Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

رصد بروتين الامتزاز مع الحالة الصلبة Nanopores

doi: 10.3791/3560 Published: December 2, 2011

Summary

ووصف طريقة استخدام الحالة الصلبة nanopores لرصد الامتزاز غير محدد من البروتينات على سطح غير العضوية. الأسلوب يعمل على مبدأ مقاوم النبض ، مما يسمح للامتزاز أن يكون بحث في الوقت الحقيقي وعلى مستوى واحد جزيء. لأن عملية امتصاص البروتين وحيد هو أبعد ما يكون عن التوازن ، نقترح العمل صفائف متوازي من nanopores الاصطناعية ، وتمكين لتحديد كمي لمعدل أول رد فعل واضح ترتيب ثابت الامتزاز البروتين وكذلك وانجميور ثابت الامتزاز.

Abstract

وقد استخدمت الحالة الصلبة nanopores لتنفيذ القياسات على مستوى واحد جزيء لدراسة هيكل المحلي ومرونة من الأحماض النووية 1-6 ، وتتكشف من البروتينات 7 ، وتقارب ملزم من يغاندس مختلفة 8. وذلك بربط هذه nanopores لأسلوب مقاوم النبض 12/09 ، يمكن القيام به مثل هذه القياسات في إطار مجموعة واسعة من الظروف ودون الحاجة لوضع العلامات 3. في أسلوب مقاوم ، النبض ، وقدم حلا الملح الأيونية على كلا الجانبين من nanopore. لذلك ، هي التي تحرك الأيونات من جانب واحد من غرفة الى أخرى محتملة عبر الغشاء قبل تطبيقها ، مما أدى إلى تيار ثابت. تقسيم لتحليلها في nanopore يؤدي إلى انحراف واضحة المعالم في هذا التيار ، والتي يمكن تحليلها لاستخلاص المعلومات جزيء واحد. باستخدام هذه التقنية ، يمكن رصد امتصاص البروتينات واحدة في الجدران nanopore في إطار مجموعة واسعة منالظروف 13. البروتين الامتزاز تزداد أهمية ، لأنه كما يتقلص الأجهزة ميكروفلويديك في حجمها ، والتفاعل بين هذه الأنظمة مع البروتينات واحد يصبح مصدرا للقلق. يصف هذا بروتوكول الفحص السريع للبروتين ملزمة لنيتريد الأفلام ، والتي يمكن بسهولة أن تمتد إلى غيرها من الأفلام رقيقة قابلة للحفر nanopore ، أو على الأسطح نيتريد functionalized. ويمكن استكشاف مجموعة متنوعة من البروتينات في إطار مجموعة واسعة من الحلول وتغيير طبيعة الظروف. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لاستكشاف المزيد من المشاكل الأساسية باستخدام nanopore الطيفي.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. تصنيع الحالة الصلبة nanopores في الأغشية نيتريد السيليكون

  1. جعل الاتحاد الدولي للفروسية Tecnai F20 S / TEM إلى الجهد 200 كيلوفولت من التسارع. إذا باستخدام مختلف S / TEM ، ينبغي أن تسارع الجهد يكون أكبر من أو يساوي 200 كيلو فولت 9
  2. تحميل 20 نانومتر سميكة نيتريد السيليكون SPI شبكة نافذة على صاحب العينة TEM ونظيفة مع البلازما الأكسجين لمدة 30 ثانية لإزالة أي ملوثات من حامل.
  3. تحميل العينة إلى S / تيم والسماح للفراغ ضخ أسفل. مرة واحدة S / تيم ضخت وصولا الى الفراغ ، والعثور على نيتريد النافذة في وضع TEM مشرق الميدانية التي تبحث عن مربع مشرق على Ronchigram. تأكد من محاذاة TEM بشكل صحيح ، ثم محاذاة والتركيز في العينة.
  4. تبديل S / تيم في وضع الجذع. استخدام (أو ما يعادلها) HAADF كاشف لصورة العينة والتأكد من محاذاة بشكل صحيح.
  5. مستوحد اللون تعيين إلى قيمة منخفضة. وانخفاض قيمة مستوحد اللون يسمح للأعلى currenطن من الالكترونات المتاحة للحفر. إذا كان S / تيم لا يملك مستوحد اللون ، تجاهل هذه الخطوة.
  6. تحديد حجم البقعة المناسبة لحفر nanopore. هذا يتوافق مع قطر الإلكترون التحقيق. مجس نانومتر 3 يعمل بشكل جيد لحفر قطرها 5 المسام نانومتر. سيقوم المسبار أكبر (5 نانومتر) بسرعة أكبر الحفر وإنشاء أكبر المسام. سوف أصغر التحقيق (1 نانومتر) يستغرق وقتا أطول لحفر وإنشاء أصغر المسام.
  7. ضبط التحالفات الجذعية ، وإذا لزم الأمر.
  8. التركيز على غشاء نيتريد وإحضاره إلى التكبير من x1.3M. وينبغي أن يتم التركيز من خلال رصد غرامة Ronchigram.
  9. إذا كان هناك أي تحرك من العينة ، ثم الانتظار لنموذج لتحقيق الاستقرار. وهذا يمكن أن يستغرق فترة تصل الى ساعة واحدة. فارغة في انتظار شعاع الالكترون حتى لا تلحق الضرر نيتريد.
  10. مكان الإلكترون التحقيق على عينة وبدء الحفر.
  11. التحقق بشكل دوري عن طريق فحص العينة مع كاشف HAADF ، سواء للتأكد من nanopore يجري DRIlled (سيبدو بقعة داكنة) والتحقق من عدم وجود حركة العينة. إذا كانت العينة الانجرافات قليلا ، ضبط موضع التحقيق إلكترون أن يكون على nanopore.
  12. مشاهدة Ronchigram لتحديد عندما شكلت المسام. عندما تكون في التركيز ، والفيلم يحتوي على نيتريد مظهر المتلألئة. هذا وسوف تختفي عند الأشكال nanopore. وضع Ronchigram قليلا من التركيز يسمح احد لنرى هامش فريسنل المرتبطة nanopore.
  13. التقاط صورة من nanopore مع HAADF.
  14. لا ملف تعريف كثافة من الصورة nanopore. ويمكن تقدير القطر من nanopore من أحلك المنطقة من جانبي.
  15. ويمكن تنفيذ توسيع nanopore بتحريك المسبار الإلكترون على طول حواف المسام.
  16. مرة واحدة في nanopore هو من القطر المطلوب ، وضع S / TEM TEM في الوضع.
  17. جلب مستوحد اللون إلى مغربها القياسية وصورة مشرقة باستخدام nanopore الميدان TEM لتأكيد حجم

2. ترطيب للnanopore الحالة الصلبة

  1. دي الغاز غير المتأينة المياه التي تحتوي على 1 م بوكل ، 10 ملي فوسفات البوتاسيوم ، ودرجة الحموضة 7.4. يمكن القيام بذلك عن طريق وضع الحلول في ظل فراغ ووضعها في sonicator الحمام لمدة 20 دقيقة.
  2. ضع nanopore نيتريد السيليكون التي تحتوي على رقاقة في دورق 10 مل بيركس. الحرص على عدم كسر زجاج نافذة نيتريد كما هي حساسة للغاية. ضع الكأس على موقد في غطاء الدخان وتعيين إلى 100 درجة مئوية.
  3. تنظيف رقاقة حل مع nanopore البيرانا به بعناية كبيرة. أولا بإضافة حمض الكبريتيك 3 مل إلى الحاوية باستخدام ماصة الزجاج. المقبل ، إضافة بعناية 1 مل بيروكسيد الهيدروجين للحمض الكبريتيك لجعل الحل البيرانا 14. يرجى اتخاذ جميع الاحتياطات اللازمة.
  4. السماح للرقاقة nanopore لانقع في محلول البيرانا لمدة 10 دقائق.
  5. إزالة حل البيرانا من الدورق باستخدام ماصة الزجاج. وضعه في وعاء التخزين السليم.
  6. فايليرة لبنانية الدورق مع الماء دي بالغاز غير المتأينة ، وذلك باستخدام ماصة زجاجية نظيفة. كوب من الماء الفارغة وتكرار ما لا يقل عن 5 مرات.
  7. إزالة الشريحة nanopore مع ملاقط نظيفة وجافة عن طريق الشفط الضوء
  8. على الفور ، وختم رقاقة nanopore الى غرفة (الشكل 2A ، 2B). قد يكون المضمون الرقاقة في الغرفة التي كتبها O - الخواتم أو تسرب السيليكون.
  9. تملأ الغرفة مع الحل بوكل
  10. توصيل الأقطاب حج / AgCl إلى غرفة (الشكل 2B). يجوز أقطاب التي تمرغ الأسلاك الفضية في التبييض بين عشية وضحاها.
  11. تطبيق محتملة عبر الغشاء عبر الأقطاب الكهربائية ومراقبة الاستجابة الحالية باستخدام 200B أكسون التصحيح ، المشبك مكبر للصوت في وضع الجهد المشبك.
  12. بناء منحنى I / V (الجهد الجاري) من القياسات. وينبغي أن منحنى I / V تكون خطية للغاية عند استخدام 1 م بوكل (الشكل 3). تصرف من nanopore ينبغي أن تتوافق مع قطرها. إذا nanopore لا يعرضأنا خطي / V منحنى ، وتصرف منخفض جدا ، أو فتح الحالية للnanopore غير مستقر (الشكل 4A) ، فهذا يعني أن ليس nanopore المبللة بشكل صحيح وينبغي تكرار الغسيل البيرانا.

3. رصد بروتين الامتزاز

  1. ومن المهم بمكان إجراء تجارب السيطرة مع غشاء واحد أو مجموعة موازية nanopore من nanopores (انظر أدناه) لرصد الظروف الحالية مع عينة العازلة التي تفتقر إلى البروتين. ونحن نوصي بما يلي خطوتين : (ط) استخدام منطقة عازلة على مستوى عال النقاء (نقاء> 99.9 ٪ ؛ اللوني مستوى الصف) ، و (ثانيا) استخدام منطقة عازلة الذين التفاعل مع nanopore الحالة الصلبة لا إنتاج واحد قناة الأحداث. بالإضافة إلى ذلك ، فإننا ننصح الحصول على عينة بروتين عالية النقاء باستخدام معيار إجراءات كيمياء البروتين. وينبغي التحقق من نقاء العينة البروتين دوديسيل سلفات الصوديوم ، بولي أكريلاميد تحليل هلام (SDS - PAGE) وأماه عالية الدقةق ق 15 الطيف.
  2. إضافة عينة من البروتين النقي لدراستها في حمام أسس للغرفة. إتاحة الوقت لعينة لنشر جميع أنحاء الحمام. تركيزات نموذجية من البروتين الذي يمكن أن يقاس في عشرات نانومتر إلى مجموعة ميكرومتر 7،15-21.
  3. تطبيق التحيز الجهد عبر الغشاء المحتملة مع عكس الاقطاب لذلك من تهمة الإجمالية للبروتين التي تجري دراستها. على سبيل المثال ، جيش صرب البوسنة وفعال شحنة سالبة صافية في الرقم الهيدروجيني 7.4 ، وبالتالي ينبغي تطبيق التحيز الجهد إيجابية. الجهد تطبيقها يخلق الانحدار المحتملة داخل nanopore الداخلية والبروتينات من التهم العكس سوف يكون مدفوعا من قبل قوات المعاكس. وأقطاب التيار الكهربائي فقط التي تدفع البروتينات في nanopore إنشاء إشارات قابلة للقياس.
  4. وينبغي على إمكانية تطبيقها من حيث الحجم من 200 فولت تكون كبيرة بما يكفي لمراقبة analytes معظم البروتين. وسوف تظهر الأحداث الانحرافات الحالية عابرة من خط الأساس (الشكل 4B).إذا لوحظ عدم وجود إشارة ، وزيادة تركيز البروتين في الغرفة. ارتفاع الفولتية تحسين إشارة إلى نسبة الضوضاء. يمكن nanopores نيتريد تحمل فولت عدة.
  5. سوف تظهر adsorptions البروتين المعمرة تغييرات في خط الأساس الحالية للnanopore (الشكل 4C).

4. إمكانيات functionalization من nanopores

توجد عدة طرق لتطبيق المجموعات الوظيفية لنيتريد السليكون 22،23. يمكن أن يكون أكثر الأفلام نيتريد طبقة أكسيد رقيقة على السطح الخارجي ، والتعرض للمواد المستنفدة إنشاء طبقة أكسيد إضافية ، إذا لزم الأمر. ويمكن استخدام organosilanes مختلفة والنفس تجميعها ، على مثل هذه الطبقات. وهناك اهتمام خاص aminosilane ، الذي يجمع الذاتي ويمكن تعديل آخر (أي حمض الكربوكسيلية والألدهيدات) ، مما يسمح لتفتيش مجموعة من الأسطح العضوية. بعد أن تم غسل nanopore مع البيرانا والمضمون في chambeص ، يمكن إضافة الأمينات مباشرة إلى غرفة حمام مع المنحل بالكهرباء لدعم TBACl M 0.5 (tetrabutylammonium) واللامائية MeOH (الميثانول) تستخدم كمذيب. يمكن رصد تشكيل أحادي الطبقة من تطبيق تحيز الجهد 400 فولت وقياس الانخفاض الحالي 23.

5. عزم ثابت من الدرجة الأولى معدل التفاعل واضح وثابت الامتزاز انجميور باستخدام صفائف nanopore موازية

5.1 معدل التفاعل الواضح من الدرجة الأولى لامتصاص الثوابت والامتزاز

نؤكد على أن الجانب الإيجابي لهذه المنهجية هو قدرته على مراقبة adsorptions الفرد في مستوى واحد جزيء. ويمكن تحجيمها القياسات المفرد جزيء من البروتين الامتزاز على سطح غير العضوي بنسبة موازية للتوظيف صفائف الحالة الصلبة nanopores. الصفيف موازية من nanopores ضروري بسبب الحاجة إلى العديد من المسام مقايسة للحصول على إحصاءات موثوق بهاس. ولهذه الغاية ، فإن استخدام مجموعة nanopore تسمح برصد adsorptions الفردية ، وكذلك قياس أحداث متعددة لمزيد من التحليل. ويمكن تشكيل مجموعة من nanopores في نيتريد السيليكون بواسطة بروتوكول أعلاه ببساطة عن طريق حفر ثقوب متعددة في العينة. وينبغي أن يكون كل nanopore مشابهة من حيث الحجم. يجب صفائف من nanopores 6X6 أو 7x7 تكون كافية. عند إضافة الحليلة البروتين في الغرفة ، سوف الحالية الاضمحلال بطريقة أسية مع التعبير التالي :

أنا ر = I -- (I -- I 0) إكسب (- T ك ')

هنا ، أنا طن ، يدل الحالي في جامعة النجاح الوقت t التجريبي الأول 0 هو تمرير الأصلي الحالي من خلال مجموعة nanopore الأول يشير إلى الحالية على مستوى التشبع (أي ما لا نهاية). هو واضح معدل التفاعل من الدرجة الأولى ثابت ، يمكن تحديد أي من اله تناسب المنحنى التجريبية. ويمكن تفسير زيادة ك "باعتبارها أسرع معدل الامتصاص. نسبة أنا / I 0 ، وتسمى أيضا تشبع تطبيع الحالية ، هو رقم أبعاد بين 0 و 1. هذه المعلمة هي مقياس للشغل من قبل analytes كثف البروتين. لذا ، ينبغي أن تكون مرتبطة كل حالة متميزة التجريبية مع اثنين من معلمات الإخراج محددة أنا / 0 وأنا ك '.

تجدر الإشارة إلى أن تأثر واضح معدل الامتصاص من الدرجة الأولى الثوابت والتيارات تطبيع في الوقت الفعلي الذي يقضيه البروتينات داخل nanopores. هذه المرة يعتمد على تركيز من analytes البروتين في المرحلة المائية بالجملة 24. ولذلك ، وتصحيح إضافية من هذه الأرقام يجب أن تنفذ على أساس الوقت الفعلي الذي يقضيه البروتينات داخل nanopore الداخلية. نقترح قياس تواتر فاسر (إزفاء) الأحداث وضرب من قبل متوسط ​​مدة بقاء مثل هذه الأحداث. وهذا يعطي متوسط ​​الوقت المستهلك من البروتينات داخل nanopore الداخلية لكل وحدة زمنية.

يمكن تحديد سعر ثابت الامتزاز باستخدام مجموعة موازية من nanopores كذلك. حالما تصل إلى المستوى الحالي التشبع (I ∞) ، يجب أن يكون عكس التيار الكهربائي ، لذلك لا أكثر محاصرون في nanopores البروتينات. وسيرافق الامتزاز من البروتينات الفردية عن طريق تحوير الحالي سجلت نحو مزيد من القيم. وسيتم استخراج معدل ثابت ثم من ارتفاع في المستوى الحالي.

5.2 انجميور امتزاز ثابتة

امتصاص البروتين من analytes على أسطح غير العضوية من nanopores يعتمد على تركيز البروتين في المرحلة المائية. وقد تم بالفعل هذه الظاهرة لوحظت في مستوى واحد جزيء 13. إذا تمثل θ ق الحالي تشبع طبيعية (I / I 0) ، ثم يعطى عادة معادلة الأيسوثرم انجميور من التعبير التالي :

الرقم 5.2

حيث C هو تركيز البروتين في المرحلة المائية. α هو انجميور امتزاز ثابتة. هذه الزيادات المستمرة مع زيادة في الطاقة ملزمة من الامتزاز ومع انخفاض في درجات الحرارة. سيتم جمع نقاط البيانات θ توظيف قياسات موازية مع صفائف نفذت بتركيزات مختلفة من البروتين في المرحلة مائي. وينبغي تحليل البيانات في تركيبة مع تقنيات أخرى للتحقق من حجم ثابت الامتزاز انجميور المجهزة. بالإضافة ، قد تكون كاملة ذري الجزيئية ديناميات المحاكاة 25،26 تستخدم أيضا لمساعدة تفسيرات البيانات التجريبية التي حصل عليها.

عنوان "> 6. النتائج الممثل

والنتائج النموذجية الحالة الصلبة nanopores تكون على النحو التالي. ينبغي أن يكون فتح المسام الحالي مستقر للغاية ، كما يتضح في الشكل. 4A. وينبغي أن الخصائص I / الخامس من nanopore تكون خطية غاية في بوكل M 1 ، 10 فوسفات البوتاسيوم ، ودرجة الحموضة 7.4 ، كما يرى في الشكل. 2. والمنحدر من نوبة الخطي للمنحنى الأول / V توفير تصرف أحادي من nanopore. وتصرف له علاقة مباشرة مع قطر nanopore ويجب أن تطابق هذه المعادلة : معادلة الرقم حيث G هو تصرف من nanopore ، د هو قطرها ، ل هو طوله ، والموصلية σ هو من الحل في الغرفة 14. وينبغي لهذه القيمة المباراة في غضون 30 ٪. إذا كان صغيرا جدا ، ومن المرجح مسام الخاص لا المبللة. مع اضافة من البروتين ، وينبغي أن الأحداث السريعة تترتب على ذلك ، كما يرى في الشكل. 4B. البروتوكول الاضافيعين الامتزاز هو انخفاض طويلة الأمد الحالي كما هو معروض في الشكل. 4C. بعض البروتينات هي عطوب والخضوع للغاية التحول الهيكلي داخل المسام الداخلية. في هذه الحالة ، سيتم رافقت انخفاض الجهد الطويل الأمد عن التقلبات السريعة.

الشكل 1
الشكل 1. الحالة الصلبة nanopore ملفقة باستخدام F20 Tecnai S / TEM. تم حفر مسام في وضع الجذعية ليبلغ قطرها 20 نانومتر. لقد التقطت الصورة في وضع TEM مشرق الميدان. وكان نيتريد 30 نانومتر سميكة.

الشكل 2
الشكل 2. غرفة استخدمت للسكن واحد الحالة الصلبة في nanopore مقاوم النبض القياسات ألف غرفة) وشرائح السليكون مع نيتريد نافذة بذاتها (TEM الشبكة). هو حفر nanopore في نيتريد قبل التحميل. وتستخدم أحمر يا عصابات لتشكيل ليالي طيبةالخطوط الجوية الاثيوبية عن رقاقة ، الذي يفصل بين حمامات حل الأيونية. B) تخطيطي للغرفة توضح موضع الحمامات الحل وأقطاب فيما يتعلق nanopore.

الشكل 3
الشكل 3. النموذجية I / V للآثار الحالة الصلبة nanopores من أقطار مختلفة ، وتم نقل آثار واحدة قناة الكهربائية في بوكل M 1 ، 20 ملي تريس ، ودرجة الحموضة 8.5. تم حفر nanopores في 30 نانومتر نيتريد السيليكون سميكة. وسوف نلاحظ سمك نيتريد تؤثر على تصرف أحادي من nanopore.

الشكل 4
الشكل 4. المقاسة أحادية القناة الحالية واثار الكشف عن امتصاص البروتين. أ) تتبع قناة واحدة تبين الكهربائية الحالية مفتوحة لقطرها 10 نانومتر nanopore. B) الانحرافات الحالية تمثل تقسيم ألبومين المصل البقري (BSA) في جملةIOR من nanopore. C) من جيش صرب البوسنة الامتزاز على سطح نيتريد. كل آثار هي من نفس nanopore في بوكل M 1 ، 10 ملي فوسفات البوتاسيوم ، ودرجة الحموضة 7.4. وإمكانات تطبيقها عبر الغشاء +40 بالسيارات ، وكان جيش صرب البوسنة وأضاف إلى حمام الغرفة ترتكز على تركيز من 120 نانومتر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الامتزاز عفوية من البروتينات على السطوح الصلبة للدولة 27-29 أهمية أساسية في عدد من المجالات ، مثل تطبيقات biochip وتصميم فئة جديدة من المواد الحيوية هجينة وظيفية. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن البروتينات كثف إلى الحالة الصلبة السطوح لا تظهر التنقل الأفقي أو معدلات الامتزاز كبيرة ، وبالتالي يعتبر عموما البروتين الامتزاز عملية لا رجعة فيها وغير محدد 30-32. ويعتقد أن البروتين الامتزاز على السطوح الصلبة أن ذلك يعود إلى عدة عوامل ، بما في ذلك قوات كهرباء وماء بين الجانب سلاسل من البروتينات ومجموعات رد الفعل في واجهة الصلبة والسائلة 13.

وقد تم اكتشاف عملية امتصاص البروتين من قبل عدد من النهج ، مثل الكوارتز الكريستال microbalance 28،29 ، المجهر الإلكتروني ، ellipsometry 33،34 ، 35 التوسيم فلوري و 36 و مسطحص التداخل الاستقطاب (PPI) (37). وفي المقابل ، هذه المنهجية مجموعة واحدة وnanopore nanopore يعتمد على التغييرات على قناة واحدة للكشف الحالية التي تنتجها التفاعلات بين البروتينات واحد analytes والداخلية nanopore.

الخطوة الأكثر أهمية في تحقيق نتائج إيجابية هو ترطيب السليم للداخلية nanopore. وينبغي أن الخصائص المسام لا تلبي المواصفات التي تمت مناقشتها في المقطع النتائج ، فلا يجوز استخدام طرق عدة لحل المشاكل. الحصار الحالي قد عابرة التي تحدث من دون أي البروتينات في حل تشير إلى أن الغرفة الملوثة. ويمكن غسلها تفلون غرف مع البيرانا. وينبغي بذل PDMS غرف جديدة من قوالب نظيفة لكل تجربة. قد Nanopores مع أصغر من المتوقع أو تصرف غير الخطية الخصائص I / V تشير إلى أن التبول غير ناجحة. ويجوز للتطبيق وجيزة من الجهد العالي (~ 5V) تحسين الخصائص الكهربائية للnanopore.خلاف ذلك ، يجب غسلها مرة أخرى مع nanopore الحل البيرانا. حتى في أفضل الظروف ، وبعض nanopores تفشل الرطب بشكل صحيح. القدرة على الرطب nanopore يعتمد على أبعادها. كلا nanopores أرق نيتريد nanopores وقطرها أكبر من الأسهل الرطب من nanopores سمكا أو نيتريد nanopores أصغر القطر. لnanopores 20 نانومتر سميكة مع دائرة نصف قطرها 5 نانومتر معدل النجاح هو ما يقرب من 70 ٪ بعد الغسيل الأولى. ينبغي توخي الحذر في اختيار حجم nanopore لتحليلها الخاص ، منذ nanopores يجب أن تكون كبيرة بما يكفي لاستيعاب البروتين.

بروتوكول مناقشتها هنا لا ينطبق إلا على الامتزاز على سطح السيليكون نيتريد. ويمكن أيضا السطوح الأخرى ، مثل أكسيد السيليكون 9 أو 23 الألومينا يتم حفر باستخدام هذه التقنية ، ولكن يقتصر على عدد من الأفلام رقيقة قابلة لهذه التقنية لتلك التي يمكن تصنيعها بحيث تكون قائمة بذاتها ، رقيقة وخالية من الثقوب . للتغلب على هذه المشكلة ، الفصلويمكن استخدام طلاء emical من nanopore 23،38-40. آخر مقايضة تقنية nanopore واحد هو أنه يمكن أن ننظر فقط في جزيء واحد في وقت واحد. للتغلب على هذا القيد ، وقدمنا ​​بديلا من استخدام صفائف متوازي من الحالة الصلبة nanopores 41. القياسات الحالية مع صفائف nanopore توفير فرصة للحصول على المعلمات الحركية العيانية ، مثل واضح من الدرجة الأولى ثوابت معدل التفاعل الامتصاص والامتزاز. بالإضافة إلى ذلك ، فإن هذا النهج يسمح بتحديد انجميور امتزاز ثابتة. واحد الحد الفوري لهذه التقنية هو عدم قدرتها على جمع المعلومات عن أسطح مستوية واسعة. سيقوم المسبار قياسات فقط من البروتين الامتزاز داخل الأماكن المغلقة من المناطق الداخلية من nanopores الحالة الصلبة ملفقة. في كثير من الحالات ، هو تحد كبير للحصول على معلومات دقيقة عن هندسة والسطح الداخلي للnanopore. في الماضي ، وكان فحص البروتين الامتزاز على نطاق واسعد بواسطة microbalance الكريستال الكوارتز 28،29. ويرافق الامتزاز على سطح البروتين الكريستال من الملطف للحركة متذبذبة المفروضة من microbalance الكريستال ، مما ينتج عنه انخفاض في تواتر الرنانة. إجراء تغيير من الكتلة الاجمالية يقترن بسبب امتصاص البروتين يؤدي الى تحول تردد microbalance الكريستال الكوارتز. ويرتبط خطيا مجموع كتلة البروتين كثف إلى التحول تردد. هذا هو المبدأ الأساسي لهذه التقنية ، التي بروتين تحقيقات الامتزاز بطريقة غير مباشرة على سطح مستو واضحة المعالم. في المقابل ، فإن استخدام صفائف nanopore توظف تقنية مقاوم النبض مشابه بشكل وثيق لمواجهة نهج كولتر 42. مرة أخرى ، يمكن تحجيمها تقنية nanopore أسفل إلى عدد محدود من nanopores في غشاء ، بحيث يمكن أن يشاهد adsorptions الفردية في الوقت الحقيقي. على النقيض من الكريستال microbalance الكوارتز ، ويمكن للقياسات nanopore لا تقويم عملية الامتزاز على نطاق واسع وسطح مستو ، والتي يمكن أن تحدث أحداث إضافية (أي نشر من البروتينات كثف الوحشي) ، وبالتالي إنتاج تغييرات في انجميور الأيسوثرم الامتزاز. بطبيعة الحال ، فإنه من المستحسن أن تستخدم هذه الأساليب المكرسة لامتصاص البروتينات في تركيبة مع بعضها البعض ، لأنها التحقيق سوى بعض جوانب عملية الامتزاز. على سبيل المثال ، والزملاء العاملين بروير مزيج من الكريستال الكوارتز وmicrobalance تقنيات ζ الإمكانات لإظهار أن جيش صرب البوسنة ملزمة على جزيئات الذهب والسطوح الذهب يحدث عن طريق آلية كهرباء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أشكر جون Grazul (جامعة كورنيل) ، اندريه Marziali (جامعة كولومبيا البريطانية في فانكوفر) وفنسنت الطبرد - كوسا (جامعة أوتاوا) لنصائحهم. ويتم تمويل هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من مؤسسة العلوم الوطنية الأميركية (DMR - 0706517 و 1006332 DMR -) ، والمعاهد الوطنية للصحة (R01 - GM088403). تم تنفيذ حفر nanopore في مرفق المجهر الإلكتروني لمركز كورنيل للبحوث المواد (CCMR) بدعم من المؤسسة الوطنية للعلوم -- علوم المواد والهندسة مراكز البحوث (MRSEC) برنامج (DMR 0520404). تم تنفيذ إعداد الأغشية نيتريد السيليكون في مرفق كورنيل النانومترية الحجم ، وعضوا في شبكة تقنية النانو البنية التحتية الوطنية ، وهو مدعوم من قبل مؤسسة العلوم الوطنية (المنح ECS - 0335765).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tecnai F20 S/TEM FEI S/TEM requires acceleration voltage ≥200kV and field-emission source.
20 nm thick silicon nitride membrane window for TEM SPI Supplies 4163SN-BA
Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier Molecular Devices
Axon Digidata 1440A Molecular Devices
pCLAMP 10 software Molecular Devices Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software
Sulfuric Acid Fisher Scientific A300
hydrogen peroxide Fisher Scientific H325
silicone O-rings McMaster-Carr 003 S70 Alternatively use PDMS
silver wire Sigma-Aldrich 348759 For electrodes
SPC Technology, D sub contact, pin Newark Inc 9K4978 For electrodes
potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P2222
potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5379
PDMS Dow Corning Sylgar 184 Elastomer set. For making chamber.
Kwik-Cast Sealant World Precision Instruments, Inc. KWIK-CAST Fast acting silicone sealant
hot plate Fisher Scientific
Faraday cage

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, J. Ion-beam sculpting at nanometre length scales. Nature. 412, 166-169 (2001).
  2. Li, J., Gershow, M., Stein, D., Brandin, E., Golovchenko, J. A. DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope. Nat. Mater. 2, 611-615 (2003).
  3. Dekker, C. Solid-state nanopores. Nature. Nanotechnology. 2, 209-215 (2007).
  4. Branton, D. The potential and challenges of nanopore sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1146-1153 (2008).
  5. Wanunu, M., Morrison, W., Rabin, Y., Grosberg, A. Y., Meller, A. Electrostatic focusing of unlabelled DNA into nanoscale pores using a salt gradient. Nat. Nanotechnol. 5, 160-165 (2010).
  6. Peng, H., Ling, X. S. Reverse DNA translocation through a solid-state nanopore by magnetic tweezers. Nanotechnology. 20, 185101-185101 (2009).
  7. Talaga, D. S., Li, J. Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores. J. Am. Chem. Soc. 131, 9287-9297 (2009).
  8. Zhao, Q. Detecting SNPs using a synthetic nanopore. Nano. Lett. 7, 1680-1685 (2007).
  9. Storm, A. J., Chen, J. H., Ling, X. S., Zandbergen, H. W., Dekker, C. Fabrication of solid-state nanopores with single-nanometre precision. Nat. Mater. 2, 537-540 (2003).
  10. Sexton, L. T. Resistive-pulse studies of proteins and protein/antibody complexes using a conical nanotube sensor. J. Am. Chem. Soc. 129, 13144-13152 (2007).
  11. Martin, C. R., Siwy, Z. S. Chemistry. Learning nature's way: biosensing with synthetic nanopores. Science. 317, 331-332 (2007).
  12. Sexton, L. T. An adsorption-based model for pulse duration in resistive-pulse protein sensing. J. Am. Chem. Soc. 132, 6755-6763 (2010).
  13. Niedzwiecki, D. J., Grazul, J., Movileanu, L. Single-molecule observation of protein adsoption onto an inorganic surface. J. Am. Chem. Soc. 132, 10816-10822 (2010).
  14. Selvin, P. R., Ha, T. Single-molecule techniques: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 395-420 (2008).
  15. Han, A. Label-free detection of single protein molecules and protein-protein interactions using synthetic nanopores. Anal. Chem. 80, 4651-4658 (2008).
  16. Han, A. Sensing protein molecules using nanofabricated pores. Appl. Phys. Lett. 88, (2006).
  17. Fologea, D., Ledden, B., McNabb, D. S., Li, J. Electrical characterization of protein molecules by a solid-state nanopore. Appl. Phys. Lett. 91, (2007).
  18. Firnkes, M., Pedone, D., Knezevic, J., Doblinger, M., Rant, U. Electrically Facilitated Translocations of Proteins through Silicon Nitride Nanopores: Conjoint and Competitive Action of Diffusion, Electrophoresis, and Electroosmosis. Nano. Lett. (2010).
  19. Pedone, D., Firnkes, M., Rant, U. Data analysis of translocation events in nanopore experiments. Anal. Chem. 81, 9689-9694 (2009).
  20. Oukhaled, A. Dynamics of Completely Unfolded and Native Proteins through Solid-State Nanopores as a Function of Electric Driving Force. ACS. Nano.. (2011).
  21. Yusko, E. C. Controlling protein translocation through nanopores with bio-inspired fluid walls. Nat. Nanotechnol. 6, 253-260 (2011).
  22. Arafat, A., Schroen, K., de Smet, L. C., Sudholter, E. J., Zuilhof, H. Tailor-made functionalization of silicon nitride surfaces. J. Am. Chem. Soc. 126, 8600-8601 (2004).
  23. Wanunu, M., Meller, A. Chemically modified solid-state nanopores. Nano. Lett. 7, 1580-1585 (2007).
  24. Movileanu, L., Cheley, S., Bayley, H. Partitioning of individual flexible polymers into a nanoscopic protein pore. Biophys. J. 85, 897-910 (2003).
  25. Aksimentiev, A. Deciphering ionic current signatures of DNA transport through a nanopore. Nanoscale. 2, 468-483 (2010).
  26. Timp, W. Nanopore Sequencing: Electrical Measurements of the Code of Life. IEEE Trans. Nanotechnol. 9, 281-294 (2010).
  27. Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Surface tailoring for controlled protein adsorption: effect of topography at the nanometer scale and chemistry. J. Am. Chem. Soc. 128, 3939-3945 (2006).
  28. Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Interpretation of protein adsorption: surface-induced conformational changes. J. Am. Chem. Soc. 127, 8168-8173 (2005).
  29. Brewer, S. H., Glomm, W. R., Johnson, M. C., Knag, M. K., Franzen, S. Probing BSA binding to citrate-coated gold nanoparticles and surfaces. Langmuir. 21, 9303-9307 (2005).
  30. Schon, P., Gorlich, M., Coenen, M. J., Heus, H. A., Speller, S. Nonspecific protein adsorption at the single molecule level studied by atomic force microscopy. Langmuir. 23, 9921-9923 (2007).
  31. Rabe, M., Verdes, D., Zimmermann, J., Seeger, S. Surface organization and cooperativity during nonspecific protein adsorption events. J. Phys. Chem. B. 112, 13971-13980 (2008).
  32. Rabe, M., Verdes, D., Rankl, M., Artus, G. R., Seeger, S. A comprehensive study of concepts and phenomena of the nonspecific adsorption of beta-lactoglobulin. Chemphyschem. 8, 862-872 (2007).
  33. Micic, M., Chen, A., Leblanc, R. M., Moy, V. T. Scanning Electron Microscopy Studies of Protein-Functionalized Atomic Force Microscopy Cantilever Tips. Scanning. 21, 394-397 (1999).
  34. Grant, A. W., Hu, Q. H., Kasemo, B. Transmission electron microscopy 'windows' for nanofabricated structures. Nanotechnology. 15, 1175-1181 (2004).
  35. Giannoulis, C. S., Desai, T. A. Characterization of proteins and fibroblasts on thin inorganic films. J. Mater. Sci: Mater. Med. 13, 75-80 (2002).
  36. Gustavsson, J. Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensors applications. J. Mater. Sci: Mater. Med. 19, 1839-1850 (2008).
  37. Shirshov, Y. M. Analysis of the response of planar polarization interferometer to molecular layer formation: fibrinogen adsorption on silicon nitride surface. Biosens. Bioelectron. 16, 381-390 (2001).
  38. Chen, P. Atomic layer deposition to fine-tune the surface properties and diamters of fabricated nanopores. Nano. Lett. 4, 1333-1337 (2004).
  39. Siwy, Z. Protein biosensors based on biofunctionalized conical gold nanotubes. J. Am. Chem. Soc. 127, 5000-5001 (2005).
  40. Ding, S., Gao, C., Gu, L. Q. Capturing Single Molecules of Immunoglobulin and Ricin with an Aptamer-Encoded Glass Nanopore. Anal. Chem. (2009).
  41. Kim, M. -J., Wanunu, M., Bell, C. D., Meller, A. Rapid Fabrication of Uniform Size Nanopores and Nanopore Arrays for Parallel DNA Analysis. Adv. Mater. 18, 3149-3153 (2006).
  42. Bezrukov, S. M. Ion channels as molecular Coulter counters to probe metabolite transport. J. Membr. Biol. 174, 1-13 (2000).
رصد بروتين الامتزاز مع الحالة الصلبة Nanopores
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Niedzwiecki, D. J., Movileanu, L. Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores. J. Vis. Exp. (58), e3560, doi:10.3791/3560 (2011).More

Niedzwiecki, D. J., Movileanu, L. Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores. J. Vis. Exp. (58), e3560, doi:10.3791/3560 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter