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Bioengineering

고체 Nanopores와 모니터링 단백질 흡착

doi: 10.3791/3560 Published: December 2, 2011

Summary

무기 표면에 단백질이 아닌 구체적인 흡착을 모니터링하는 고체 nanopores를 사용하는 방법을 설명합니다. 방법은 실시간과 단일 분자 수준에서 탐색할 수 흡착 수있게 저항 펄스의 원칙을 사용합니다. 하나의 단백질 흡착 과정 멀리 평형에서이기 때문에, 우리는 양적 단백질 흡착의 상수 명백한 처음 주문 반응 속도의 결정뿐만 아니라 및 Langmuir 흡착 상수 사용, 합성 nanopores의 병렬 배열의 고용을 제안합니다.

Abstract

고체 nanopores은 지역 구조와 유연성 핵산 1-6, 단백질 7 전개, 그리고 다른 리간드 8 바인딩 선호도를 조사하는 단일 분자 수준에서 측정을 수행하는 데 사용되었습니다. 9-12 저항 펄스 기술로 이러한 nanopores을 결합함으로써, 그러한 측정은 다양한 조건 하에서와 라벨 3에 대한 필요없이 할 수 있습니다. 저항 펄스 기술에서는 이온 소금 솔루션은 nanopore의 양쪽에 도입입니다. 따라서, 이온은 지속적으로 현재의 결과, 적용 transmembrane 잠재력에 의해 챔버의 한쪽에서 다른 구동됩니다. nanopore에 analyte의 파티션은 단일 분자 정보를 추출하는 분석할 수이 현재에 잘 정의된 편향을 발생합니다. 이 기법을 사용하여 nanopore 벽에 단일 단백질의 흡착은 다양한 범위의 아래에 모니터할 수 있습니다조건 13. microfluidic 장치의 크기 축소로, 하나의 단백질과 함께 이러한 시스템의 상호 작용이 우려되고 있기 때문에 단백질 흡착은 중요성이 높아지고있다. 이 프로토콜은 쉽게 nanopore 드릴링 의무가 다른 박막, 또는 작용 질화 표면에 확장될 수 있습니다 질화물 필름에 바인딩 단백질에 대한 신속한 분석을 설명합니다. 단백질의 다양한 솔루션 및 denaturing 조건 하에서 광범위한 탐험 수 있습니다. 또한이 프로토콜은 nanopore 분광법을 사용하여보다 기본적인 문제를 탐구하는 데 사용할 수 있습니다.

Protocol

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1. 실리콘 질화물 점막에서 고체 nanopores의 제조

  1. 200 kV의 가속 전압에 황비홍 Tecnai F20 S / TEM을 가져와. 다른 S / TEM을 사용하는 경우, 가속 전압보다 크거나 200 kV 9이어야합니다
  2. TEM 샘플 홀더에 20 nm의 두꺼운 SPI 실리콘 질화물 창 그리드를로드하고 소유자로부터 오염 물질을 제거하는 30 초 동안 산소 플라즈마로 닦아주십시오.
  3. S / TEM에 샘플을로드하고 아래 펌프로 진공을위한 수 있습니다. S / TEM 진공로 펌핑되면 Ronchigram에서 밝은 사각형를 찾아 밝은 필드 TEM 모드에서 질화 윈도우를 찾으십시오. TEM이 제대로 정렬되어 있는지 확인 후, 정렬 및 샘플을 중점을두고 있습니다.
  4. 줄기 모드로 S / TEM을 전환합니다. 이미지 샘플를 HAADF (또는 이에 상응하는 금액) 검출기를 사용하여 제대로 정렬되어 있는지 확인하십시오.
  5. 낮은 값을 단색을 설정합니다. 단색의 낮은 가치 높은 curren를 허용시추에 사용할 전자 t. S / TEM은 단색이없는 경우이 단계를 무시합니다.
  6. nanopore를 시추에 적합한 장소 크기를 선택합니다. 이것은 전자 프로브의 직경에 해당합니다. 3 NM 프로브는 5 나노미터 직경 모공을 시추를 위해 잘 작동합니다. 큰 프로브 (5 NM)은 더 빨리 드릴과 큰 기공이 생성됩니다. 작은 프로브 (1 NM)은 작은 구멍을 뚫을하고 만드는 데 시간이 오래 걸립니다.
  7. 필요한 경우, 줄기 정렬을 조정하십시오.
  8. 질화 막에 초점 x1.3M의 확대로 가져와. 좋은 초점은 Ronchigram을 모니터링하여 수행할 수 있습니다.
  9. 샘플의 움직임이있다면, 안정화 샘플 때까지 기다립니다. 이것은 시간까지 걸릴 수 있습니다. 질화물을 손상하지 않는만큼 기다리는 동안 전자 빔을 빈.
  10. 샘플 전자 프로브를 장소와 드릴을 시작합니다.
  11. 주기적으로 HAADF 감지기로 스캔하여 샘플을 확인, 모두 nanopore이 dri를 받고 있는지 확인하기 위해lled (그것은 어두운 장소처럼 보이게합니다) 및 샘플에 대한 움직임이 없다는 것을 확인하십시오. 샘플이 약간 나타난다면, nanopore 이상이어야하는 전자 프로브의 위치를​​ 조정합니다.
  12. 기공이 형성되었을 때 식별할 수 Ronchigram 조심하세요. 때 초점, 질화물 필름은 반짝 이는 외관을하고 있습니다. 이 때 nanopore 양식을 사라집니다. 초점이 약간 Ronchigram을 주는게 하나가 nanopore과 관련된 프레 넬 무늬를 볼 수 있습니다.
  13. HAADF와 nanopore의 이미지를 가져가라.
  14. nanopore 이미지의 강도 프로파일을 마십시오. nanopore의 직경은 프로필의 어두운 지역에 따라 예상하실 수 있습니다.
  15. nanopore의 확대는 구멍의 가장자리를 따라 전자 프로브를 이동하여 수행할 수 있습니다.
  16. nanopore 원하는 직경되면, TEM 모드로 S / TEM을 넣어.
  17. 크기를 확인 밝은 필드 TEM을 사용하여 자사의 표준 설정 및 이미지 nanopore에 단색 가져와

2. 고체 nanopore의 젖음

  1. 1 M KCl, 10 MM의 칼륨 인산, 산도 7.4를 포함하는 데 가스 드 이온화 물. 이것은 진공에서 솔루션을 가하고 20 분 동안 목욕 sonicator에서 그들을 배치하여이 작업을 수행할 수 있습니다.
  2. 10 ML Pyrex의 비커에 nanopore 포함된 실리콘 질화물 칩을 놓습니다. 매우 섬세으로 질화물 창문을 깨지 않도록주의를 가져가라. 연기 후드의 열판에서 비커를 놓고 100 ° C.로 설정
  3. 좋은 치료를 사용하여 피라 솔루션 nanopore 칩을를 청소합니다. 먼저 유리 피펫을 사용하여 컨테이너 3 ML의 황산을 추가합니다. 다음, 신중하게 피라 솔루션 14하도록 황산 1 ML의 과산화수소를 추가합니다. 모든 예방 조치를하시기 바랍니다.
  4. nanopore 칩이 10 분 피라 솔루션에 흠뻑 젖어 수 있습니다.
  5. 유리 피펫을 사용하여 비커에서 피라 솔루션을 제거합니다. 적절한 스토리지 콘센트에 놓으십시오.
  6. Fi 인터넷 접속깨끗한 유리 피펫을 사용하여 드 - 기름, 드 이온화 물로 비커는거야. 빈 비커의 물을 최소한 5 번 반복합니다.
  7. 깨끗한 핀셋으로 nanopore 칩을 제거하고 빛을 흡입하여 건조
  8. 즉시, 챔버 (그림 2A, 2B)로 nanopore 칩을 밀봉. 칩은 O - 링이나 실리콘 밀봉제하여 챔버의 안전있을 수 있습니다.
  9. KCl 용액으로 챔버를 채우
  10. 챔버 (그림 2B)로 자세 / AgCl 전극을 연결합니다. 전극 밤새 표백에 실버 와이어를 몸으로 만든 수 있습니다.
  11. 전극에 걸쳐 transmembrane 잠재력을 적용하고 전압 클램프 모드에서 축삭 200B 패치 - 클램프 증폭기를 사용하여 현재 응답을 모니터링합니다.
  12. 측정에서 I / V (전류 전압) 커브를 만듭니다. 1 M KCl (그림 3)를 사용하면 I / V 곡선 높은 리니어해야합니다. nanopore의 전도성는 직경에 해당한다. nanopore가 표시되지 않는 경우선형 I / V 곡선, 전도성이 너무 낮은, 또는 nanopore의 오픈 현재는 (그림 4A) 안정 아니라, 그것은 nanopore 제대로 침수되지 않고 피라의 세척을 반복해야한다는 것을 의미합니다.

3. 모니터링 단백질 흡착

  1. 이것은 단백질 샘플을 부족 버퍼 조건과 전류를 모니터링하는 단일 nanopore 막 또는 nanopores의 병렬 배열 (아래 참조)로 제어 실험을 수행하기 위해 매우 중요합니다. 우리는 다음 두 단계를 권장합니다 (I) 고순도 수준 버퍼의 사용 (순결을> 99.9 %, 크로마 토그래피 - 학년 수준), 그리고 (ii) 상호 작용 고체 nanopore와 버퍼의 사용하지 않는 단일 채널 이벤트를 생산하고 있습니다. 또한, 우리는 표준 단백질 화학 절차를 사용하여 고순도의 단백질 샘플을 문의하시기 바랍니다. 단백질 시료의 순도는 나트륨 dodecyl 황산염 - polyacrylamide (SDS - PAGE) 겔 분석 및 고해상도 mA로 확인한다SS 분광법 15.
  2. 챔버의 접지 목욕으로 연구하려는 단백질의 정화 샘플을 추가합니다. 목욕을 통해 확산하는 샘플 시간을 허용합니다. 측정할 수있다 단백질의 전형적인 농도 μm의 범위 7,15-21에 NM의 수만 있습니다.
  3. 연구되고있는 단백질의 총 요금의 그 극성 맞은 transmembrane 잠재적인 전압 바이어스를 적용합니다. 예를 들어, BSA는 산도 7.4에서 효과 NET 부정적인 요금을 가지고 있으며, 따라서 긍정적인 전압 바이어스를 적용한다. 적용된 전압은 반대 세력에 의해 주도 될 맞은편 요금 nanopore 인테리어와 단백질 내의 잠재적인 그라데이션을 만듭니다. nanopore에 단백질을 차로 전압 극성은 측정 신호를 생성합니다.
  4. 200 MV의 진도의 적용 가능성은 대부분의 단백질 analytes을 관찰하기 위해 충분히 커야합니다. 이벤트 기준 (그림 4B)에서 과도 전류 deflections로 나타납니다.어떤 신호가 관찰되지 않은 경우, 챔버에있는 단백질의 농도를 증가시킵니다. 높은 전압 잡음 비율로 신호를 향상시킬 수 있습니다. 질화물 nanopores은 몇 볼트를 견딜 수 있습니다.
  5. 단백질 adsorptions은 nanopore (그림 4c) 현재 기준에서 오래 살았 변화로 나타납니다.

4. nanopores의 작용화 가능성

실리콘 질화물 22,23에 기능성 그룹을 적용하기위한 여러 가지 방법이 존재. 필요한 경우 대부분의 질화물 필름은 외부와 오존에 노출에 얇은 산화 층을하면 추가 산화물 레이어를 만들 수 있습니다. 다른 organosilanes는 같은 레이어에 사용하고 자기 조립하실 수 있습니다. 특히 관심 유기 표면 범위의 검사 수 있도록,자가 - 조립 및 (즉, 카르복실산 및 aldehydes) 추가로 수정할 수있는, aminosilane입니다. nanopore은 피라로 씻은과 chambe에 확보되고 나면R, 아민은 0.5 M TBACl (tetrabutylammonium) 및 용제로 사용되는 무수 MeOH (메탄올)의 지원 전해액으로 챔버 목욕에 직접 추가할 수 있습니다. Monolayer 형성은 400 MV 전압 바이어스와 전류 드롭 23 측정의 응용 프로그램에서 모니터링할 수 있습니다.

5. 명백한 처음 주문 반응 속도 상수의 결정 및 병렬 nanopore 배열을 사용하여 상수 Langmuir 흡착

흡수 및 탈착에 대한 5.1 명백한 첫번째 주문 반응 속도 상수

우리는이 방법론의 긍정적인 측면은 단일 분자 수준에서 개별 adsorptions를 관찰하는 능력이라고 강조. 무기 표면에 단백질 흡착의 단일 분자 측정은 고체 nanopores의 평행 배열을 채용하여 최대 크기를 조정하실 수 있습니다. nanopores의 병렬 배열 때문에 신뢰할 수있는 통계를 얻을 검정 많은 모공에 대한 필요가 필요합니다S. 이를 위해 nanopore 배열의 사용은 개인 adsorptions의 모니터링뿐만 아니라 추가 분석을 위해 여러 이벤트의 측정을 허용합니다. 실리콘 질화물의 nanopores의 배열은 단순히 예제에서는 여러 구멍을 드릴링하여 위의 프로토콜에 의해 형성 수 있습니다. 각 nanopore 비슷한 크기해야합니다. 좁은 또는 7X7의 nanopores의 배열은 충분한해야합니다. 챔버의 단백질 analyte의 추가되면, 현재는 다음과 같은 표정으로 기하 급수 방식으로 부패합니다

제가 T = I - (나 - 난 0) EXP (- K 'T)

여기, T, 실험 시간 t에서 전류를 나타냅니다. 저는 0 nanopore 배열을 통해 원래의 전류 전달합니다. 나는 (즉, 무한대) 포화 수준에서 현재를 나타냅니다. K '는 명백한 처음 주문 반응 속도입니다 상수, 어떤은 일에서 확인할 수 있습니다E는 실험 곡선 맞습니다. 큰 K '는 빠른 흡착 속도로 해석될 수있다. 비율 I / I 0도, 표준 채도 현재 전화를 0과 1 사이의 무차 번호입니다. 이 매개 변수는 adsorbed 단백질 analytes에 의해 인원을 측정하기위한 한 방법입니다. 따라서, 각각의 독특한 실험 조건은 두 개의 특정 출력 매개 변수 I / I 0 K '와 관련된한다.

이것은 명백한 첫 주문 흡착 속도 상수와 표준 해류가 nanopores 내에서 단백질에 의해 소비 효과적인 시간에 의해 영향을 언급해야합니다. 이번 대량 수성 단계 24 단백질 analytes의 농도에 따라 달라집니다. 따라서 이러한 숫자의 추가 보정 nanopore 인테리어 내의 단백질에 의해 소비를 효과적으로 시간에 따라 구현해야합니다. 우리는 FAS의 주파수를 측정하는 것이 좋습니다T (translocation) 행사와 평균하여 곱한 이러한 이벤트의 시간을 머물러. 이것은 단위 시간 당 nanopore 내부 내에서 동안 단백질의 평균 시간을 줄 것이다.

탈착의 상수 요금은뿐만 아니라 nanopores의 병렬 배열을 사용하여 결정하실 수 있습니다. 즉시 현재의 수준 채도를 (I ∞)에 도달로 전압이 반대한다, 더 이상 단백질이 nanopores에 갇혀되지 않습니다. 개별 단백질의 탈착은 큰 값으로 기록된 전류의 변화에​​ 의해 동반됩니다. 속도 상수는 다음 현재 수준에있는 상승에서 추출됩니다.

상수 5.2 Langmuir 흡착

nanopores의 무기 표면에 단백질 analytes의 흡수는 수성 단계에있는 단백질 농도에 따라 좌우됩니다. 이러한 현상은 이미 단일 분자 수준 13 관찰되었습니다. θ가 나타내는 경우 의 표준 포화 전류 (I I / 0), 다음 전형적인 Langmuir 등온 방정식은 다음과 같은 표현식에 의해 주어집니다 :

그림 5.2

C는 수성 단계에있는 단백질 농도입니다. α는 흡착은 Langmuir 상수입니다. 흡착의 바인딩 에너지의 증가와 온도의 감소와 함께이 지속적으로 증가합니다. θ 데이터 요소의 컬렉션은 수성 단계에서 다양한 단백질 농도에서 실시 병렬 배열로 측정을 채용합니다. 데이터가 장착되어 Langmuir 흡착 상수의 크기를 확인하는 다른 기술과 함께 분석해야합니다. 또한, 전체 원자의 분자 역학 시뮬레이션 25,26도 얻은 실험 데이터의 해석을하는 데 도움 수도 있습니다.

제목 "> 6. 대표 결과

고체 nanopores에 대한 일반적인 결과는 다음과 같은 것입니다. 열린 기공 전류는 그림에서 본대로, 매우 안정되어야합니다. 4A. nanopore의 I / V 특성은 1 M KCl로 그림에서 본 10 인산 칼륨, 산도 7.4에서 높은 리니어해야합니다. 2. I / V 곡선에 맞게 직선의 기울기는 nanopore의 하나의 전도성을 제공할 것입니다. 전도성은 nanopore 직경에 직접 관계를 가지고 있으며 방정식과 일치해야합니다 : 그림 방정식 , G는 nanopore의 전도성이고, D는 직경이며, 전의 길이이고, σ는 챔버 14 솔루션의 전도성입니다. 이 값은 30 % 이내로 일치해야합니다. 너무 작은 경우, 기공 가능성이 침수되지 않습니다. 단백질의 추가로 급속한 이벤트가 그림에서 본대로, 상황이 발생한다. 4B. 제자EIN 흡착은 그림에 표시되는 긴 현재 드롭됩니다. 4c. 어떤 단백질은 매우 불안 정한와 기공 내부 내의 구조적 변화를 받아야하고 있습니다. 이 경우 긴 전압 강하가 빠른 변동 동반됩니다.

그림 1
그림 1. Tecnai F20 S / TEM을 사용하여 가공 고체 nanopore. 기공 20 NM의 직경에 줄기 모드로 뚫고되었습니다. 이미지는 밝고 필드 TEM 모드에서 찍은 거예요. 질소는 30 nm의 두께가되었다.

그림 2
그림 2. 상공 회의소는 주택에 대한 저항 - 펄스 측정에서 하나의 고체 nanopore를 사용합니다.) 상공 회의소 및 무료 서 질화 창 (TEM 그리드)와 실리콘 칩. nanopore가로드되기 전에 질화로 뚫고있다. 레드 O - 링은 좋은의를 구성하는 데 사용됩니다이온 솔루션 두 가지 온천을 구분하는 칩에 대해 eal. nanopore에 관한 솔루션 욕조와 전극의 배치를 보여주는 챔버 B) 도식.

그림 3
그림 3. 다양한 직경의 고체 nanopores에 대한 일반적인 I / V 흔적이. 단일 채널 전기 트레이스가 1 M KCl, 20 MM 트리스, pH를 8.5에서 촬영되었습니다. Nanopores 30 NM 두꺼운 실리콘 질화물에서 뚫고 있었다. 참고 질화물 두께는 nanopore의 하나의 전도성에 영향을 미칠 것입니다.

그림 4
그림 4. 단일 채널 전류 성분과 단백질 흡착의 감지를 측정했습니다.) 10 나노미터 직경 nanopore의 오픈 현재를 보여주는 단일 채널 전기 추적. B) 현재 deflections은 남북으로 (BSA) 소 혈청 알부민의 파티션 대표nanopore의 ior. C) BSA의 흡착은 질화 표면에. 모든 흔적은 1 M KCl, 10 MM의 칼륨 인산, 산도 7.4 같은 nanopore에서 있습니다. 적용 transmembrane 잠재력은 40 뮤직 비디오했고 BSA 120 NM의 농도에 근거 챔버 목욕에 추가되었습니다.

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Discussion

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고체 표면에 27-29로 단백질의 자연 흡착는 biochip 응용 프로그램 및 기능 하이브리드의 biomaterials의 새로운 클래스의 디자인 분야의 숫자에 근본적으로 중요합니다. 이전 연구는 고체 표면에 adsorbed 단백질이 측면이나 이동성을 크게 탈착 속도를 표시하지 않는 것으로 나타났습니다, 따라서 단백질 흡착은 일반적으로 돌이킬 수와 특이 현상이 프로세스를 30-32로 간주됩니다. 고체 표면에 단백질 흡착은 고체 - 액체 인터페이스 13 단백질과 반응 그룹의 사이드 체인 간의 정전 기적 ​​및 소수성 세력 등 여러 가지 요인에 의한 것으로 생각됩니다.

단백질 흡착 과정은 이러한 석영 크리스탈 microbalance 28,29, 전자 현미경, 33,34 타원 편광 반사 측정법 35 형광 라벨링, 36 plana로 접근의 숫자에 의해 탐구되었다R의 편광 간섭 측정법 (PPI)가. 대조적으로 37이 단일 nanopore와 nanopore 배열 방법은 단일 단백질 analytes과 nanopore 인테리어 간의 상호 작용에 의해 만들어진 감지 단일 채널 전류 변화에 의존합니다.

긍정적인 결과를 달성에서 가장 중요한 단계는 nanopore 내부의 적절한 젖음입니다. 기공 특성이 결과 섹션에 나와있는 사양을 충족하지 경우, 여러 가지 문제 해결 방법을 사용할 수 있습니다. 용액에 단백질없이 발생하는 과도 전류 blockades은 챔버가 오염되어 나타낼 수 있습니다. 테플론 여왕님 피라와 함께 세탁 수 있습니다. PDMS 야근은 각 실험의 클린 금형 신선한하여야한다. 예상 전도성 또는 비선형 I / V 특성을보다 작은와 Nanopores는 젖음 실패 나타낼 수 있습니다. 고전압 (~ 5V)의 간단한 응용 프로그램은 nanopore의 전기적 특성을 향상시킬 수 있습니다.그렇지 않으면, nanopore는 피라 솔루션 다시 세탁해야합니다. 심지어 최고의 상황에서, 일부 nanopores 제대로 엿먹일 수 실패합니다. nanopore를 엿먹일 수있는 능력은 크기에 따라 다릅니다. 얇은 질화물 nanopores 및 큰 직경 nanopores 모두 두꺼운 질화물 nanopores 또는 작은 직경 nanopores보다 엿먹일 수 쉽습니다. 5 NM의 반경 20 nm의 두께 nanopores에 대한 성공률 먼저 세척 후 약 70 %입니다. nanopores은 단백질을 수용할 수 있도록 충분히 커야해야하므로주의하여 analyte위한 nanopore 크기를 선택하는 촬영한다.

프로토콜 여기서 설명하는 것은 실리콘 질화물 표면에 흡착에 적용됩니다. 이러한 실리콘 산화물 9 알루미나 23 같은 다른 표면에서도이 방법을 사용 뚫고있을 수 있습니다, 그러나이 기법 의무 박막의 숫자들은, 자유 서 얇고 구멍 무료입니다 있도록 제조 수 사람으로 제한됩니다 . 이 문제 채널을 극복nanopore의 emical 코팅이 23,38-40을 사용할 수 있습니다. 단일 nanopore 기법의 또 다른 무역 오프는 한 번에 한 분자에서 볼 수있다는 것입니다. 이 제한을 극복하기 위해, 우리는 고체 nanopores 41 병렬 배열을 사용하는 대안을 제공했다. nanopore 배열 전류 측정은 흡수와 탈착의 명백한 첫 주문 반응 속도 상수와 같은 매크로 운동 매개 변수를 얻을 수있는 기회를 제공합니다. 또한,이 방법은 Langmuir 흡착 상수의 결정을 허용합니다. 이 기법 중 하나는 즉각적인 한계가 평평하고 넓은 표면에 대한 정보를 수집하기 위해 못하는 것입니다. 측정은 가공 고체 nanopores의 내부의 밀폐된 공간 내에서 단백질 흡착을 조사합니다. 많은 경우에, 그것은 꽤 기하학과 nanopore의 내부 표면에 정확한 정보를 얻기 위해 도전합니다. 과거에는, 단백질 흡착이 광범위하게 검토했다석영 크리스탈 microbalance 28,29에 의해 개발. 크리스탈 표면에 단백질 흡착은 공진 주파수의 감소를 생산, 크리스탈 microbalance의 부과 oscillatory 운동의 댐퍼닝 동반됩니다. 단백질 흡착에 의한 총 결합 질량 변화는 석영 크리스탈 microbalance의 주파수 변화를 유도. 총 adsorbed 단백질 질량은 선형 주파수 변화에 관련되어 있습니다. 이것은이 기법, 잘 정의된 평평한 표면에 간접적으로 프로브 단백질 흡착의 기본 원칙입니다. 대조적으로, nanopore 배열의 사용은 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 카운터 접근 42 밀접하게 유사한 저항 펄스 기술을 사용합니다. 다시 nanopore 기술은 막에 nanopores 제한된 수의 크기를 줄일 수 있으므로 개별 adsorptions는 실시간으로 시청하실 수 있습니다. 석영 크리스탈 microbalance 대조적으로, nanopore 측정 엉덩이는 흡착 대규모의 프로세스와 수 없습니다추가 이벤트가 발생할 수있는 평평한 표면 (adsorbed 단백질 즉, 수평 확산)은 따라서 Langmuir 흡착 등온선의 변경을 생산. 물론, 그들이 흡착 과정의 일부 측면을 탐사 이후, 단백질 흡착하는데 최선을 다해 이러한 방식이 서로와 함께 사용되어야 바람직합니다. 예를 들어, 브루와 동료는 금 nanoparticles 및 금 표면에 바인딩 BSA는 정전 메커니즘을 통해 발생 보여주 석영 크리스탈 microbalance 및 ζ - 잠재적인 기술의 조합을 고용.

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Disclosures

우리는 공개 아무것도 없어.

Acknowledgments

저자들은 조언 존 Grazul (코넬 대학), 안드레 Marziali (밴쿠버에서 브리티시 컬럼비아 대학)와 빈센트 토바드 - Cossa을 (오타와 대학) 감사드립니다. 이 작품은 미국 국립 과학 재단 (DMR - 0706517와 DMR - 1006332)와 국립 보건원 (R01 - GM088403)에서 부여로 일부 자금이다. 재료 연구 과학 및 공학 센터 (MRSEC) 프로그램 (DMR 0520404) - nanopore 드릴링은 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 지원으로 재료 연구 코넬 센터 (CCMR)의 전자 현미경 시설에서 수행되었다. 실리콘 질화물 점막의 준비는 국립 과학 재단 (부여 항법 - 0335765)에서 지원하는 코넬 NanoScale 시설, 국립 나노기술 인프라 네트워크의 일원에서 실시되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tecnai F20 S/TEM FEI S/TEM requires acceleration voltage ≥200kV and field-emission source.
20 nm thick silicon nitride membrane window for TEM SPI Supplies 4163SN-BA
Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier Molecular Devices
Axon Digidata 1440A Molecular Devices
pCLAMP 10 software Molecular Devices Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software
Sulfuric Acid Fisher Scientific A300
hydrogen peroxide Fisher Scientific H325
silicone O-rings McMaster-Carr 003 S70 Alternatively use PDMS
silver wire Sigma-Aldrich 348759 For electrodes
SPC Technology, D sub contact, pin Newark Inc 9K4978 For electrodes
potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P2222
potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5379
PDMS Dow Corning Sylgar 184 Elastomer set. For making chamber.
Kwik-Cast Sealant World Precision Instruments, Inc. KWIK-CAST Fast acting silicone sealant
hot plate Fisher Scientific
Faraday cage

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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고체 Nanopores와 모니터링 단백질 흡착
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Niedzwiecki, D. J., Movileanu, L. Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores. J. Vis. Exp. (58), e3560, doi:10.3791/3560 (2011).More

Niedzwiecki, D. J., Movileanu, L. Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores. J. Vis. Exp. (58), e3560, doi:10.3791/3560 (2011).

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