessen, die die morphologischen, biochemischen und funktionellen Kriterien von Dendriten 17,18 gerecht zu werden. Die Dendriten-fördernde Aktivität entweder Matrigel oder BMP-7 ist konzentrations-und zeitabhängige 17,18,20. Maximale dendritisches Wachstum beobachtet wird unter Verwendung von Konzentrationen von Matrigel zwischen 50 und 75 ug / ml oder BMP-7 zwischen 30 und 100 ng / ml und eine halb-maximale Effekte werden typischerweise bei BMP-7-Konzentrationen von etwa 2 ng / ml beobachtet. Jedoch können wesentliche Änderungen in dendritische Wachstum mit BMP-7-Konzentrationen so niedrig wie 300 pg / ml nachgewiesen werden. Die dendritischen Reaktion auf entweder Matrigel oder BMP-7 ist relativ langsam, mit <50% der Neuronen Ausbilden eines zweiten Prozesses innerhalb von 24 Stunden nach Exposition an entweder Dendriten-p ie Förderung Agenten. Jedoch innerhalb von 3 Tagen nach der ersten Exposition BMP-7, praktisch alle Neuronen auf maximal wirksame Matrigel oder BMP-7 Konzentrationen reagieren. Die Zahl der Dendriten pro Neuronen weiterhin mit kontinuierlichen Exposition gegenüber BMP-7 zu erhöhen, wobei der Großteil der Veränderung, die während den ersten 10 Tagen der Behandlung. Nach 4 Wochen, BMP-7-behandelten Neuronen haben in der Regel 6-8 primäre Dendriten, die sekundäre, tertiäre und quartäre sogar dendritischen Verzweigungen aufweisen 17. Dieser Anstieg der dendritischen Dorn tritt in der Abwesenheit von jeder wesentlichen Veränderung in Wachstum der Nervenfasern, und vergleichbare dendritischen Reaktionen ausgelöst werden kann, die ähnliche Konzentrationen von BMPs 2, 4, 5 oder 6 20,21. Dendritische Wachstum kann durch Co-Kultivierung sympathischen Neuronen mit endogenen Ganglien-Gliazellen 15,22 ausgelöst werden, jedoch ist die dendritische deutlich langsamer Reaktion unter diesen Bedingungen.
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Abbildung 1. BMP-7 fördert dendritischen Wachstums in kultivierten sympathischen Neuronen. Nicht-neuronale Zellen wurden aus Kulturen SCG durch Behandlung mit anti-mitotische für 48 Stunden ab dem Tag 2 in vitro eliminiert. Beginnend am Tag 5 in vitro Kulturen wurden entweder mit Kontrollmedium (A) oder ein Medium mit BMP-7 bei 50 ng / ml (B) ergänzt behandelt. Am Tag 11 in vitro (nach 5 Tagen der Behandlung BMP), Kulturen mit mAk konnte MAP2 immungefärbt, vor allem ein Protein von Dendriten und neuronalen Zellkörper. Wie in repräsentativen Fluoreszenz gezeigten Mikroaufnahmen fehlt Neuronen unter der Steuerung Bedingungen gezüchtet Dendriten wie durch das Fehlen von MAP-2 immunpositiven Verfahren Dendriten (A) belegt ist; dagegen Neuronen zu BMP-7 ausgesetzt (B) weisen typischerweise mehrere sich verjüngende MAP-2 immunpositiven Dendriten.
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Discussion
Die Vorteile dieses Modells sind: (a) werden die Kulturen einer homogenen Population von sympathischen Neuronen frei von anderen Zelltypen 17,23 umfasst, (b) die Anforderungen der Wachstumsfaktor sympathischen Neuronen sind gut etabliert, das erlaubt die Verwendung von definiertes Medium, und eine Vielzahl von definierten Medien und Substrate eignen sich gut für das Wachstum und die Aufrechterhaltung sympathischen Neuronen 23; (c) Neuronen in diesen Kulturen gleichmäßig Reaktion auf die Dendriten-Aktivität von Matrigel, BMP-7 und anderen BMPs des dpp und 60A Unterfamilien 17,18,20,21, und (d) Matrigel-oder BMP-induzierte Dendritbildung in Abwesenheit von Änderungen des Zellüberlebens oder axonalen Wachstums 17,18. Dieses Modell erlaubt experimentellen steuern, wann das dendritische Wachstum ausgelöst wird, die es ermöglichen, synchronisiert Populationen von Neuronen in unterschiedlichen Stadien des dendritischen Wachstums, zB zu erhalten machen, unmittelbar vor der Bildung von Dendriten, während der primären dendritogenesis (die anfängliche Bildung von primären Dendriten) und während der späteren Stadien der Reifung dendritischer. Die wichtigsten Grenzen des Modells gehören die begrenzte Mengen an RNA-und Protein zur Verfügung aus einer typischen Präparation eines einzigen Wurf, die biochemische Untersuchungen beschränken kann, und einigen Schwierigkeiten bei der Manipulation der Genexpression. Jüngste Fortschritte in der Technik zur Expression von cDNA in primären neuronalen Zellkulturen werden schnell Überwindung dieses letztere Nachteil. Es gibt Publikationen, die Berichterstattung über die erfolgreiche Anwendung der Lipid-basierten Delivery-Systeme, Nukleofektion und Adenovirus-Vektoren zu kultivierten sympathischen Neuronen. Die berichteten Transfektionseffizienzen relativ niedrig (typischerweise im Bereich von 10-20% mit der Lipofektion oder Nukleofektion und bis zu 30-50% mit viralen Infektion), die ausreichend ist für Endpunkte auf einzelne Zelle Analysen, wie morphologische Analysen, kann aber Problematisch für viele biochemische Endpunkte.
Factors that kann mit BMP-induzierte dendritischen Wachstums in kultivierten sympathischen Neuronen stören zählen Kultivierung der Neuronen auf einem sehr hohen Zelldichte und einschließlich Serum im Kulturmedium. Obwohl der Grund, dass eine hohe Zelldichte der Dendriten-Aktivität von BMPs ist nicht bekannt, dämpft, ist es wahrscheinlich, dass das Serum diese Aktivität dämpft, weil BMPs gierig Serum-Proteine binden. Interessanterweise hat sich Serum schwach Dendriten-fördernde Aktivität in kultivierten sympathischen Neuronen 24, und unsere vorläufigen Daten deuten darauf hin, dass diese Aktivität von BMPs, die vorhanden sind in den meisten wenn nicht alle kommerziellen sera vermittelt wird. BMPs sind auch in Matrigel Gegenwart und wahrscheinlich vermitteln ihre Dendriten-fördernde Aktivität. Ein dritter Faktor, der die Dendriten-Aktivität von BMPs auswirken können, ist unsachgemäße Handhabung und Lagerung von BMPs. Lagern BMP Stammlösungen in einer Konzentration von weniger als 0,1 mg / ml. Es ist wichtig, nicht zulassen, BMP oder Lager funktionierende Lösungen zu werden, sehr einfach und wir empfehlen, dass bufFERS verwendet werden, um Lager für verdünnte Lösungen haben einen pH von 4,5 ± 0,05. Mischen Sie alle Lösungen energisch vor Aliquotierung aber nicht so kräftig, dass Lösungen Schaum, und verwenden Sie nur Polypropylenröhrchen weil BMPs zu anderen Kunststoffen Verkleben neigen. Bewahren Sie keine Aliquots in Gefrierschränken, die eine automatische Abtauung Funktion haben, weil der Kreislauf von Temperaturen reicht aus, um Aktivität des BMP-7 zu zerstören. Es wird dringend empfohlen, dass BMP-Lösungen bei -80 ° C gelagert werden und dass Einfrieren und Auftauen minimiert (wir wissen nicht einfrieren und auftauen mehr als 2-3 mal) werden. Ähnliche Vorsichtsmaßnahmen im Umgang mit Matrigel eingesetzt werden. Außerdem ist es empfehlenswert, Matrigel langsam bei 4 ° C aufgetaut werden Matrigel nicht zu induzieren, wenn sie das dendritische Wachstum Precoat Substraten vor dem Beschichten Neuronen, es ist nur wirksam, wenn zu dem Kulturmedium der etablierten neuronalen Zellkulturen 18 addiert.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde aus Mitteln des National Institutes of Health (Zuschüsse R21 R01 und NS45037 ES014901) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslips | Bellco Glass | 1943-10012 | 12 mm Round Coverslip #1 Thickness, German glass |
| Bent tip pipets | Bellco Glass | 1273-50003 | |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P0899-100MG | Stock solution 1 mg/ml |
| Distilled water | GIBCO, by Life Technologies | 15230 | |
| Fine forceps Dumont no. 4 and 5 | Fine Science Tools | 11252-30 11241-30 | |
| 20-gauge needles | BD Biosciences | 305176 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Invitrogen | 11415 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | 4176 | 1 mg/ml |
| Dispase | Roche Group | 04942078001 | 5 mg/ml |
| Hank’s balanced salt solution( -Ca,-Mg) | Invitrogen | 14185-052 | |
| DMEM Low glucose | Invitrogen | 11885 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 20 mM |
| Insulin/Transferrin/ Selenium | Invitrogen | 51500-056 | 100X |
| Fatty-acid free BSA | Calbiochem | 126609 | |
| NGF | Harlan Laboratories | 5017 | |
| Ham F-12 nutrient medium (F-12) | Invitrogen | 11765 | |
| Cytosine arabinoside | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | Avoid repeated freeze-thaw cycles |
| BMP-7 | R&D Systems | 345-BP BMP7-07H | BMPs 4, 5 and 6 work equally as well as BMP-7 and are sometimes easier to obtain commercially |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Mouse anti-rat MAP2 antibody | Sternberger Monoclonals Inc. | SMI52 | 1/5000 |
| Alexa Fluor 546 goat-anti-mouse | Invitrogen | A11003 | 1/10000 |
| Mounting media | Molecular Probes, Life Technologies | P7481 |
References
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