Diagnostisering lungetuberkulose med Xpert MTB / RIF Test

Summary

Den Xpert MTB / RIF test integrerer prøven dekontaminering, handsfree, on-board prøvebehandling, og ultra-sensitive Hemi-nestet PCR for samtidig påvisning av

Abstract

Tuberkulose (TB) på grunn av Mycobacterium tuberculosis (MTB) er fortsatt et stort folkehelseproblem: infeksjonen rammer opptil en tredel av verdens befolkning ^en, og nesten to millioner mennesker er drept av tuberkulose hvert år ^to Universell tilgang til høy kvalitet. er pasient-sentrert behandling for alle tuberkulosepasienter understreket av WHOs Stop TB Strategi. ³ Den raske påvisning av MTB i luftveiene prøver og medikamentell behandling basert på pålitelige legemiddelresistens testresultatene er en forutsetning for en vellykket gjennomføring av denne strategien. Men i mange områder av verden, avhengig TB diagnose fortsatt på ufølsomme, dårlig standardiserte sputum mikroskopi metoder. Ineffektiv TB påvisning og fremveksten og overføring av resistente MTB stammer stadig true global TB kontrollaktiviteter. ²

Effektiv diagnosen pulmonal tuberkulose krever tilgjengelighet - på en global skala - av stativardized, enkel å bruke, og robust diagnostiske verktøy som ville tillate direkte påvisning av både MTB kompleks og resistens mot viktige antibiotika som rifampicin (RIF). Sistnevnte Resultatet kan tjene som markør for multiresistent MTB (MDR TB) og har blitt rapportert hos> 95% av MDR-TB isolater. ^{4, 5} Den raske tilgjengeligheten av pålitelige testresultater er sannsynlig å direkte oversette til lyd pasientbehandling avgjørelser som til syvende og sist vil kurere den enkelte pasient og bryte den kjede av TB overføring i samfunnet. ²

Cepheid s (Sunnyvale, CA, USA) Xpert MTB / RIF ^{6 analysen, 7} oppfyller kravene skissert ovenfor i en bemerkelsesverdig måte. Det er en nucleic-syrer forsterkning test for 1) påvisning av MTB komplekse DNA i sputum eller konsentrerte sputum sedimenter, og 2) påvisning av RIF motstand-assosierte mutasjoner i rpoB genet ⁸ Den er utviklet for bruk med Cepheid sin GeneXpert Dx. System thved integrerer og automatiserer prøvebehandling, nukleinsyre forsterkning, og påvisning av målet sekvenser med real-time PCR og revers transkriptase PCR. Systemet består av et instrument, personlig datamaskin, strekkodeleser, og forhåndslastet programvare for å kjøre tester og vise resultatene. ⁹ Det sysselsetter én bruke engangs Xpert MTB / RIF patroner som holder PCR reagenser og vert PCR-prosessen. Fordi patronene er selvforsynt, er krysskontaminering mellom prøvene eliminert. ⁶ Gjeldende nukleinsyre forsterkning metoder som brukes for å oppdage MTB er sammensatte, arbeidskrevende, og teknisk krevende. Den Xpert MTB / RIF analysen har potensial til å bringe standardisert, følsom og veldig spesifikk diagnostisk testing for både tuberkulose og resistens til universell tilgang point-of-care innstillinger ^3, forutsatt at de vil kunne ha råd til det. For å lette tilgangen, har Stiftelsen for Innovative New Diagnostics (FINN) forhandlet betydeligvesentlige prisreduksjoner. Gjeldende FINN-forhandlede priser, sammen med listen over land kvalifiserte for rabatter, er tilgjengelig på Internett. ^Ti

Protocol

Standard to av de internasjonale standardene for tuberkulose Care opplyser at alle pasienter mistenkt for å ha pulmonal TB bør levere minst to sputum prøver for bakteriologisk undersøkelse. Når det er mulig, bør minst ett tidlig morgen prøven fås, som sputum samlet på denne tiden har den høyeste ytelsen. ^11. Xpert MTB / RIF-analysen kan brukes til sputum prøver eller konsentrerte sputum sedimenter fremstilt fra indusert eller hoste slim som er . enten syrefaste staver (AFB) smøre positive eller negative ^{6, 12, 13} Den analysen er beregnet for bruk med prøver fra pasienter for hvem det er klinisk mistanke om lunge-TB som har: 1) ikke mottatt anti-tuberkulosebehandling, 2 ) hadde <7 dagers behandling, eller 3) ikke har fått behandling i de siste 60 dagene. Gjør oppmerksom på at det ikke bør brukes for å overvåke effekten av medikamentell behandling ⁷ fordi bakteriell DNA kan vedvare etter antimikrobiell terapi.

1. Hoste sputum Prøver

Merk: Prosess bare så mange eksemplarer på en gang, så det er GeneXpert Dx systemmoduler tilgjengelig for å kjøre testen!

1. Label hver Xpert MTB / RIF patron med tilsvarende prøven ID.
2. Overfør 1,0 ml hoste sputum til en konisk, skrue-capped rør ved hjelp av en steril overføringspipetten. Alternativt kan hele prøven bli behandlet i den opprinnelige lekkasjefri sputum samling container.
3. Legg 2,0 ml Xpert MTB / RIF Sample Reagent (2:1; v / v) til hoste sputum ved hjelp av en steril overføringspipetten.
4. Sett på lokket, og rist røret kraftig 10-20 Ganger. Alternativt kan blandingen bli vortexed (30 sek).
5. La røret stå oppreist i 5 min ved romtemperatur.
6. Rist røret kraftig 10-20 ganger. Alternativt kan du bruke en vortex (30 sek).
7. La røret stå oppreist for en annen 10 min ved romtemperatur.
8. Inspiser prøvene: Prøvene skal flytende uten synlige klumper av slim.

2. Konsentrerte Sedimenter

Merk: Prosess bare så mange eksemplarer på en gang som det er GeneXpert Dx systemmoduler tilgjengelig for å kjøre testene!

1. Label hver Xpert MTB / RIF patron med tilsvarende prøven ID.
2. Overfør 1,5 ml Xpert MTB / RIF Sample Reagent til en konisk, skrue-capped rør ved hjelp av en steril overføringspipetten.
3. Legg til minst 0,5 ml konsentrert sediment til Sample Reagens inneholder rør ved hjelp av en steril overføringspipetten.
4. Sett på lokket, og rist røret vigorously 10-20 ganger. Alternativt kan du bruke en vortex (30 sek).
5. La røret stå oppreist i 5 min ved romtemperatur.
6. Rist røret kraftig 10-20 ganger. Alternativt kan du bruke en vortex (30 sek).
7. La røret stå oppreist for en annen 10 min ved romtemperatur.
8. Inspiser prøvene: Prøvene skal flytende uten synlige klumper av slim.

3. Lasting av Xpert MTB / RIF Cartridge

Merk: Start testen innen 30 minutter å legge prøven til patronen!

1. Sjekk etikettene på Xpert MTB / RIF patron og prøven ID.
2. Åpne kassetten lokket.
3. Bruke steril overføringspipetten forutsatt, aspirer den flytende prøven inn i overføringspipetten til menisken er over minstemålet og overføre prøven til den åpne porten på Xpert MTB / RIF patron.

Merknad:Tilsett langsomt å minimere risikoen for aerosol dannelse!

4. Lukk patronen lokket.

4. Starte Test

Merk: Før du starter testen, at GeneXpert Dx systemet er utstyrt med den GX2.1 programvaren, og den Xpert MTB / RIF-analysen er importert inn i programvaren ^9!

1. Slå på datamaskinen, og deretter slå på GeneXpert Dx instrumentet.
2. På skrivebordet i Windows, dobbeltklikker du GeneXpert Dx snarveisikonet.
3. Logg deg på GeneXpert Dx System programvare ved hjelp av ditt brukernavn og passord.
4. I GeneXpert Dx System klikker Opprett Test. Skann Cartridge Barcode vises dialogboksen.
5. I Sample ID-boksen, skanne eller skrive prøven ID.
6. Skanne strekkoden på Xpert MTB / RIF patron. Opprett Test vises.
7. Klikk Start Test
8. Åpne instrumentet modulen døren med blinkende grønt lys, og laste kassetten.
9. Lukk døren. Testen starter og lampen slutter å blinke og forblir konstant grønt. Når testen er ferdig, slår av lyset.
10. Vent til systemet slipper dørlåsen på slutten av løpet, deretter åpne modulen døren og ta ut kassetten.
11. Avhend brukte patroner i de aktuelle containere i henhold til institusjonens standard praksis.

5. Representative Resultater

Hver Xpert MTB / RIF kassett inneholder reagenser for påvisning av MTB komplekse og RIF motstand samt en prøvebehandling kontroll (SPC) for å kontrollere for tilstrekkelig behandling av målet bakterier og for å overvåke forekomsten av inhibitor (r) i PCR reaksjonen . Sonden Sjekk Control (PCC) bekrefter reagens rehydrering, PCR rør utfyllingkassetten, probe integritet, og fargestoff stabilitet. ⁹ Primerne i Xpert MTB / RIF analysen forsterke en del av rpoB genet som inneholder 81 basepar "core" regionen. Fem forskjellige farger fluorogenic nukleinsyre hybridisering sonder, kalt molekylære sjømerker, avhøre hele 81-BP kjerne. ¹⁴ Hvert molekylære fyrtårn var designet for å være så spesifikk at den ikke binde seg til målet sitt hvis målet sekvensen er forskjellig fra vill-type rpoB sekvens med så lite som en enkelt nukleotid substitusjon. Siden molekylær beacons fluorescens bare når de er bundet til sine mål, dvs. villtype rpoB sekvens, fravær av en av de fem fargene i analysen skille mellom konservert villtype sekvens og mutasjoner i kjernen regionen som er tilknyttet RIF motstand. ⁶

Preparatomtalen skal være positiv i en negativ prøve, og kan være negativ eller positiv i en positiv prøve. TestenResultatet vil bli "Ugyldig" hvis preparatomtalen ikke er oppdaget i en negativ test. Før starten av PCR reaksjonen, måler GeneXpert Dx System fluorescens signalet fra probene å overvåke perle rehydrering, reaksjon-tube fylling, sonde integritet og dye stabilitet. PCC passerer hvis fluorescens signalet fra probene oppfyller de fastsatte akseptkriterier. Resultatene tolkes av GeneXpert Dx system fra målte fluorescens signaler og innebygde beregning algoritmer og vises i Vis resultater vinduet ^9, som angitt nedenfor:

MTB Detected: MTB target DNA blir oppdaget, begge kontrollene, SPC og PCC, oppfyller tildelte akseptkriterier. Lavere Ct-verdier representerer en høyere start konsentrasjon av DNA mal; høyere Ct-verdiene representerer en lavere konsentrasjon av DNA malen. I MTB Oppdagede resultater "RIF Resistance oppdaget" (figur 1A), "RIF Resistance IKKE FUNNET" (

MTB Finner ikke: MTB target DNA er ikke registrert, begge kontrollene, SPC og PCC, møte de tildelte akseptkriteriene (figur 2).

Ugyldig: Tilstedeværelse eller fravær av MTB kan ikke fastsettes: SPC ikke oppfyller akseptkriterier, dvs. prøven ikke ble ordentlig behandlet, eller PCR ble hemmet (figur 3). Merk: Gjenta testen med ekstra eksemplar!

Feil: En eller flere av PCC resultatene mislykkede (ikke bestått). Både MTB og SPC vise noe resultat. Merk: Gjenta testen med ekstra eksemplar! Hvis PCC bestått (PASS), er feilen skyldes et system komponentfeil.

Figur 1: MTB target DNA blir oppdaget, begge kontrollene, SPC og PCC, oppfyller tildelte akseptkriterier. Lavere Ct-verdier representerer en høyere startkonsentrasjonen av DNA mal; høyere Ct-verdiene representerer en lavere konsentrasjon av DNA malen. I MTB Oppdagede resultater "RIF Resistance IKKE FUNNET" (figur 1A), "RIF Resistance oppdaget" (figur 1B), eller "RIF Resistance ubestemmelig" vises på en egen linje.

. Figur 1A MTB OPPDAGET; RIF Resistance ikke registreres, dvs. kun vill-type nukleinsyre sekvens av 81-BP RIF motstand-bestemme-regionen (RRDR) av rpoB genet var tilstede ^seks. Klikk her for å se større figur .

. Figur 1B MTB OPPDAGET; RIF Resistance OPPDAGET. Komplett faller ut av Probe B (pil), som dekker posisjonene 513-517 av R RDR av rpoB genet. ⁶ I eksemplet viste delvis sekvensering at rpoB genmutasjon D516V ble oppdaget. ⁸ Klikk her for å se større figur .

Figur 2 MTB target DNA ble ikke oppdaget;.. Begge kontrollene, SPC og PCC, møte de tildelte akseptkriteriene Klikk her for å se større figur .

. Figur 3 Ugyldig testresultatet, dvs. tilstedeværelse eller fravær av MTB kan ikke fastsettes: SPC ikke oppfyller akseptkriterier, fordi utvalget ikke ble ordentlig behandlet, eller fordi PCR ble hemmet.3547fig3large.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større figur.

Discussion

Den Xpert MTB / RIF-analysen integrerer prøve dekontaminering, handsfree, on-board prøvebehandling, og ultra-sensitive Hemi-nestet PCR for samtidig påvisning av MTB og RIF motstand, enten i hoste sputum eller konsentrerte sedimenter, i ett , lett å bruke systemet. Analysen analytiske deteksjonsgrensen ble funnet å være 131 CFU / ml av sputum. ⁶ Loggen-lineær sammenheng mellom Ct verdier og antall MTB celler presentere gjelder fra ¹⁰ februar til 10 juli CFU / ml av sputum. Som klinisk relevante MTB konsentrasjoner alle fall innenfor den lineære området av analysen, gir analysen semi-kvantitative estimater av den bakterielle belastningen. ⁷ Analysen krever kun moderat laboratorium infrastruktur og opplæring. Deteksjonsgrensen ligger minst to størrelsesordener lavere enn for konvensjonelle mikroskopi. ⁶ Spesifisitet er utmerket. Videre samtidig påvisning av RIF-resistant MTB er en betydelig fordel i innstillingen av point-of-care testing i tid med multiresistent tuberkulose. ³

Hittil kun begrensede publiserte data på analysen ytelse for diagnostisering pulmonal tuberkulose i kliniske settinger er tilgjengelig ^{12;. 13.} Xpert MTB / RIF-analysen samlede kliniske sensitiviteten oppdage MTB i sputum av pasienter med mistanke om pulmonal tuberkulose var 97,6% sammenlignet med kultur som referanse. Dette var funnene i en prospektiv multi-senter studie som involverte fem studiesteder (Lima, Peru, Baku, Aserbajdsjan, Cape Town og Durban, Sør Afrika, Mumbai, India) og totalt 1462 pasienter. Den samlede pre-test sannsynlighet for kultur-bekreftet TB i studien befolkningen var 50,7%. Sensitiviteten var 99,8% for smear-og kultur-positive saker og 90,2% for smøre-negative, kultur-positive tilfeller. Blant HIV-positive pasienter med pulmonal tuberkulose, var sensitiviteten for MTB / RIF test 93,9%, sammenlignet med 98,4% i. HIV-negative pasienter ¹² I en innstilling av lav TB prevalens, var den samlede avtalen for å avdekke MTB 89% sammenlignet med kultur, følsomheten var 98% for smear-positive og 72% for smøre-negative prøver, henholdsvis, og spesifisitet var utmerket. ¹³ Det var ingen signifikant forskjell i følsomhet mellom tester på ubehandlet sputum og de ​​på konsentrerte sedimenter. ^12. I den samme studien, MTB / RIF test korrekt oppdaget RIF motstand i 209 av 211 pasienter (99,1% sensitivitet) og i alt 506 pasienter med RIF følsomhet (100% spesifisitet), da sekvensering resultater ble tatt hensyn til. ^tolv Forfatterne fant at ytelsen for både sak deteksjon, og diskriminering av RIF motstand, var lik på tvers av ulike nettsteder, noe som tyder på at funnene er trolig være allment gjeldende. ^tolv Videre konsentrerte sedimenter av respiratoriske prøver andre enn sputum, som broncho-alveolar lavage og bronkierl sekreter, ble testet med sammenlignbare sensitivitet og spesifisitet. ¹³ Data om analysen prestasjon ved testing ekstra-pulmonal TB fremstår. ¹⁵

Global TB kontroll desperat behov for effektive verktøy som tillater rask diagnose av nye TB tilfeller og påvisning av RIF-resistente MTB i universell tilgang point-of-care innstillinger. ³ Gjeldende nukleinsyre forsterkning metoder som brukes for å oppdage MTB er sammensatte, arbeidskrevende, og teknisk krevende. Den Xpert MTB / RIF analysen har potensial til å bringe standardisert, følsom og veldig spesifikk diagnostisk testing for både TB og narkotika motstand mot disse innstillingene, forutsatt at de vil kunne ha råd til det. For å lette tilgangen, har Stiftelsen for Innovative New Diagnostics (FINN) fremforhandlet betydelige prisreduksjoner for Xpert MTB / RIF test. Gjeldende FINN-forhandlede priser, sammen med listen over land kvalifiserte for rabatter, er tilgjengelig på Internett. ^Ti

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xpert MTB/RIF test	Cepheid	GXMTB/RIF-10
Transfer pipettes	Sarstedt Ltd	86.1172.001
Conical tubes, 15 ml, 120 x 17 mm, PS	Sarstedt Ltd	62.553.542