Summary
この資料では、変更されたイリザロフ外部fixatorsのアプリケーションに基づいて長骨の骨折を安定化する方法について説明します。
Abstract
骨格修復のモードを評価することは骨折の治療に臨床的に使用される治療法を開発するために不可欠である。機械的安定性は骨損傷の治癒に大きな役割を果たしています。最悪のシナリオでは機械的な不安定性は、ヒトの遅延または非組合につながることができます。しかし、動きはまた、治癒過程を刺激することができます。モーション軟骨を持っている骨折では骨折の骨端部を安定させるために形成し、この軟骨が徐々に軟骨内骨化の発達過程の要約を介して骨に置換されます。対照的に、骨折はしっかりと膜内骨化を介して直接骨フォームを安定している。臨床的には、両方の軟骨と膜内骨化が同時に発生します。効果的にBonnarens 4で説明したように、このプロセスの研究者は骨の髄管にピンを挿入して複製します。 rotatioを可能にしながら、この実験法は、優れた横方向の安定性を提供しています内部不安定性が持続します。しかし、これら2つの異なるプロセスを制御するメカニズムの理解にも実験的にこれらの各プロセスを単離することによって拡張することができます。我々は、回転と横方向の安定性を提供する安定化プロトコルを開発しました。 、このモデルでは、膜内骨化が観察された癒しの唯一のモードであり、癒しのパラメータは、治癒10の生理的パラメータを変更した後、生理活性分子8,9の適用後、5-7遺伝子改変マウスの異なる系統間で比較することができます気晴らし骨12の後、安定化11の量や時間を変更した後、非組合13の作成 後、または重要なサイズの欠陥の作成 後。ここでは、マウスでは脛骨骨折治癒と仮骨延長術を研究するために変更されたイリザロフfixatorsを適用する方法を示しています。
Protocol
すべての手順は、UCSFの動物実験によって承認され、委員会を使用して、国のガイドラインに準拠していた。
1。手術に先立ちFixatorsの準備
- 安定した骨折を作成する前に、一つはカスタム設計外固定装置を組み立てる必要があります。カスタム設計された外固定フレームは3ステンレス製の＃0/56スレッドロッド、8＃56分の2六角ナット、17のマッチングボルト（小部（株）、マイアミレイクス、フロリダ州の3）により安定化された2つのアルミニウムのリングから成っていた。
- 2つのアルミニウムリングは骨折につき必要とされている。 1のリングに適切な穴に4＃56分の2六角ナット（ごく一部（株）、マイアミレイクス、フロリダ州）とのマッチングボルトを組み立て、これらは緩いままにしてください。これは、近位リングになります。遠位リングが3ボルトとナットを組み立てるために、再び完全に締めないでください。
2。麻酔、破壊の作成、および固定器の応用
- マウス（年齢、性別、体重量）は、ユーザーによって決定される50mg/mlケタミン、0.5 mg / mlのメデトミジン（0.03ミリリットル/マウス）の腹腔内注射により麻酔しています。
- マウスの目には目の潤滑剤を適用して、手順の中で彼らの目を保護するために頭全体にテープの一部を配置します。
- 動物は、プロシージャの残りのための加熱パッド上に配置されます。
- のTransfix 4 0.25ミリメートル不妊虫ピン（Anticorro：ファイン科学ツール、フォスターシティ、カリフォルニア州）を使用して、左脛骨の近位および遠位骨幹端ドレメルツールにピンを接続し、骨を介してそれらをドリルで。
- ピンはお互いに脛骨の長軸に垂直に配向であり、90°。近位および遠位ピンの間に少なくとも10ミリメートル。
- ピンに向かって内側に直面しているナッツ、近位ピンが上記の最初のリングを置きます。アルミリング内の中央に配置脛骨を維持するリングにピンを固定します。
- ディ下記の二番目のリングを置き、STALピンと以前のように六角ナットを使用してリングにピンを固定します。遠位固定器に第四ナット·ボルトの組み合わせを追加します。
- 適切なデバイスとの三点曲げによる横骨折を作成します。我々はBonnarensとアインホーン4の重力システムを使用しています。 、ブロック間の脛骨の後外側表面を休まドロップアームに沿って所定の高さに重量を上げるとそれに接触脛骨の前外側面が鈍骨折を生成するように体重をドロップします。高さは、重量は脛骨の排他的に単一の破壊を確実にするために、マウスの各菌株について決定する必要がありますから削除されます。
- 骨折はX線によって確認されています。
- 骨折を確認後、3ステンレス鋼＃0/56のねじ棒はリングに接続されています。遠位端から開始すると、ロッドを挿入し、ロッドを確保するために遠位リングにナットを通します。その後、ロッドの上に別のナットを入れて、近位リングは、このnの上に座りますUT。つのリングが等しい距離で開催されるとピンに負担をかけていないことを確認します。第三ナットでロッドに近位リングを固定します。
- 鎮痛のためのブプレノルフィンの皮下注射（1.0 mg / kg体重）は、手術や動物の直後に与えられている痛みのために監視し、必要に応じてブプレノルフィンを与えられている。
- 麻酔はアチパメゾールを投与することにより反転され、それらが反応するとambulatingになるまで、動物が監視されています。
3。仮骨延長術（参照：12,13）
気晴らし骨を収容するためにこの手順を変更することは簡単です。リングは、ねじ棒によって位置に保持され、所定の位置にロッドを保持しているナットを回して、リングを離れて移動することができます。
- 待ち時間：このモデルを使用して、標準の仮骨延長術はfixatorsが脛骨の上に配置され、5日間の潜伏期間のため放置。
- 気晴らし：気晴らしosteogenesisが安定化ロッド¼ターン（0.25ミリメートル）毎日7日間のナットを回すことによって行うことができます。
- 成熟：骨のブリッジングが10日で観察され、完全な統合が気晴らしの完了後27日間観察される。
4。クリティカルサイズの欠陥の作成
以前に以下の変更で説明したように、重要なサイズの欠陥を作成するために外部fixatorsが適用されます。
- 手順を開始する前に、皮膚を70％エタノールで洗浄されています。
- fixatorsは、欠陥を作成する前に完全に適用されます。
- マウスは、内側脛骨を可視化するために解剖顕微鏡下に置きされており、切開（5-7 mm）のメスの上に＃10ブレードで作られています。
- 筋肉を穏やかに脛骨の中間骨幹を公開するために切断し、分離されています。
- 骨の3 mmのセグメントはその後半ば骨幹を使用してはさみから削除されます。 tを使用して彼はハサミのポイントは、骨が徐々に切り取られ、必要に応じて骨片をピンセットで除去されています。ケアは、大規模な機械的な力を用いて脛骨を変位さを避けるためにハサミの先端で撮影する必要があります。
- これらは治癒を促進する可能性があるため、全く骨の断片が存在しないことを確認するために手術部位を確認します。
- 脛骨の平滑端のまわりの筋肉を交換してください。
- 6から0ポリアミンモノフィラメントの2-3縫合糸で皮膚に切開を閉じます。
- 麻酔が反転され、動物が痛みのために監視し、前述のように鎮痛薬を与えられている。
5。代表的な結果
正しく適用された場合は、外部fixatorsは、優れた減少（ 図1、図2）で閉鎖脛骨骨折のより厳格な安定性を提供します。しかし、いくつかのケースでは不十分な減少（骨端または複数の骨折の間に明白な、大きなギャップがある（ 図3発生する図4）を介して癒すこのメソッドを使用して安定した。骨折が安定されていない場合とは対照的に、大規模な軟骨のカルスは、骨折のギャップ（ 図5）に形成され、これは膜内骨化のプロセスを介して骨に置換されます。
図1脛骨骨折を安定化させるために使用される外部固定装置を示すX線写真。レントゲン写真は、よく整列骨セグメント（矢印）を示す骨折後に撮影。
図2固定器が適用された後のマウスのイメージ。
図3 X線写真は、f後に撮影ractureの位置がずれて、断片化した骨のセグメント（矢印）を示しています。
図4安定破壊は膜内骨化を経由して癒してくれます。安定した骨折のトリクローム染色は、骨折部位のいくつかの新しい骨（b）に示しています。スケールバー= 500μmである。
図5非安定骨折は軟骨内骨化を経由して癒してくれます。非安定破壊の三重染色（b）は、骨折部位での軟骨（c）と骨を示しています。スケールバー= 500μmである。
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Discussion
骨は機械的安定性（：14に日）に応じて2つの異なるモダリティによって癒す。壊れた骨の両端を埋めるために骨に置換され破壊ギャップに不安定な大型軟骨テンプレートフォームを去ったとき。近位と遠位のブレークに、骨は、骨膜と骨内膜内膜内骨化によって直接形成している。対照的に、安定した骨折の治癒には膜内骨化3を介して排他的に発生します。しかし、これらの2つのプロセスの間にスイッチを制御する特定のメカニズムは不明である。機械環境に応答して、幹細胞の運命は遺伝的に制御され、変更することができるという証拠があります。 MMP9が骨折修復5の間に幹細胞の運命決定に関与していることを示唆している安定した骨折の骨折部位にMMP9軟骨フォームを欠くマウスである。軟骨は、骨形成タンパク質の場合、安定した骨折で形成するように誘導することができます（BMP）シグナル伝達経路は、骨折修復8,9の間にアクティブになります。これらの幹細胞の運命決定が負傷11の後の最初の数日の間に行われるため、治癒の初期段階で厳格な安定を提供するこれらの結論を引き出すためには、重要です。
正しく適用外固定の我々の方法は、骨折治癒の間に膜内骨化を評価するために骨を安定させるために使用することができます。我々の手法は、高い速度への影響で発生する他の四肢の損傷とともに骨折を作成します。対照的に、膜内骨化を評価するために使用されているドリル穴モデルでは、患者の外傷を反映しないかもしれません。さらに、ここで説明するメソッドがクローズされ、オープン傷害に関連した合併症は、結果の解釈を混乱させるしないように。安定化のための別の一般的な方法は、（例えば4）破壊する前に髄内ピンの配置を使用しています。この手法は、広く使用されていると、目の配置Eピンはシンプルで効率的です。このアプローチは、横方向の安定を生成しながら、回転安定性を提供していません。傷害は、すべて3で安定化することなく達成することができます軟骨内骨化を介して主に癒してくれます。メッキ固定はまた、マウス15の骨折安定化を達成するために使用されています。ここで開放骨折が作成され、骨切り術が行われた後に特別に設計された内部fixatorsは、骨に接続されています。我々のアプローチと同様に内部の固定方法は、安定性を提供し、治癒は膜内骨化を介して行われます。我々は、このプロシージャに関連付けられた重大な合併症、ピン路感染症、または併存疾患他を守らないと、動物は簡単にケージ内を移動することができます。主な欠点は、このメソッドは、それが手続きを完了するのにかかる時間、および手順を実行するには、2つの個人のチームのための要件に習熟するのにかかる時間の長さである。私はマウスへの遺伝的または生理的な操作とnの組み合わせは、非安定化骨折治癒に安定し比較することは骨折治癒5の間に幹細胞の運命を制御するメカニズムにかなりの洞察力を提供し、また私たちに提供しながら、気晴らしの調査骨14を許可している非組合13のモデル。
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、NIAMSからR01-AR053645によって資金を供給された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25mm insect pin | Fine Science Tools | 26000-25 | Blacked Anodized Steel, 0.25mm rod diameter, 4cm length |
| Stainless Steel Hex Nut | Small Parts, Inc. | #2-56 | 1/8" length, 56 threads per inch |
| Stainless Steel Hex Nut | Small Parts, Inc. | #0-80 | 1/8" length, 80 threads per inch |
| Stainless Steel Machine Screw | Small Parts, Inc. | #0-80 | 1/8" length, 80 threads per inch |
| Stainless Steel Machine Cut Threaded Rod | Small Parts, Inc. | #0-80 | 6" length, 80 threads per inch |
| 18-8 Stainless Steel Head Machine Screw | McMaster-Carr | 2-56 Threads, 3/6" length | |
| External Fixation Device | Machine shop | Custom-designed |
References
- Ilizarov, G. A., Lediaev, V. I., Shitin, V. P. The course of compact bone reparative regeneration in distraction osteosynthesis under different conditions of bone fragment fixation (experimental study). Eksperimentalnaia Khirurgiia i Anesteziologiia. 14, 3-12 (1969).
- Ilizarov, G. A., Deviatov, A. A. Surgical elongation of the leg. Ortopediia Travmatologiia i Protezirovanie. 32, (1971).
- Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. J. Orthop. Res. 20, 1091-1098 (2002).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal. J. Orthop. Res. 2, 97-101 (1984).
- Colnot, C., Thompson, Z., Miclau, T., Werb, Z., Helms, J. A. Altered fracture repair in the absence of MMP9. Development. 130, 4123-4133 (2003).
- Lange, J. Action of IL-1beta during fracture healing. J. Orthop. Res. 28, 778-784 (2010).
- Xing, Z. Multiple roles for CCR2 during fracture healing. Dis. Model Mech. 3, 451-458 (2010).
- Lu, C. Recombinant human bone morphogenetic protein-7 enhances fracture healing in an ischemic environment. J. Orthop. Res. , (2009).
- Yu, Y. Y., Lieu, S., Lu, C., Colnot, C. Bone morphogenetic protein 2 stimulates endochondral ossification by regulating periosteal cell fate during bone repair. Bone. 47, 65-73 (2010).
- Lu, C., Miclau, T., Hu, D., Marcucio, R. S. Ischemia leads to delayed union during fracture healing: a mouse model. J. Orthop. Res. 25, 51-61 (2007).
- Miclau, T. Effects of delayed stabilization on fracture healing. J. Orthop. Res. 25, 1552-1558 (2007).
- Tay, B. K., Le, A. X., Gould, S. E., Helms, J. A. Histochemical and molecular analyses of distraction osteogenesis in a mouse model. Journal of Orthopaedic Research. 16, 636-642 (1998).
- Choi, P., Ogilvie, C., Thompson, Z., Miclau, T., Helms, J. A. Cellular and molecular characterization of a murine non-union model. J. Orthop. Res. 22, 1100-1107 (2004).
- Buckwalter, J. A., Marsh, E. T., J, L. Rockwood and Green's fractures in adults. Heckman, J. D., Bucholz, R. W. , Lippincott Williams & Wilkins. 245-271 (2001).
- Garcia, P. The LockingMouseNail-A New Implant for Standardized Stable Osteosynthesis in Mice. J. Surg. Res. , (2009).
