Summary
ठोस राज्य nanopores का उपयोग करने के लिए एक अकार्बनिक सतह पर प्रोटीन की गैर विशिष्ट सोखना की निगरानी की एक विधि वर्णित है. विधि प्रतिरोधक - नाड़ी सिद्धांत को रोजगार, सोखना के लिए अनुमति देने के लिए वास्तविक समय में और एकल अणु स्तर पर जांच होनी है. क्योंकि एकल प्रोटीन सोखना के प्रक्रिया संतुलन से दूर है, हम सिंथेटिक nanopores के समानांतर arrays के रोजगार का प्रस्ताव, पहले के आदेश स्पष्ट प्रतिक्रिया प्रोटीन सोखना के निरंतर दर के मात्रात्मक निर्धारण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से और Langmuir सोखना निरंतर के लिए सक्षम करने.
Abstract
ठोस राज्य nanopores nucleic एसिड की स्थानीय संरचना और लचीलापन 1-6, 7 प्रोटीन का खुलासा, और अलग अलग 8 ligands के बंधन आत्मीयता की जांच के एकल अणु स्तर पर माप प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. प्रतिरोधक नाड़ी 9-12 तकनीक इन nanopores युग्मन, इस तरह के मापन की शर्तों के एक विस्तृत विविधता के अंतर्गत और 3 लेबलिंग के लिए आवश्यकता के बिना किया जा सकता है. प्रतिरोधक पल्स तकनीक में, एक ईओण नमक समाधान nanopore के दोनों पक्षों पर शुरू की है. इसलिए, आयनों एक आवेदन transmembrane क्षमता द्वारा चैम्बर के एक तरफ से दूसरे को प्रेरित कर रहे हैं, एक स्थिर वर्तमान में जिसके परिणामस्वरूप. nanopore में एक analyte के विभाजन के इस वर्तमान में एक अच्छी तरह से परिभाषित विक्षेपन, जो एकल अणु जानकारी निकालने के लिए विश्लेषण किया जा सकता का कारण बनता है. इस तकनीक का उपयोग करना, सोखना nanopore दीवारों एकल प्रोटीन के एक विस्तृत श्रृंखला के तहत नजर रखी जा सकती13 शर्तों. प्रोटीन सोखना महत्व में बढ़ रहा है, क्योंकि microfluidic उपकरणों के रूप में आकार में छोटा है, एक प्रोटीन के साथ इन प्रणालियों की बातचीत एक चिंता का विषय बन जाता है. इस प्रोटोकॉल नाइट्राइड फिल्मों, जो आसानी से nanopore ड्रिलिंग करने के लिए उत्तरदायी अन्य पतली फिल्मों, या functionalized नाइट्राइड सतहों के लिए बढ़ाया जा सकता है के लिए बाध्य प्रोटीन के लिए एक तेजी से परख का वर्णन करता है. प्रोटीन की एक किस्म के समाधान और denaturing स्थितियों की एक विस्तृत श्रृंखला के तहत पता लगाया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल के लिए अधिक बुनियादी nanopore स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कर समस्याओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
1. सिलिकॉन नाइट्राइड झिल्ली में ठोस राज्य nanopores का विनिर्माण
- 200 केवी के एक त्वरण वोल्टेज फी Tecnai F20 एस / मंदिर ले आओ. यदि एक अलग एस / मंदिर का उपयोग, त्वरण वोल्टेज से अधिक या दो सौ नौ केवी के बराबर होना चाहिए
- मंदिर नमूना धारक में एक 20 एनएम मोटी SPI सिलिकॉन नाइट्राइड विंडो ग्रिड लोड और 30 सेकंड के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा साथ साफ करने के लिए धारक से किसी भी contaminants को हटायें.
- एस / मंदिर में नमूना लोड और नीचे वैक्यूम पंप के लिए अनुमति देते हैं. एक बार मंदिर एस / वैक्यूम पंप है, उज्ज्वल क्षेत्र मंदिर मोड में Ronchigram पर एक चमकदार वर्ग के लिए देख द्वारा नाइट्राइड विंडो खोजने. सुनिश्चित करें कि मंदिर ठीक से गठबंधन किया है, तो संरेखित करें और नमूना फ़ोकस.
- एस / मंदिर स्टेम मोड में स्विच करें. नमूना छवि HAADF डिटेक्टर (या समतुल्य) का प्रयोग करें और सुनिश्चित करें कि यह ठीक से गठबंधन किया है.
- Monochromator एक कम मूल्य के लिए सेट करें. Monochromator का एक कम मूल्य एक उच्च कुरेन के लिए अनुमति देता हैड्रिलिंग के लिए उपलब्ध इलेक्ट्रॉनों की टी. अगर एस / मंदिर Monochromator नहीं है, इस कदम की उपेक्षा.
- Nanopore ड्रिलिंग के लिए एक उपयुक्त स्थान आकार का चयन करें. यह इलेक्ट्रॉन जांच के व्यास से मेल खाती है है. एक 3 एनएम जांच 5 एनएम व्यास pores के ड्रिलिंग के लिए अच्छी तरह से काम करता है. एक बड़ा (5 एनएम) जांच और अधिक जल्दी से ड्रिल और एक बड़ा ताकना बनाने जाएगा. एक छोटे जांच (1 एनएम) अब लेने के लिए ड्रिल और एक छोटे ताकना पैदा करेगा.
- स्टेम संरेखण समायोजित करें, यदि आवश्यक है.
- नाइट्राइड झिल्ली फोकस और x1.3M एक magnification के लिए इसे लाने. ठीक ध्यान केंद्रित Ronchigram निगरानी द्वारा किया जाना चाहिए.
- अगर वहाँ नमूने के किसी भी आंदोलन है, तो स्थिर नमूना करने के लिए प्रतीक्षा करें. इस एक घंटे के लिए ले जा सकते हैं. जबकि ऐसा इंतजार कर के रूप में क्षति के लिए नहीं नाइट्राइड इलेक्ट्रॉन बीम खाली.
- नमूना के इलेक्ट्रॉन जांच प्लेस और ड्रिलिंग शुरू.
- समय समय पर, HAADF डिटेक्टर के साथ स्कैनिंग द्वारा नमूना की जांच, दोनों के लिए सुनिश्चित करें कि nanopore dri जा रहा हैlled (यह एक अंधेरे स्थान की तरह दिखेगा) और जांच है कि वहाँ नमूने के कोई आंदोलन है. यदि नमूना थोड़ा drifts, इलेक्ट्रॉन nanopore खत्म हो जांच की स्थिति को समायोजित.
- Ronchigram घड़ी की पहचान करने के लिए जब ताकना गठन किया है. जब आप ध्यान में, नाइट्राइड फिल्म एक झिलमिलाता उपस्थिति है. यह जब nanopore रूपों गायब हो जाएगा. Ronchigram थोड़ा ध्यान से बाहर लाना एक Fresnel nanopore के साथ जुड़े हाशिये देखने के लिए अनुमति देता है.
- HAADF साथ nanopore की एक छवि ले लो.
- Nanopore छवि के एक तीव्रता प्रोफ़ाइल करो. nanopore के व्यास प्रोफ़ाइल के अंधेरे क्षेत्र से अनुमान लगाया जा सकता है.
- Nanopore की वृद्धि ताकना के किनारों के साथ इलेक्ट्रॉन जांच हिल द्वारा किया जा सकता है है.
- एक बार nanopore वांछित व्यास की है, एस / मंदिर मंदिर मोड में डाल दिया.
- इसकी मानक स्थापित करने और छवि nanopore उज्ज्वल क्षेत्र मंदिर का उपयोग करने के लिए आकार की पुष्टि के लिए Monochromator लाओ
2. ठोस राज्य nanopore के गीला
- De - गैस de-ionized 1 एम KCl, 10 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट, पीएच 7.4 युक्त पानी. इस वैक्यूम के अंतर्गत समाधान डालने और एक स्नान sonicator में उन्हें 20 मिनट के लिए रखने के द्वारा किया जा सकता है.
- एक 10 मिलीलीटर Pyrex बीकर में nanopore युक्त नाइट्राइड सिलिकॉन चिप रखें. ध्यान रखना नाइट्राइड खिड़की तोड़ नहीं के रूप में यह बहुत ही नाजुक है. एक hotplate पर एक धूआं हुड में बीकर प्लेस और 100 सी. सेंटीग्रेड सेट
- पिरान्हा महान देखभाल का उपयोग समाधान के साथ nanopore चिप साफ़. पहले एक गिलास कंटेनर का उपयोग विंदुक के लिए 3 मिलीलीटर सल्फ्यूरिक एसिड जोड़ें. अगला, ध्यान से सल्फ्यूरिक एसिड 1 मिलीलीटर हाइड्रोजन पेरोक्साइड जोड़ने के लिए पिरान्हा 14 समाधान . कृपया सभी सावधानियों लेने.
- Nanopore चिप पिरान्हा समाधान में 10 मिनट के लिए लेना करने के लिए अनुमति दें.
- एक गिलास बीकर का उपयोग विंदुक से पिरान्हा समाधान निकालें. यह एक उचित भंडारण गोदाम में रखें.
- फाईडे को मार डाला, de-ionized पानी का उपयोग करते हुए एक स्वच्छ कांच विंदुक के साथ बीकर हूँ. पानी की खाली बीकर और कम से कम 5 बार दोहराएँ.
- साफ चिमटी के साथ nanopore चिप निकालें और यह प्रकाश चूषण द्वारा सूखे
- तत्काल, चैम्बर (छवि 2a, 2b) में nanopore चिप सील चिप O-अंगूठी या सिलिकॉन सीलेंट द्वारा कक्ष में सुरक्षित किया जा सकता है..
- KCl समाधान के साथ चैम्बर भरें
- चैम्बर (छवि 2b) एजी / AgCl इलेक्ट्रोड कनेक्ट इलेक्ट्रोड रातोंरात ब्लीच में चांदी के तार भिगोने से बनाया जा सकता है है ..
- इलेक्ट्रोड के पार एक transmembrane संभावित लागू और वर्तमान वोल्टेज दबाना मोड में एक Axon 200B प्रवर्धक पैच दबाना का उपयोग प्रतिक्रिया की निगरानी.
- माप से एक वक्र मैं / वी (वर्तमान वोल्टेज) निर्माण. मैं / वी वक्र उच्च रैखिक हो सकता है जब एक एम KCl (छवि 3) का उपयोग करना चाहिए. Nanopore के प्रवाहकत्त्व इसके व्यास के अनुरूप होना चाहिए. यदि nanopore प्रदर्शित नहीं करता हैरैखिक वक्र मैं / वी, बहुत कम प्रवाहकत्त्व है, या nanopore की खुली वर्तमान स्थिर (4a छवि) नहीं है, यह मतलब है कि nanopore ठीक नहीं गीला पिरान्हा धोने दोहराया जाना चाहिए .
3. निगरानी प्रोटीन सोखना
- यह महत्वपूर्ण है एक झिल्ली एकल nanopore या nanopores के समानांतर सरणी (नीचे देखें) बफर प्रोटीन नमूना कमी शर्तों के साथ वर्तमान की निगरानी के साथ नियंत्रण प्रयोगों प्रदर्शन. हम निम्नलिखित दो चरणों की सिफारिश: (i) एक उच्च शुद्धता स्तर बफर का उपयोग करें (शुद्धता> 99.9%, क्रोमैटोग्राफी ग्रेड स्तर), और (ii) एक बफर ठोस राज्य nanopore के साथ बातचीत जिसका का उपयोग नहीं करता है एकल चैनल घटनाओं का उत्पादन. इसके अलावा, हम एक प्रोटीन उच्च शुद्धता मानक प्रोटीन रसायन शास्त्र प्रक्रियाओं का उपयोग नमूना प्राप्त करने के सलाह देते हैं. प्रोटीन के नमूने की शुद्धता सोडियम dodecyl सल्फेट - polyacrylamide (एसडीएस पृष्ठ) जेल विश्लेषण और उच्च संकल्प माँ से जाँच की जानी चाहिएएस एस स्पेक्ट्रोमेट्री 15.
- चैम्बर की जमीन स्नान में अध्ययन किया जा प्रोटीन का एक शुद्ध नमूना जोड़ें. स्नान भर में फैलाना नमूने के लिए समय की अनुमति दें. मापा जा सकता है कि प्रोटीन की विशिष्ट सांद्रता सुक्ष्ममापी 7,15-21 रेंज एनएम के दसियों में हैं .
- अध्ययन किया जा रहा है प्रोटीन की कुल प्रभारी के polarity के विपरीत के साथ एक transmembrane संभावित वोल्टेज पूर्वाग्रह लागू करें. उदाहरण के लिए, BSA एक प्रभावी 7.4 पीएच में शुद्ध नकारात्मक चार्ज है, और इसलिए एक सकारात्मक वोल्टेज पूर्वाग्रह लागू किया जाना चाहिए. लागू वोल्टेज nanopore और विपरीत शुल्क के इंटीरियर प्रोटीन के भीतर संभावित ढाल बनाता विपरीत बलों द्वारा संचालित किया जाएगा. केवल वोल्टेज छोर है कि nanopore में प्रोटीन ड्राइव औसत दर्जे का संकेत पैदा करेगा.
- 200 mV के परिमाण के लागू संभावित काफी बड़े के लिए सबसे अधिक प्रोटीन analytes का पालन किया जाना चाहिए. घटनाक्रम आधारभूत (छवि 4b) से क्षणिक वर्तमान deflections के रूप में दिखाई देगा.यदि कोई संकेत नहीं मनाया है, तो कक्ष में प्रोटीन की एकाग्रता में वृद्धि. उच्च voltages संकेत - रव अनुपात में सुधार होगा. नाइट्राइड nanopores कई वोल्ट का सामना कर सकते हैं.
- प्रोटीन adsorptions nanopore (छवि 4c) की वर्तमान आधारभूत में लंबे समय रहते परिवर्तन के रूप में दिखाई देगा.
4. Nanopores के functionalization के लिए संभावनाओं
सिलिकॉन नाइट्राइड 22,23 के लिए कार्यात्मक समूहों को लागू करने के लिए कई तरीके मौजूद हैं . अधिकांश फिल्मों नाइट्राइड बाहर और ओजोन के लिए जोखिम पर एक पतली परत ऑक्साइड है एक अतिरिक्त परत ऑक्साइड बनाने के लिए, यदि आवश्यक हो सकता है. विभिन्न organosilanes और ऐसी परतों पर इस्तेमाल किया जा सकता है आत्म इकट्ठे. ब्याज की विशेष aminosilane है, जो स्वयं assembles और आगे संशोधित किया जा सकता है (यानी, carboxylic एसिड और aldehydes), जैविक सतहों की एक सीमा के निरीक्षण के लिए अनुमति देता है. के बाद एक nanopore पिरान्हा धोया है और chambe में सुरक्षितr, amine कक्ष स्नान के लिए 0.5 एम (tetrabutylammonium) TBACl और निर्जल (मेथनॉल) MeOH एक विलायक के रूप में इस्तेमाल की एक सहायक इलेक्ट्रोलाइट के साथ सीधे जोड़ा जा सकता है. Monolayer गठन एक 400 mV वोल्टेज पूर्वाग्रह और वर्तमान ड्रॉप 23 के माप के आवेदन के द्वारा नजर रखी जा सकती है.
5. पहले के आदेश स्पष्ट प्रतिक्रिया की दर निरंतर का निर्धारण और Langmuir निरंतर सोखना समानांतर nanopore arrays का उपयोग
5.1 अवशोषण और desorption के लिए पहले के आदेश स्पष्ट प्रतिक्रिया की दर स्थिरांक
हम जोर है कि इस पद्धति का सकारात्मक पहलू अपने एकल अणु स्तर पर अलग - अलग adsorptions निरीक्षण करने की क्षमता है. एक अकार्बनिक सतह पर एकल अणु प्रोटीन सोखना के मापन ठोस राज्य nanopores के समानांतर arrays रोजगार द्वारा किया जा पहुंचा सकते हैं. nanopores के समानांतर सरणी परख कई pores के जरूरत विश्वसनीय आंकड़ा पाने की वजह से आवश्यक हैएस यह अंत करने के लिए एक nanopore सरणी का उपयोग व्यक्तिगत adsorptions की निगरानी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आगे के विश्लेषण के लिए कई घटनाओं की माप की अनुमति होगी. सिलिकॉन नाइट्राइड में nanopores के एक सरणी के नमूने में कई छेद ड्रिलिंग के द्वारा बस ऊपर प्रोटोकॉल द्वारा गठित किया जा सकता है. प्रत्येक nanopore के समान आकार की होनी चाहिए. 6x6 या 7x7 के nanopores के Arrays के लिए पर्याप्त होना चाहिए. कक्ष में प्रोटीन analyte के अलावा पर, वर्तमान एक घातीय तरीके में निम्नलिखित अभिव्यक्ति के साथ क्षय होगा:
टी मैं मैं = ∞ - (मैं ∞ - 0 मैं) ऍक्स्प (कश्मीर 'टी)
यहाँ, मैं टी एक प्रयोगात्मक समय टी में वर्तमान अर्थ मैं 0 nanopore सरणी के माध्यम से मूल वर्तमान गुजर रहा है मैं ∞ संतृप्ति स्तर पर वर्तमान इंगित करता है (यानी, अनंत) कश्मीर 'स्पष्ट प्रतिक्रिया की दर पहले के आदेश है. निरंतर, जो वें से निर्धारित किया जा सकता है हैई प्रयोगात्मक वक्र के फिट. एक बड़ा 'कश्मीर एक तेज सोखना दर के रूप में व्याख्या की जा सकती है . अनुपात मैं ∞ / 0 मैं भी सामान्यीकृत संतृप्ति चालू कहा जाता है, 0 और 1 के बीच एक आयामरहित संख्या है . यह पैरामीटर adsorbed प्रोटीन analytes द्वारा अधिभोग का एक उपाय है. इसलिए, प्रत्येक अलग प्रयोगात्मक हालत दो विशिष्ट उत्पादन मैं ∞ मैं / 0 और 'कश्मीर मापदंडों के साथ जुड़ा होना चाहिए .
यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि स्पष्ट प्रथम क्रम सोखना दर स्थिरांक और सामान्यीकृत धाराओं प्रभावी nanopores के भीतर प्रोटीन द्वारा खर्च समय से प्रभावित कर रहे हैं. इस बार थोक जलीय चरण 24 में प्रोटीन analytes की एकाग्रता पर निर्भर है. इसलिए, इन नंबरों के अतिरिक्त सुधार करने के लिए प्रभावी nanopore इंटीरियर के भीतर प्रोटीन द्वारा बिताए समय के आधार पर कार्यान्वित किया जा जरूरत है. हम fas की आवृत्ति को मापने के सुझावटी (स्थानान्तरण) की घटनाओं और यह औसत से गुणा करके इस तरह की घटनाओं के समय ध्यान केन्द्रित करना. यह प्रति इकाई समय nanopore इंटीरियर के भीतर खर्च प्रोटीन का औसत समय दे देंगे.
desorption की स्थिर दर के रूप में अच्छी तरह से एक nanopores के समानांतर सरणी का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है है. जैसे ही वर्तमान स्तर संतृप्ति (∞ मैं) तक पहुँचता है, वोल्टेज उलट होना चाहिए, तो कोई और अधिक प्रोटीन nanopores में फंस रहे हैं. Desorption व्यक्ति प्रोटीन की अधिक से अधिक मूल्यों के प्रति दर्ज वर्तमान में परिवर्तन के साथ किया जाएगा. दर निरंतर तो मौजूदा स्तर में वृद्धि से निकाला जाएगा.
5.2 Langmuir निरंतर सोखना
nanopores के अकार्बनिक सतहों पर प्रोटीन analytes की अवशोषण जलीय चरण में प्रोटीन की एकाग्रता पर निर्भर है. यह घटना पहले से ही एकल अणु के स्तर पर 13 देखा गया है. यदि θ का प्रतिनिधित्व करते हैं सामान्यीकृत संतृप्ति वर्तमान (मैं ∞ 0 मैं /), तो एक ठेठ Langmuir इज़ोटेर्म समीकरण निम्नलिखित अभिव्यक्ति के द्वारा दिया जाता है :
जहां सी जलीय चरण में प्रोटीन की एकाग्रता है. α Langmuir सोखना निरंतर है . सोखना के बंधन ऊर्जा में वृद्धि के साथ और तापमान में कमी के साथ यह लगातार बढ़ जाती है. θ डेटा बिंदुओं के संग्रह समानांतर जलीय चरण में विभिन्न प्रोटीन सांद्रता में बाहर किए गए arrays के साथ माप काम करेंगे . डेटा फिट Langmuir सोखना निरंतर की भयावहता को सत्यापित करने के लिए अन्य तकनीकों के साथ संयोजन में विश्लेषण किया जाना चाहिए. इसके अलावा, पूर्ण atomistic आणविक गतिशीलता 25,26 सिमुलेशन भी हो सकता है प्राप्त प्रयोगात्मक डेटा की व्याख्या की मदद करने के लिए इस्तेमाल किया हो सकता है.
शीर्षक "> 6. प्रतिनिधि परिणाम ठोस राज्य nanopores के लिए विशिष्ट परिणाम के रूप में निम्नानुसार किया जाएगा. खुला ताकना वर्तमान अत्यधिक स्थिर हो सकता है, के रूप में छवि में देखा जाना चाहिए. 4a. मैं / वी nanopore की विशेषताओं 1 एम KCl, 10 पोटेशियम फॉस्फेट, 7.4 पीएच, के रूप में छवि में देखा में अत्यधिक रैखिक होना चाहिए. 2. एक रेखीय फिट मैं / वी वक्र ढलान nanopore की एकात्मक प्रवाहकत्त्व प्रदान करेगा. प्रवाहकत्त्व nanopore व्यास के लिए एक सीधा संबंध है और समीकरण मैच चाहिए: 
, जहाँ जी nanopore के प्रवाहकत्त्व है, घ इसके व्यास है, मैं इसकी लंबाई है, और σ 14 चैम्बर में समाधान की चालकता है. यह मूल्य के 30% के भीतर से मेल खाना चाहिए. यदि यह बहुत छोटा है, अपने ताकना की संभावना नहीं गीला है. प्रोटीन के अलावा के साथ, तेजी से घटनाओं लगते हैं, के रूप में छवि में देखा जाना चाहिए. 4b. Protईआईऍन सोखना एक लंबे समय रहते वर्तमान ड्रॉप के रूप में चित्र में प्रदर्शित है. 4c. कुछ प्रोटीन अत्यधिक अस्थिर कर रहे हैं ताकना इंटीरियर के भीतर संरचनात्मक परिवर्तन से गुजरना. इस मामले में, लंबे समय रहते वोल्टेज ड्रॉप तेजी से उतार - चढ़ाव के साथ किया जाएगा.
चित्रा 1 ठोस राज्य nanopore Tecnai मंदिर एस / F20 का उपयोग करने के लिए गढ़े. ताकना स्टेम मोड में 20 एनएम के एक व्यास के लिए drilled किया गया था. छवि उज्ज्वल क्षेत्र मंदिर मोड में लिया गया था. नाइट्राइड 30 एनएम मोटी था.
चित्रा 2. चैंबर आवास के लिए प्रतिरोधक पल्स माप में एक भी ठोस राज्य nanopore का इस्तेमाल एक चैंबर) और मुक्त खड़े नाइट्राइड विंडो (मंदिर ग्रिड) के साथ एक सिलिकॉन चिप . nanopore नाइट्राइड में लोड करने से पहले drilled है. लाल हे - छल्ले के लिए एक अच्छा फार्म का उपयोग किया जाता हैचिप है, जो अलग ईओण समाधान के दो स्नान के बारे में eal. बी) nanopore के लिए सम्मान के साथ समाधान स्नान और इलेक्ट्रोड के स्थान दिखा चैम्बर के योजनाबद्ध.
चित्रा 3 अलग अलग diameters के ठोस राज्य nanopores के लिए विशिष्ट मैं / वी निशान. एकल चैनल बिजली निशान 1 एम KCl, 20 मिमी Tris, पीएच 8.5 में ले जाया गया . Nanopores 30 एनएम मोटी सिलिकॉन नाइट्राइड में drilled थे. नोट नाइट्राइड मोटाई nanopore की एकात्मक प्रवाहकत्त्व को प्रभावित करेगा.
चित्रा 4 एकल चैनल वर्तमान निशान और प्रोटीन सोखना का पता लगाने मापा.) एक एकल चैनल बिजली एक 10 एनएम व्यास nanopore की वर्तमान खुला दिखा ट्रेस. बी) वर्तमान deflections गोजातीय सीरम albumin (BSA) के अंतर में विभाजन का प्रतिनिधित्व करते हैंnanopore के आईओआर. सी) BSA के सोखना नाइट्राइड सतह पर. सभी निशान 1 एम KCl, 10 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट, पीएच 7.4 में एक ही nanopore से कर रहे हैं हैं. लागू transmembrane क्षमता 40 एम वी और BSA 120 एनएम के एक एकाग्रता में जमीन कक्ष स्नान के लिए जोड़ा गया है.
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Discussion
ठोस राज्य 27-29 सतहों पर प्रोटीन की स्वतःस्फूर्त सोखना biochip अनुप्रयोगों और कार्यात्मक संकर biomaterials के एक नए वर्ग के डिजाइन के रूप में ऐसे क्षेत्रों की संख्या में मूल रूप से महत्वपूर्ण है. पिछले अध्ययनों से पता चला है कि ठोस राज्य सतहों adsorbed प्रोटीन पार्श्व गतिशीलता या महत्वपूर्ण desorption दरों शो नहीं है, और इसलिए प्रोटीन सोखना आम तौर पर एक अपरिवर्तनीय और nonspecific 30-32 प्रक्रिया माना जाता है. ठोस राज्य सतहों पर प्रोटीन सोखना के लिए ठोस तरल इंटरफेस में 13 और प्रतिक्रियाशील प्रोटीन समूहों के पक्ष श्रृंखला के बीच electrostatic और hydrophobic बलों सहित कई कारकों के कारण माना जाता है .
प्रोटीन सोखना की प्रक्रिया जैसे क्वार्ट्ज क्रिस्टल Microbalance 28,29, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, 33,34 ellipsometry, 35 फ्लोरोसेंट लेबलिंग, 36 और प्लाना दृष्टिकोण, की संख्या से पता लगाया गया हैआर ध्रुवीकरण इंटरफेरोमेट्री (पीपीआई) 37 इसके विपरीत, यह एक nanopore और nanopore सरणी पद्धति detectable एकल चैनल की वर्तमान एकल प्रोटीन analytes और nanopore इंटीरियर के बीच बातचीत द्वारा उत्पादित परिवर्तन पर निर्भर करता है.
सकारात्मक परिणाम प्राप्त करने में सबसे महत्वपूर्ण कदम nanopore इंटीरियर के उचित गीला है. ताकना विशेषताओं मिलना चाहिए विनिर्देशों परिणाम अनुभाग में चर्चा नहीं, कई समस्या निवारण तरीकों का इस्तेमाल किया जा सकता है. क्षणिक वर्तमान blockades है कि समाधान में किसी भी प्रोटीन के बिना होने का संकेत हो सकता है कि चैम्बर दूषित है. Teflon कक्षों पिरान्हा के साथ धोया जा सकता है है. PDMS कक्षों प्रत्येक प्रयोग के लिए स्वच्छ molds से ताजा किया जाना चाहिए. उम्मीद प्रवाहकत्त्व या गैर रेखीय मैं / वी विशेषताओं की तुलना में छोटे के साथ nanopores का संकेत हो सकता है कि गीला असफल है. उच्च वोल्टेज (5V ~) के एक संक्षिप्त आवेदन nanopore के विद्युत विशेषताओं में सुधार हो सकता है.अन्यथा, nanopore पिरान्हा समाधान के साथ फिर से धोया चाहिए. यहां तक कि सबसे अच्छा परिस्थितियों में, कुछ nanopores को ठीक तरह से गीला करने में विफल. एक nanopore को गीला करने की क्षमता अपने आयामों पर निर्भर करता है. दोनों पतली नाइट्राइड nanopores और बड़ा व्यास nanopores मोटा नाइट्राइड nanopores या छोटे व्यास nanopores से गीला करने के लिए आसान कर रहे हैं. 5 एनएम के एक त्रिज्या के साथ 20 एनएम मोटी nanopores के लिए पहली धोने के बाद सफलता की दर लगभग 70% है. केयर अपने analyte के लिए एक nanopore आकार के चयन में लिया जाना चाहिए, के बाद से nanopores काफी बड़े के लिए प्रोटीन को समायोजित किया जाना चाहिए.
प्रोटोकॉल यहाँ पर चर्चा केवल सोखना करने के लिए एक नाइट्राइड सिलिकॉन की सतह पर लागू होता है है. अन्य सतहों, जैसे कि सिलिकॉन ऑक्साइड 9 या 23 एल्यूमिना भी इस तकनीक का उपयोग drilled किया जा सकता है, लेकिन उन है कि इतनी निर्मित किया जा सकता है कि वे मुक्त खड़े, पतली और छेद से मुक्त कर रहे हैं इस तकनीक के लिए उत्तरदायी पतली फिल्मों की संख्या सीमित है . इस मुद्दे, Ch पर काबू पानेnanopore की emical कोटिंग 23,38-40 इस्तेमाल किया जा सकता है. एकल nanopore तकनीक का एक और व्यापार बंद है कि यह केवल एक समय में एक अणु पर देख सकते हैं. इस सीमा पार करने के लिए, हम ठोस राज्य nanopores 41 के समानांतर arrays का उपयोग करने का एक विकल्प की पेशकश की. Nanopore arrays के साथ वर्तमान माप के लिए एक स्पष्ट अवशोषण और desorption के पहले के आदेश प्रतिक्रिया दर स्थिरांक के रूप में macroscopic गतिज पैरामीटर, प्राप्त करने का अवसर प्रदान करते हैं. इसके अलावा, इस दृष्टिकोण Langmuir सोखना निरंतर के निर्धारण की अनुमति होगी. एक इस तकनीक का तत्काल सीमा फ्लैट और विस्तृत सतहों पर जानकारी एकत्र की अक्षमता है. मापन गढ़े ठोस राज्य nanopores के इंटीरियर के सीमित स्थान के भीतर ही प्रोटीन सोखना जांच करेंगे. कई उदाहरणों में, यह ज्यामिति और nanopore की भीतरी सतह पर सटीक जानकारी प्राप्त करने के काफी चुनौतीपूर्ण है. अतीत में, प्रोटीन सोखना बड़े पैमाने पर जांच किया गया थाक्वार्ट्ज क्रिस्टल Microbalance 28,29 द्वारा घ. क्रिस्टल सतह पर प्रोटीन सोखना dampening द्वारा क्रिस्टल Microbalance लगाया oscillatory आंदोलन के साथ है, गुंजयमान आवृत्ति में एक कमी के उत्पादन. कुल मिलकर प्रोटीन सोखना के कारण जन की एक परिवर्तन क्वार्ट्ज क्रिस्टल Microbalance की एक आवृत्ति बदलाव लाती है. कुल adsorbed प्रोटीन जन रैखिक आवृत्ति शिफ्ट करने के लिए संबंधित है. यह इस तकनीक है, जो परोक्ष रूप से एक अच्छी तरह से परिभाषित फ्लैट सतह पर जांच प्रोटीन सोखना के मूल सिद्धांत है. इसके विपरीत, nanopore सरणियों का उपयोग प्रतिरोधक नाड़ी तकनीक है कि निकट कल्टर काउंटर 42 दृष्टिकोण समान है रोजगार . फिर, nanopore तकनीक एक झिल्ली में nanopores की सीमित संख्या के लिए नीचे पहुंचा सकते हैं, तो व्यक्तिगत adsorptions वास्तविक समय में देखा जा सकता है है. क्वार्ट्ज क्रिस्टल Microbalance विपरीत, nanopore माप गधे एक बड़े पैमाने पर सोखना प्रक्रिया और नहीं कर सकतेफ्लैट सतह, (यानी, adsorbed के प्रोटीन के पार्श्व प्रसार) जो अतिरिक्त घटनाओं में हो सकता है, इस प्रकार Langmuir सोखना isotherms में परिवर्तन का उत्पादन. बेशक, यह वांछनीय है कि इन प्रोटीन सोखना के लिए समर्पित दृष्टिकोण एक दूसरे के साथ संयोजन में उपयोग किया जाना चाहिए, क्योंकि वे केवल सोखना प्रक्रिया के कुछ पहलुओं की जांच. उदाहरण के लिए, शराब बनानेवाला और उनके सहयोगियों ने क्वार्ट्ज क्रिस्टल Microbalance और ζ क्षमता तकनीकों का एक संयोजन कार्यरत दिखाने के लिए सोने के नैनोकणों और सोने की सतहों पर बाध्यकारी BSA एक electrostatic तंत्र के माध्यम से होता है.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tecnai F20 S/TEM | FEI | S/TEM requires acceleration voltage ≥200kV and field-emission source. | |
| 20 nm thick silicon nitride membrane window for TEM | SPI Supplies | 4163SN-BA | |
| Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | ||
| Axon Digidata 1440A | Molecular Devices | ||
| pCLAMP 10 software | Molecular Devices | Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software | |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A300 | |
| hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325 | |
| silicone O-rings | McMaster-Carr | 003 S70 | Alternatively use PDMS |
| silver wire | Sigma-Aldrich | 348759 | For electrodes |
| SPC Technology, D sub contact, pin | Newark Inc | 9K4978 | For electrodes |
| potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P2222 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| PDMS | Dow Corning | Sylgar 184 Elastomer set. For making chamber. | |
| Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments, Inc. | KWIK-CAST | Fast acting silicone sealant |
| hot plate | Fisher Scientific | ||
| Faraday cage |
References
- Li, J. Ion-beam sculpting at nanometre length scales. Nature. 412, 166-169 (2001).
- Li, J., Gershow, M., Stein, D., Brandin, E., Golovchenko, J. A. DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope. Nat. Mater. 2, 611-615 (2003).
- Dekker, C.
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