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Medicine

Erstellen Starr stabilisierte Frakturen zur Beurteilung intramembranöse Ossifikation, Distraktionsosteogenese, oder Heilung von kritischer Größe Mängel

doi: 10.3791/3552 Published: April 11, 2012

Summary

Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur Stabilisierung von Frakturen langer Röhrenknochen, die über die Anwendung der modifizierten Ilizarov Fixateur externe beruht

Abstract

Beurteilung Modi Skelettreparatur notwendig für die Entwicklung von Therapien, um klinisch verwendet werden, um Frakturen. Mechanische Stabilität spielt eine große Rolle bei der Heilung von Knochenverletzungen. Im schlimmsten Fall mechanische Instabilität kann zu verzögerten oder nicht gewerkschaftlich beim Menschen führen. Allerdings kann auch Bewegung regen den Heilungsprozess. Bei Frakturen, die Bewegung Knorpel Formen haben, um die Fraktur Knochenenden zu stabilisieren, und dies Knorpel allmählich durch Knochen durch Rekapitulation des Entwicklungsprozesses von enchondralen Ossifikation ersetzt. Im Gegensatz dazu, wenn ein Knochenbruch starr stabilisiert ist Knochen bildet direkt über intramembranöse Ossifikation. Klinisch sowohl enchondralen und intramembranöse Ossifikation gleichzeitig auftreten. Um effektiv zu replizieren diese Verfahren Ermittler mit einer Nadel in die Markhöhle des gebrochenen Knochens durch Bonnarens 4 beschrieben. Diese experimentelle Methode bietet eine hervorragende seitliche Stabilität und ermöglicht RotatioNAL Instabilität zu bestehen. Allerdings kann unser Verständnis der Mechanismen, die diese beiden unterschiedlichen Prozesse regulieren auch experimentell durch Isolieren jeder dieser Prozesse verbessert werden. Wir haben eine Stabilisierung Protokoll, das Rotations-und seitlichen Stabilisierung liefert entwickelt. In diesem Modell ist intramembranöse Ossifikation die einzige Art der Heilung, die beobachtet wird, und Heilung Parameter können zwischen verschiedenen Stämmen von Mäusen 5-7, nach dem Aufbringen von bioaktiven Molekülen 8,9, nach der Änderung physiologische Parameter der Heilung 10 verglichen werden, nach der Änderung der Menge oder der Zeitpunkt der Stabilisierung 11 nach Distraktionsosteogenese 12, nach der Erzeugung eines nicht-Einheit 13, oder nach dem Erstellen einer kritischen Größe Defekt. Hier zeigen wir, wie man die modifizierte Ilizarov Fixateur für das Studium Tibia Frakturheilung und Distraktionsosteogenese bei Mäusen anzuwenden.

Protocol

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Alle Arbeiten wurden von der UCSF Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt und entsprechen den nationalen Richtlinien.

1. Vorbereitung der Fixatoren vor der Operation

  1. Vor dem Erstellen stabilisierte Fraktur, braucht man, um das benutzerdefinierte Design-Fixateur externe Gerät zusammenzubauen. Dem individuell gestalteten externe Fixation Rahmen bestand aus zwei Aluminium-Ringe von drei Edelstahl-# 0/56 Gewindestangen, 8 # 2/56 Sechskantmuttern und 17 passende Befestigungsschrauben (Small Part Inc., Miami Lakes, FL 3) stabilisiert.
  2. Zwei Aluminium-Ringe sind pro Fraktur benötigt. Um einen Ring montieren 4 # 2/56 Sechskantmuttern (kleiner Teil Inc., Miami Lakes, FL) und passende Schrauben in die entsprechenden Löcher, sollten sie bleiben locker. Dies wird der proximale Ring sein. An dem distalen Ring montieren 3 Schrauben und Muttern, nicht erneut nicht voll anziehen.

2. Anästhesie-, Bruch der Schöpfung, und Fixateur

  1. Mäuse (Alter, Geschlecht, Körper undGew. werden von den Kunden bestimmt) werden anästhesiert durch intraperitoneale Injektion von Ketamin 50mg/ml, 0,5 mg / ml Medetomidin (0,03 ml / Maus).
  2. Bewerben Auge Schmiermittel für die Augen der Mäuse und setzen Sie ein Stück Klebeband über ihren Kopf, ihre Augen während des Verfahrens zu schützen.
  3. Das Tier wird auf einem Heizkissen für den Rest des Verfahrens platziert.
  4. Transfix die proximale und distale Metaphyse der linken Tibia mit vier 0,25 mm sterilen Insekten Stifte (Korrosionsschutzbinde: Fine Science Tools, Foster City, CA) durch Anbringen der Stifte zu einem Dremel-Werkzeug und Bohren sie durch den Knochen.
  5. Pins sind senkrecht zu der Längsachse der Tibia, und 90 ° zueinander. Mindestens 10 mm zwischen dem proximalen und distalen Stiften.
  6. Positionieren Sie den ersten Ring über den proximalen Stifte mit den Muttern nach innen, in Richtung der Pins. Sichern Sie die Stifte in den Ring hält das Schienbein zentral innerhalb der Alu-Ring positioniert.
  7. Positionieren Sie den zweiten Ring unterhalb des diStal Stifte und sichern Sie die Stifte in den Ring mit den Sechskantmuttern wie zuvor. Fügen Sie die vierte Mutter-Bolzen Kombination mit dem distalen Fixateur.
  8. Erstellen Sie die Querfraktur durch Drei-Punkt-Biegung mit einer entsprechenden Vorrichtung. Wir nutzen das System der Schwerkraft Bonnarens und Einhorn 4. Zeigen Sie mit der posterolateralen Oberfläche des Schienbeins in den Blöcken, heben Sie das Gewicht auf eine vorgegebene Höhe entlang der Fallarm-and-Drop das Gewicht, so dass es Kontakte die anterolaterale Seite des Schienbeins, um den stumpfen Bruch zu erzeugen. Die Höhe wird das Gewicht von Bedürfnissen sank um für jeden Stamm der Maus, um einen einzigen Bruch des Schienbeins ausschließlich gewährleisten ermittelt werden.
  9. Fraktur wird durch Röntgenstrukturanalyse bestätigt.
  10. Nach der Bestätigung der Fraktur, sind drei Edelstahl # 0/56 Gewindestangen an den Ringen befestigt. Ausgehend von dem distalen Ende nach der Stange und Einfädeln einer Mutter auf dem distalen Ring, um die Stange zu sichern. Dann legen Sie eine andere Mutter auf der Stange, wird der proximale Ring an der Oberseite des n sitzenut. Stellen Sie sicher, dass die beiden Ringe in gleichen Abständen stattfinden wird und nicht belasten die Stifte. Sichern Sie den proximalen Ring an den Stäben mit einer dritten Mutter.
  11. Subkutane Injektion von Buprenorphin (1,0 mg / kg) für die Analgesie werden sofort nach der Operation und die Tiere für Schmerz und Buprenorphin gegebenen überwacht nach Bedarf.
  12. Anästhesie wird durch die Gabe von Atipamezol umgekehrt, und Tiere werden überwacht, bis sie reagieren und ambulating sind.

3. Distraktionsosteogenese (siehe auch: 12,13)

Um dieses Verfahren zu ändern, um Platz für Distraktionsosteogenese ist unkompliziert. Die Ringe werden in ihrer Position durch Gewindestangen gehalten, und durch Drehen der Muttern, mit denen die Stäbe an Ort und Stelle können die Ringe auseinander bewegt werden.

  1. Latenz: Für Standard-Distraktionsosteogenese mit diesem Modell die Fixateure werden auf der Tibia platziert und allein für eine Latenzzeit von 5 Tage Zeit.
  2. Ablenkung: Ablenkung osteogenesis kann durch Drehen der Muttern an den Stabilisierungsstangen ¼ Umdrehung (0,25 mm) jeden Tag 7 Tage durchgeführt werden.
  3. Reifung: knöcherne Überbrückung wird durch 10 Tage lang beobachtet und vollständige Konsolidierung wird durch 27 Tage nach Abschluss der Ablenkung beobachtet.

4. Schaffung einer kritischen Sized Defect

Um eine kritische Größe Defekt verursachen die Fixateur externe werden angewendet, wie zuvor mit den folgenden Modifikationen.

  1. Vor Beginn des Verfahrens wird die Haut mit 70% Ethanol gereinigt.
  2. Die Fixateure sind komplett vor dem Erstellen der Defekt appliziert.
  3. Die Maus wird dann unter dem Präpariermikroskop Ort, um die mediale Tibia zu visualisieren, und einen Einschnitt (5-7 mm) mit einem # 10 Klinge auf einem Skalpell.
  4. Der Muskel wird durchtrennt und sanft getrennt, um die Mitte der Diaphyse der Tibia freizulegen.
  5. Ein 3 mm Segment des Knochens wird dann ab Mitte der Diaphyse mit einer Schere entfernt. Mit ter Punkt der Schere wird der Knochen langsam weg und schnitt Knochenfragmente werden mit einer Pinzette bei Bedarf entfernt werden. Es sollte mit den Spitzen der Schere getroffen werden, um zu vermeiden Verschieben der Tibia mit einer großen mechanischen Kraft.
  6. Untersuchen die chirurgische Stelle um sicherzustellen, dass keine Knochenfragmente, da diese die Heilung zu fördern könnte.
  7. Ersetzen Sie die Muskeln rund um die abgestumpften Enden des Schienbeins.
  8. Schließen Sie den Schnitt auf der Haut mit 2-3 Fäden von 6-0 Polyamin Monofilament.
  9. Die Betäubung wird umgekehrt und die Tiere überwacht Schmerzen und gegebenen Analgetika, wie zuvor beschrieben.

5. Repräsentative Ergebnisse

Wenn sie richtig angewendet wird, bieten die Fixateur externe steifer Stabilität des geschlossenen Tibiafraktur mit ausgezeichneten Reduktion (Abb. 1, 2). In einigen Fällen nicht ausreichend Reduktion (offensichtlich ein großer Spalt zwischen Knochenenden oder mehrere Brüche auftreten (Abb. 3 (Abb. 4). Im Gegensatz dazu, wenn der Bruch nicht stabilisiert ist eine große Knorpel Kallus wird in den Spalt der Fraktur (5) gebildet ist, und dies wird durch Knochen durch das Verfahren nach intramembranöse Ossifikation ersetzt.

1
1. Röntgenaufnahmen, welches eine externe Fixiervorrichtung verwendet, um Tibiafraktur stabilisieren. Röntgenbild nach der Fraktur zeigen einen gut ausgerichteten Knochensegmenten (Pfeilspitze) übernommen.

2
2. Bild von einer Maus nach dem Fixateur angewendet wurde.

Abbildung 3
Abbildung 3. Röntgenaufnahme nach f genommenracture zeigt falsch ausgerichtet und fragmentierten Knochen Segmente (Pfeilspitze).

Abbildung 4
Abbildung 4. Stabilisierte Fraktur heilt über intramembranöse Ossifikation. Trichromfärbung von stabilisierten Fraktur zeigt einige neue Knochen (b) bei Fraktur. Maßstab = 500 um.

Abbildung 5
Abbildung 5. Non-stabilisierte Fraktur heilt über enchondralen Ossifikation. Trichromfärbung von nicht stabilisierten Fraktur zeigt Knorpel (c) und Knochen (b) bei Fraktur. Maßstab = 500 um.

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Discussion

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Bones von zwei unterschiedlichen Modalitäten je nach mechanischer Stabilität (: 14 bewertet in) zu heilen. Wenn links instabil einen großen Knorpel-Vorlage Formen im Frakturspalt, die durch Knochen ersetzt wird, um die beiden Enden des gebrochenen Knochens zu überbrücken. Proximal und distal der Pause bildet der Knochen direkt durch intramembranöse Ossifikation im Periost und Endost. Im Gegensatz dazu tritt bei stabilen Frakturen Heilung ausschließlich über intramembranöse Ossifikation 3. Allerdings sind die Mechanismen, die für den Wechsel zwischen diesen beiden Prozesse regulieren unbekannt. Es gibt Hinweise darauf, dass Stammzellschicksal in Reaktion auf die mechanische Umgebung genetisch gesteuert und verändert werden kann. In Mäusen, die MMP9 Knorpels fehlt in der Bruchstelle stabile Frakturen darauf hindeutet, dass in MMP9 Stammzellschicksal Entscheidungen während Frakturheilung 5 beteiligt. Knorpel kann auch veranlasst, in stabile Frakturen bilden, wenn der knochenmorphogenetischen Protein werden(BMP)-Signalweg ist während der Frakturheilung 8,9 aktiviert. Um diese Schlussfolgerungen zu ziehen Bereitstellung von starren Stabilisierung während der frühen Stadien der Heilung ist wichtig, weil diese Stammzellschicksal Entscheidungen während der ersten 11 Tage nach der Verletzung erfolgen.

Unsere Methode der Fixateur externe, bei korrekter Anwendung kann verwendet werden, um Knochen zu stabilisieren, um intramembranöse Ossifikation während der Frakturheilung zu beurteilen. Unsere Methode wird eine Fraktur zusammen mit anderen Schenkel Verletzungen, die in einem Aufprall mit hoher Geschwindigkeit auftreten. Im Gegensatz dazu kann Bohrloch-Modelle, die zur Beurteilung intramembranöse Ossifikation nicht darstellen Trauma bei Patienten. Ferner ist die hier beschriebene Verfahren ist beendet, so Komplikationen, die mit einem offenen Leberschädigung führen nicht verwirren Interpretation der Ergebnisse. Ein anderes übliches Verfahren zur Stabilisierung verwendet Platzierung eines Marknagels vor dem Bruch (z. B. 4). Diese Technik ist weit verbreitet, und Platzierung von the Stift ist einfach und effizient. Mit dieser Methode erzielt seitlichen Stabilisierung es nicht für Rotationsstabilität bereitzustellen. Die daraus resultierende Verletzung heilt in erster Linie über enchondralen Ossifikation, die ohne Stabilisierung an allen 3 erreicht werden kann. Plated Fixierung ist auch verwendet worden, um Frakturstabilisierung bei Mäusen 15 zu erreichen. Hier eine offene Fraktur wird erstellt und speziell entwickelten Fixateur interne werden am Knochen befestigt, nachdem eine Osteotomie vorgenommen wird. Ähnlich wie bei unserem Ansatz der Osteosynthese-Methode sorgt für Stabilität und die Heilung erfolgt über intramembranöse Ossifikation. Wir beobachten nicht signifikante Komplikationen, Pin-Infektionen oder andere Komorbiditäten mit diesem Verfahren verbunden sind, und die Tiere sind in der Lage, um ihre Käfige leicht bewegen lassen. Die größten Nachteile sind in der Länge der Zeit es braucht, um sich bei dieser Methode, wie lange es dauert, um das Verfahren abzuschließen, und die Forderung von Teams von zwei Personen, um die Prozedur durchzuführen beherrschen. Ichn Verbindung mit einer genetischen oder physiologischen Manipulationen zu den Mäusen, verglichen stabilisiert, um nicht stabilisiert Frakturheilung bietet erhebliche Einblick in die Mechanismen, die Stammzell-Schicksal während der Frakturheilung 5 zu regulieren, und ermöglichte eine Untersuchung der Distraktionsosteogenese 14, während auch die uns mit einer Modell des nicht-Union 13.

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Disclosures

Wir haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von R01-AR053645 aus NIAMS finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25mm insect pin Fine Science Tools 26000-25 Blacked Anodized Steel, 0.25mm rod diameter, 4cm length
Stainless Steel Hex Nut Small Parts, Inc. #2-56 1/8" length, 56 threads per inch
Stainless Steel Hex Nut Small Parts, Inc. #0-80 1/8" length, 80 threads per inch
Stainless Steel Machine Screw Small Parts, Inc. #0-80 1/8" length, 80 threads per inch
Stainless Steel Machine Cut Threaded Rod Small Parts, Inc. #0-80 6" length, 80 threads per inch
18-8 Stainless Steel Head Machine Screw McMaster-Carr 2-56 Threads, 3/6" length
External Fixation Device Machine shop Custom-designed

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References

  1. Ilizarov, G. A., Lediaev, V. I., Shitin, V. P. The course of compact bone reparative regeneration in distraction osteosynthesis under different conditions of bone fragment fixation (experimental study). Eksperimentalnaia Khirurgiia i Anesteziologiia. 14, 3-12 (1969).
  2. Ilizarov, G. A., Deviatov, A. A. Surgical elongation of the leg. Ortopediia Travmatologiia i Protezirovanie. 32, (1971).
  3. Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. J. Orthop. Res. 20, 1091-1098 (2002).
  4. Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal. J. Orthop. Res. 2, 97-101 (1984).
  5. Colnot, C., Thompson, Z., Miclau, T., Werb, Z., Helms, J. A. Altered fracture repair in the absence of MMP9. Development. 130, 4123-4133 (2003).
  6. Lange, J. Action of IL-1beta during fracture healing. J. Orthop. Res. 28, 778-784 (2010).
  7. Xing, Z. Multiple roles for CCR2 during fracture healing. Dis. Model Mech. 3, 451-458 (2010).
  8. Lu, C. Recombinant human bone morphogenetic protein-7 enhances fracture healing in an ischemic environment. J. Orthop. Res. (2009).
  9. Yu, Y. Y., Lieu, S., Lu, C., Colnot, C. Bone morphogenetic protein 2 stimulates endochondral ossification by regulating periosteal cell fate during bone repair. Bone. 47, 65-73 (2010).
  10. Lu, C., Miclau, T., Hu, D., Marcucio, R. S. Ischemia leads to delayed union during fracture healing: a mouse model. J. Orthop. Res. 25, 51-61 (2007).
  11. Miclau, T. Effects of delayed stabilization on fracture healing. J. Orthop. Res. 25, 1552-1558 (2007).
  12. Tay, B. K., Le, A. X., Gould, S. E., Helms, J. A. Histochemical and molecular analyses of distraction osteogenesis in a mouse model. Journal of Orthopaedic Research. 16, 636-642 (1998).
  13. Choi, P., Ogilvie, C., Thompson, Z., Miclau, T., Helms, J. A. Cellular and molecular characterization of a murine non-union model. J. Orthop. Res. 22, 1100-1107 (2004).
  14. Buckwalter, J. A., Marsh, E. T., J, L. Rockwood and Green's fractures in adults. Heckman, J. D., Bucholz, R. W. Lippincott Williams & Wilkins. 245-271 (2001).
  15. Garcia, P. The LockingMouseNail-A New Implant for Standardized Stable Osteosynthesis in Mice. J. Surg. Res. (2009).
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Yu, Y. y., Bahney, C., Hu, D., Marcucio, R. S., Miclau, III, T. Creating Rigidly Stabilized Fractures for Assessing Intramembranous Ossification, Distraction Osteogenesis, or Healing of Critical Sized Defects. J. Vis. Exp. (62), e3552, doi:10.3791/3552 (2012).More

Yu, Y. y., Bahney, C., Hu, D., Marcucio, R. S., Miclau, III, T. Creating Rigidly Stabilized Fractures for Assessing Intramembranous Ossification, Distraction Osteogenesis, or Healing of Critical Sized Defects. J. Vis. Exp. (62), e3552, doi:10.3791/3552 (2012).

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